全 文 ：高效液相色谱法同时测定水辣蓼提取物中
6种黄酮成分的含量
何立美1， 陈玉婷2， 刘洪梅2， 彭新宇2， 潘育方1， 袁明贵2， 罗胜军2， 魏光伟2
（1.广东药学院中药学院，广东 广州 510006；2.广东省农科院动物卫生研究所，广东 广州 510640）
摘 要：建立了同时定量检测水辣蓼中 6种黄酮类成分的高效液相色谱方法：选择 Waters Symmetry shield RP18
（4.6 mm×250 mm, 5.0 μm）色谱柱，流动相甲醇-0.4%甲酸水溶液（梯度洗脱），流速 1 mL/min，柱温 30℃，检测波长
359 nm，进样量 10 μL。结果表明，6种黄酮成分在 50 min内达到基线分离，在 0.1~20 μg/mL浓度范围内，6种黄酮成
分的线性相关系数 R2≥0.9995，平均加样回收率为 96.65%~99.54%，RSD 为 0.82%~1.38%（n=3）。 该方法准确、简便，
重复性好，可用于水辣蓼中芦丁、金丝桃苷、槲皮苷、槲皮素、异鼠李素和山奈酚的含量测定，为控制水辣蓼药材的质
量提供依据。
关键词：辣蓼； 黄酮； 高效液相色谱； 含量测定
中图分类号：S567.23+9 文献标识码：A 文章编号：1004-874X（2014）13-0094-05
Simultaneous determination of six kinds of flavonoid in extract
of Polygonum hydropiper L. by HPLC
HE Li-mei1，CHEN Yu-ting2，LIU Hong-mei2，PENG Xin-yu2，PAN Yu-fang1，
YUAN Ming-gui2，LUO Sheng-jun2，WEI Guang-wei2
（1.College of Traditional Chinese Medicine，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006， China；
2. Institute of Animal Health，Guangdong Academy of Agricultural Sciences，Guangzhou 510640， China）
Abstract：This paper established a method of quantitative detection for six kinds of flavonoid content in extract of
Polygonum hydropiper L. by high performance liquid chromatography (HPLC). The analysis was performed on a Waters
Symmetry shield RP18 (4.6 mm×250 mm, 5.0 μm) column. Mobile phase was methanol-0.4% formic acid aqueous solution
(gradient elution). The flow rate was set at 1.0 mL/min and the eluent was detected at 359 nm at 30℃. The calibration curves
of the six kinds of flavonoid were linear(R2>0.9995) over the concentration range of 0.1~20 μg/mL. The mean recoveries were
96.65% to 99.54%, RSD was 0.82%~1.38% (n=3). The results indicate that the method is accurate and simple, has good
repeatability, can apply to simultaneous determination of Rutin, Hyperoside, Quercitrin, Quercetin, Isorhamnetin and
Kaempferol in the extract of P. hydropiper L., to provide the basis for control the quality of P. hydropiper L.
Key words：Polygonum hydropiper L.； flavonoid； HPLC； content determination
水辣蓼为蓼科植物水辣蓼（Polygonum hydropiper
L.）的全草，别名柳草、蓼子草、斑蕉草、蝙蝠草等，全
草均可入药。 水辣蓼味辛、温 [1]，具有祛风利湿、散瘀
止痛、解毒消肿、杀虫止痒等功效，主要用于痢疾、肠
胃炎 、腹泻 、风湿关节痛 、跌打肿痛 、功能性子宫出
血，外用治毒蛇咬伤、皮肤湿疹等症状 [2]。水辣蓼主要
含有黄酮类 、挥发油类、倍半萜类、蒽醌类及蓼酸等
化合物 [3-6]，在《中华本草》中是以槲皮素为对照品，作
为水辣蓼的薄层对照进行鉴别 [7]。 研究表明，水辣蓼
具有抗炎、抗氧化、抗微生物、杀虫、抗肿瘤等多种生
物活性 [8-10]。
辣蓼在医药保健中的应用主要表现在抗微生物活
性、抗氧化作用及抗病毒作用，在植物农药上主要运
用辣蓼具有杀虫、抗食、驱避等活性作用，而在兽药方
面主要运用其根或全草治疗家畜腹泻、痢疾以及鱼病
收稿日期：2014-04-21
基金项目：国家公益性行业 （农业 ）科研专项 （201303040-
16）
作者简介：何立美（1989-），女，在读硕士生，E-mail：448177
350@qq.com
通讯作者：彭新宇（1967-），男，研究员，E-mail：p-xy@163.
com
广东农业科学 2014 年第 13期94
C M Y K
DOI:10.16768/j.issn.1004-874x.2014.13.041
等，均取得很好的疗效。 目前关于该药应用于兽药的
研究报道较少，而辣蓼黄酮的提取相比其他中药黄酮
的提取更具优势， 一方面辣蓼是一种很常见的植物，
分布广泛，资源较大，因而收购成本低廉；另一方面目
前其他中药黄酮的开发利用及其创造的经济效益己
接近饱和，这也为辣蓼黄酮的开发和应用提供了一个
契机。
黄酮类化合物是水辣蓼的主要有效成分。现代科
学研究表明， 黄酮类化合物的生理活性较为广泛，具
有生物抗氧化性、清除自由基作用、抗衰老、治疗心
脑血管疾病、降血脂、降血压、降血糖、镇痛、免疫、抗
炎、抗菌等药用保健功能 [11-14]。 黄酮的种类很多，各自
的功效也不尽相同，因此了解辣蓼中不同黄酮类有效
成分的含量能精确定位到不同的黄酮种类与疗效之
间的关系，有助于了解其与药效学之间的联系。 常用
于黄酮类化合物的分析方法有分光光度法、毛细管电
泳法、超临界流体色谱法 、薄层扫描法 、高效液相色
谱法等。 分光光度法是利用黄酮类化合物结构上的
酚羟基及其还原性基团能够与金属盐试剂形成有色
配合物原理进行测定， 其优点是设备价廉， 操作简
便，但样品未经分离纯化，受色素干扰较大，结果不
够精准，通常高于实际含量；毛细管电泳法具有速度
快，选择性高，分离效率高，进样体积小，溶剂消耗少
和抗污染能力强等优点，同时由于进样量少，因而制
备能力差 ，且毛细管直径小，使光路太短，用一些检
测方法（如紫外吸收光谱法）时，灵敏度较低，电渗会
因样品组成而变化，进而影响分离重现性；薄层扫描
法是样品经薄层层析分离后，直接在薄层扫描仪上选
定波长范围检测，得到薄层斑点的面积积分值，由回
归方程计算含量， 该法不受其他成分干扰， 方法简
便、准确 ，缺点是不够灵敏，对生物高分子的分离效
果不甚理想。
高效液相色谱法（HPLC）广泛用于合成化学、石油
化学、生命科学、临床化学、药物研究、环境监测、食品
检验及法学检验等领域[15-20]。在分析检验中，以 C18柱与
C8柱最为常用， 柱内填充粒径以 10、5 μm 最为常用。
其固液色谱法的原理是根据固定相对被测组分的吸附
力大小不同而进行分离。 分离过程是一个吸附-解吸附
的平衡过程，由于黄酮类化合物常带有酚羟基，在水中
会部分解离，而未解离的羟基与固定相作用较强，从而
导致拖尾现象， 所以黄酮类化合物的 HPLC 中需要加
入酸来调节 pH 值， 以抑制解离减少拖尾现象。 HPLC
法相对干扰少，分离效能高，灵敏度高，重现性好，测定
结果更为精确可靠，但仪器设备较贵，分析及维护成本
高。 目前采用高效液相色谱法同时检测 6 种黄酮类成
分还未见报道。 本研究采用 HPLC 同时测定辣蓼中的
芦丁、金丝桃苷、槲皮苷、槲皮素、异鼠李素、山奈酚 6
种黄酮类成分的含量， 为制定中药辣蓼的质量标准提
供了依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 仪器与试剂 Waters 高效液相色谱仪：2489 紫
外检测器，515 高压泵，717 自动进样器，996 二极管阵
列检测器，Waters Symmetryshield RP18 色谱柱；提取用
甲醇、甲酸、无水乙醇、95%乙醇均为分析纯；液相用甲
醇为色谱纯， 水为超纯水； 芦丁对照品： 色谱纯（≥
90.5%，中国食品药品鉴定研究院）；金丝桃苷、槲皮苷、
槲皮素、 山奈酚、 异鼠李素等对照品均为色谱纯（≥
98%，北京恒元启天化工技术研究院）
1.1.2 样品 辣蓼样品 7个，产地和批次分别为：1 号，
广东茂名，201302；2 号，广东广州，201309；3 号，广东
清远，201308；4 号，广西桂林，201303；5 号，广西玉林，
201304；6 号 ， 广西贺州 ，201305；7 号 ， 广西南宁 ，
201306。 经广东药学院李书渊教授鉴定，7 个样品均为
蓼科植物水辣蓼的全草。 样品经低温干燥后，用中药粉
碎机粉碎成粗粉，过 0.85 mm筛，备用。
1.2 试验方法
1.2.1 色谱条件 检测波长的确定： 二级管阵列检测
器的检测结果显示，芦丁、金丝桃苷、槲皮苷、槲皮素、
山奈酚、异鼠李素 6 种黄酮在 260、359 nm 附近有最大
吸收峰，260 nm 处干扰因素较多，359 nm 处更灵敏，且
均处于上述 6 个化合物的最大吸收波长范围之内，故
选择 359 nm为最适检测波长。
1.2.2 色谱分析 对照品的配制：精密称取芦丁、金丝
桃苷、槲皮苷、槲皮素、异鼠李素、山奈酚对照品各 10
mg 分别置于 10 mL 容量瓶中， 用甲醇定容到 10 mL，
摇匀，配置成 1 mg/mL 的储备液，备用。 分别取 6 种储
备液 0.5 mL 置于 25 mL 容量瓶中，得到 20.0 μg/mL 的
混合标准溶液， 再经多次稀释后得到 10.0、5.0、1.0、0.1
μg/mL的混合标准溶液。
供试品的制备： 取辣蓼粉末 2 g， 加 10 倍量的甲
醇，称重并记录数据，超声 40 min 后，称重并用甲醇补
足至先前重量，过滤，取续滤液备用。 在最适波长 359
nm 处使用高效液相色谱紫外检测器检测 ， 芦丁在
10.5~11.5 min 处洗脱获得， 金丝桃苷在 11.8~12.8 min
处洗脱获得， 槲皮苷在 16.5~17.5 min 处洗脱获得，槲
皮素在 30.5~31.5 min 处洗脱获得， 异鼠李素在 38.5~
39.5 min处洗脱获得， 山奈酚在 40.0~41.0 min 处洗脱
获得。
95
C M Y K
0.4%甲酸水溶液
（%）
55.0
45.0
45.0
30.0
55.0
甲醇
（%）
45.0
55.0
55.0
70.0
45.0
时间
（min）
0
15
20
45
50
表 1 洗脱梯度
异鼠李素
18.46
52.15
-
50.22
36.24
18.84
26.59
山奈酚
20.2
-
-
-
12.2
-
-
槲皮素
85.23
54.89
2809.6
64.04
32.66
154.9
81.80
槲皮苷
116.1
1215.7
581.8
389.8
201.1
230.5
155.1
金丝桃苷
503.5
232.2
666.8
79.41
43.24
110.63
190.2
芦丁
158.2
773.6
425.2
251.5
81.45
105.7
56.18
批次
201302
201309
201308
201303
201304
201305
201306
采集地
广东茂名
广东广州
广东清远
广西桂林
广西玉林
广西贺州
广西南宁
编号
1
2
3
4
5
6
7
表 2 辣蓼样品中 6 种黄酮含量测定结果 （μg/g）
注：“-”为未检测到该物质。
1000000
800000
600000
400000
200000
0
峰
面
积
0 4 8 12 16 20
浓度（μg/mL）
图 2 峰面积-浓度标准曲线
山奈酚
异鼠李素
槲皮素
金丝桃苷
槲皮苷
芦丁
2 结果与分析
2.1 色谱条件优选
根据样品的理论塔板数 、分离度 、保留时间 、峰
形等因素从 Agilent、SUPELCO 及 Waters 色谱柱中优
选出色谱条件。色谱柱：Waters Symmetryshield RP18
(4.6mm×250mm，5.0 μm ) Column；流动相 ：A 甲醇 ，
B0.4%甲酸水溶液（梯度洗脱，梯度见表 1）；流速 ：1
mL/min，柱温 ：30℃ ；检测波长 ：359 nm；进样量 ：10
μL。 在此条件下，各对照品与其他相邻组分色谱峰
的分离度较好。 对不同产地与批次间辣蓼样品进行
检测，结果（表 2）显示，6 种黄酮类成分含量相差很
大。
2.2 线性关系考察
芦丁、金丝桃苷、槲皮苷、槲皮素、异鼠李素、山奈
酚的 10 μg/mL 混合对照品的色谱图见图 1。从图 1 可
以看出，6 种对照品的图谱峰形都很好， 峰尖且锐，没
有前沿和拖尾现象，达到基线分离，因此可以同时采
用峰面积和峰高定量。 以峰面积为纵坐标，浓度为横
坐标 ，做线性回归 ，得到 6 种对照品的标准曲线 （图
2）。
峰面积-浓度线性关系如下：
芦丁：y=18449x+2208，R2=0.9995
金丝桃苷：y=25883x+1293.5，R2=1
槲皮苷：y=20592x+1611.4，R2=0.9998
槲皮素：y=35394x+0.5251，R2=1
山奈酚：y=40021x+302.75，R2=0.9999
异鼠李素：y=41012x+3483.3，R2=0.9998
以峰高为纵坐标，浓度为横坐标，做线性回归，得
0.020
0.015
0.010
0.005
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
时间（min）
图 1 10 ug/mL 混合对照品的色谱图
AU
芦
丁
金
丝
桃
苷
槲
皮
苷 槲
皮
素
异
鼠
李
素
山
奈
酚
96
C M Y K
RSD
(%)
1.19
平均回
收率(%)
98.99
回收率
(%)
99.41
100.88
98.13
98.29
98.22
测得量
（mg）
1.9252
1.9404
1.9158
1.9147
1.9174
样品中芦丁
的含量（mg）
0.9311
0.9316
0.9345
0.9318
0.9352
样品量
（g）
0.9982
0.9987
1.0018
0.9990
1.0026
编号
1
2
3
4
5
表 5 辣蓼中芦丁回收率测定结果
50000
40000
30000
20000
10000
0
峰
高
0 5 10 15 20
浓度（μg/mL）
图 3 峰高-浓度标准曲线图
山奈酚
异鼠李素
槲皮素
金丝桃苷
槲皮苷
芦丁
平均 RSD
（%）
1.11
RSD
（%）
1.06
0.91
0.99
1.48
0.88
1.36
6
19457
29730
22532
37886
42112
43679
5
19820
29949
22443
36888
41803
43673
4
19356
29560
23057
38176
41990
43736
3
19270
29309
22790
37722
42737
44034
2
19299
29883
22712
37995
42252
43971
1
19567
30029
22892
38562
42659
42421
对照品
芦丁
金丝桃苷
槲皮苷
槲皮素
山奈酚
异鼠李素
表 3 1 μg/mL 混合对照品日内精密度
峰面积
平均 RSD
（%）
1.05
RSD
（%）
0.94
1.40
1.21
0.93
0.84
0.95
3
356722
528340
420323
718990
813467
835790
2
351969
534289
411417
720061
804686
829359
1
358439
519570
411889
708041
800198
820099
对照品
芦丁
金丝桃苷
槲皮苷
槲皮素
山奈酚
异鼠李素
表 4 20 μg/mL 混合对照品日间精密度
日平均峰面积
到 6种对照品的标准曲线（图 3）。
峰高-浓度线性关系如下：
芦丁：y=770.47x+86.992，R2=0.9996
金丝桃苷：y=1197.4x+83.509，R2=1
槲皮苷：y=959.05x+92.694，R2=0.9998
槲皮素：y=1517.3x-42.411，R2=0.9999
山奈酚 y=2072.1x-25.497，R2=1
异鼠李素：y=2115.7x+113.18，R2=0.9999
峰面积、 峰高标准曲线图均表明 6 种对照品在
0.1~20.0 μg/mL范围内线性关系良好。
2.3 方法学考察
2.3.1 精密度试验 （1）日内精密度：取“线性关系”
项下 1 μg/mL 的混合对照品溶液，于同一天连续进样
6 针， 计算峰面积的变异系数 RSD 来考察日内精密
度，结果平均 RSD 值为 1.11%，表明日内精密度良好
（表3）。
（2）日间精密度：取“线性关系”项下 20 μg/mL 的
对照品溶液连续 3 d每天进样 3针，计算峰面积的变异
系数 RSD 来考察日间精密度 。 结果平均 RSD 值为
1.05%，表明日间精密度良好（表 4）。 日内及日间精密
度试验结果表明仪器的精密度良好。
2.3.2 稳定性试验 取同一供试品溶液于 0、2、4、6，8、
10 h 各进样 1 次 ， 测定峰面积分别为 1156897、
1190690、1138553、1155389、1198868、1159789，RSD 值
为 1.98%（n=3），表明样品在 10 h内稳定性良好。
2.3.3 加样回收率试验 精密称取 5 份已知含量的
辣蓼粉末 1.00 g，每份分别加入芦丁 1 mg、金丝桃苷
0.5 mg、 槲皮苷 0.17 mg、 槲皮素 0.5 mg、 异鼠李素
0.05 mg、山奈酚 0.5 mg，按“线性关系”项下的操作进
行提取。 回收率（%）=（实测值-供试品所含被测成分
量）/加入对照品量×100。结果（表 5~表 10）表明，平均
加样回收率试验 RSD 值为 96.65%~99.54%， 均符合
要求。
3 结论与讨论
本试验用 20%、40%、60%、80%甲醇以及纯甲醇、
纯水、60%乙醇对辣蓼进行提取， 结果表明 60%乙醇、
纯甲醇的提取效率较优，纯水以及 20%、40%、60%甲醇
97
C M Y K
RSD
(%)
0.99
平均回
收率(%)
98.14
回收率
(%)
99.37
97.30
97.01
98.36
98.64
测得量
（mg）
1.0471
1.0370
1.0373
1.0425
1.0459
样品中槲皮素
的含量（mg）
0.5503
0.5505
0.5523
0.5507
0.5527
样品量
（g）
0.9982
0.9987
1.0018
0.9990
1.0026
编号
1
2
3
4
5
表 8 辣蓼中槲皮素回收率测定结果
RSD
(%)
1.38
平均回
收率(%)
96.65
回收率
(%)
97.46
95.33
96.39
98.50
95.55
测得量
（mg）
0.1006
0.0995
0.1003
0.1011
0.0998
样品中异鼠李
素的含量（mg）
0.0519
0.0519
0.0521
0.0519
0.0521
样品量
(g)
0.9982
0.9987
1.0018
0.9990
1.0026
编号
1
2
3
4
5
表 9 辣蓼中异鼠李素回收率测定结果
RSD
(%)
1.36
平均回
收率(%)
98.66
回收率
(%)
97.39
97.43
98.37
100.20
99.93
测得量
（mg）
0.9425
0.9429
0.9490
0.9569
0.9572
样品中山奈
酚的含量（mg）
0.4556
0.4558
0.4572
0.4559
0.4576
样品量
(g)
0.9982
0.9987
1.0018
0.9990
1.0026
编号
1
2
3
4
5
表 10 辣蓼中山奈酚回收率测定结果
RSD
(%)
0.82
平均回
收率(%)
99.54
回收率
(%)
98.38
99.25
99.58
100.59
99.89
测得量
（mg）
0.9930
0.9976
1.0009
1.0045
1.0028
样品中金丝桃苷
的含量（mg）
0.5011
0.5014
0.5030
0.5016
0.5034
样品量
（g）
0.9982
0.9987
1.0018
0.9990
1.0026
编号
1
2
3
4
5
表 6 辣蓼中金丝桃苷回收率测定结果
RSD
(%)
1.11
平均回
收率(%)
98.99
回收率
(%)
98.03
100.41
98.96
97.83
99.72
测得量
（mg）
0.3407
0.3448
0.3430
0.3406
0.3444
样品中槲皮
苷的含量（mg）
0.1741
0.1742
0.1748
0.1743
0.1749
样品量
（g）
0.9982
0.9987
1.0018
0.9990
1.0026
编号
1
2
3
4
5
表 7 辣蓼中槲皮苷回收率测定结果
对槲皮素、山奈酚、异鼠李素提取效率不佳。 本试验还
就超声时间、超声次数进行了探索，在超声时间为 20、
30、40 min，提取次数为 1、2、3 次间优选，提取 3 次、每
次 30 min为最佳提取工艺。
本试验利用紫外和高效液相色谱测定了产地和
采摘月份不同的 7 种辣蓼样品，结果显示芦丁、金丝
桃苷、槲皮苷、槲皮素、异鼠李素、山奈酚等 6 种物质
在不同辣蓼中含量差异很大。 辣蓼中主要含有芦丁、
金丝桃苷和槲皮素 3 种黄酮， 产地和采摘月份不同，
会影响其在药材中的含量；而山奈酚、异鼠李素含量
较低，个别产地甚至检测不到相关成分；槲皮素含量
差异最为显著，其中广东清远的辣蓼中槲皮素明显高
于其他产地。 说明不同产地和不同采摘月份的原材
料对试验的影响较大，本试验选择了已有样品中总黄
酮含量最高的辣蓼， 即采集地为广东茂名， 批次为
201302。 另外在处理辣蓼样品时采取整根粉碎过
0.85 mm 筛取样的方法，而且每批样品测定 5 次后取
平均值，保证了取样的均衡性，使得到的数据更加可
靠。
辣蓼药用资源丰富，为民间常用中草药，然而辣蓼
的产地与采摘月份对其有效成分的含量影响显著，这
就需要一个合适的质量标准来规范辣蓼药材的品质。
本试验测定了辣蓼中 6 种黄酮类成分的含量， 可严格
控制辣蓼的质量。 黄酮类成分具有镇痛、消炎、抗氧化、
抗肿瘤等多种生物活性，但黄酮类物质种类繁多，且不
同的黄酮类成分具有的生物活性不同， 治疗的疾病也
不同， 本试验结果有助于规范芦丁等 6 种黄酮成分对
药效的影响，可得到相应的量效关系。 除原材料外，本
试验方法对辣蓼相关的成品、 半成品等的质量控制也
很有意义。
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