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南方红豆杉多糖的含量测定
及体外降血糖活性研究
汤 彬，薛 平，李 祥* ，陈建伟，邱海龙，张奉苏
(南京中医药大学药学院，江苏南京 210046)
摘 要:采用水提醇沉法提取南方红豆杉多糖，硫酸－苯酚法测定多糖含量;采用 HepG2 细胞和 α－葡萄糖苷酶作为体
外受体模型，研究南方红豆杉多糖的降血糖效果。结果表明:南方红豆杉药材中多糖的含量为 1.75%，无水葡萄糖在
1.507～13.563μg /mL内呈良好线性关系，平均回收率 97.54%，ＲSD为 1.60%;以二甲双胍和阿卡波糖作为阳性药，南方
红豆杉粗多糖对胰岛素抵抗 HepG2 细胞的葡萄糖消耗具有促进作用，对 α－葡萄糖苷酶具有较好的抑制活性，粗多糖
抑制活性(IC50 38.61mg /L)明显高于阳性对照药(IC50 1081.41mg /L) ，且呈现剂量依赖性。
关键词:南方红豆杉多糖，含量测定，胰岛素抵抗，α－葡萄糖苷酶，降血糖
Study on the determination and hypoglycemic activity in vitro
of Taxus chinensis var.m aireipolysaccharide
TANG Bin，XUE Ping，LI Xiang* ，CHEN Jian－wei，QIU Hai－ long，ZHANG Feng－su
(College of Pharmacy，Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210046，China)
Abstract:The polysaccharide of Taxus chinensis var. m a reiwas extracted by hot water，the content of
polysaccharide was determined by phenol－ sulfuric acid method;the HepG2 cells and alpha－ glucosidase were
used as receptor model to study the hypoglycemic activity in vitroof Taxus chinensis var.m aireipolysaccharide.
The results showed that the average content of polysaccharide from the branches and leaves of Taxus chinensis
varm aireiwas 1.75% .When the linear range of anhydrous glucose was 1.507 to 13.563μg /mL，there was a good
linear relationship.The average rate of recovery was 97.54%，ＲSD was 1.60% .Using Metformin and Acarbose as the
positive drug，crude polysaccharides from Taxus chinensis var.m aireicould improve the glucose consumption of
insulin－ resistance HepG2 cells，it(IC50 38.61mg /L)showed higher inhibitory activity to alpha－ glucosidase than
Acarbose(IC50 1081.41 mg /L).And it showed dose dependent for the inhibitory activity.
Key words:Taxus chinensis var.m aireipolysaccharide;determination;insulin resistance;α － glucosidase;
hypoglycemia
中图分类号:TS201.2 文献标识码:A 文 章 编 号:1002－0306(2013)09－0128－05
收稿日期:2012－10－22 * 通讯联系人
作者简介:汤彬(1987－) ，男，在读硕士研究生，主要从事中药活性物
质基础研究。
基金项目:江苏高校优势学科建设工程资助项目(ysxk－2010) ;2011 年
江苏省普通高校研究生科技创新计划(794)。
南方红豆杉别名美丽红豆杉、红榧、红叶水杉、
海罗松、矮杉，是中国所特有的红豆杉科红豆杉属植
物。国家Ⅰ级重点保护野生植物，其幼嫩枝叶和种
子都可作药用。药用南方红豆杉幼嫩枝叶，性味苦，
平;民间也有用于治疗糖尿病［1］。《中药大辞典》、《本
草纲目》、《中华药海》中记载:红豆杉有利尿、通经、降
血脂作用，对肾病、恶性肿瘤、高血压、高血脂症、糖尿
病有独特疗效。近些年对红豆杉资源的利用主要集中
在紫杉烷类物质上，对其中其他类活性成分如黄酮类、
木质素类、糖苷类、酚酸类和多糖等［2－4］研究很少。近
年来，大量研究表明，多糖除了有增强免疫力、抗肿瘤、
抗氧化、抗衰老、消化系统保护作用的生物学活性外，
还有抗菌、抗病毒、降血糖、降血脂、抗辐射、抗凝血等
作用［5－7］。东北红豆杉多糖具有降血糖活性［8］，而对南
方红豆杉多糖的研究很少。本文对南方红豆杉枝叶中
活性多糖进行了含量测定，并以 HepG2 细胞和 α－葡
萄糖苷酶作为体外受体模型，对其体外降血糖活性做
了初步的研究，为后续研究其体内降血糖及作用机制
提供一定的研究基础和依据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
南方红豆杉枝叶 购于无锡红豆集团南方红豆
杉种植基地，药材经本院陈建伟教授鉴定为红豆杉
科南方红豆杉 Taxus chinensis var.mairei，饮片标本现
保存于本校药学院中药化学实验室;葡萄糖对照品、
95%乙醇、无水乙醇、丙酮、乙醚、氯仿、正丁醇、浓硫
酸等其他试剂 国产分析纯;HepG2 细胞 南京中
医药大学药学院;含酚红 DMEM 高糖培养基 Gibco
129
公司;胎牛血清 杭州四季青生物工程材料有限公
司;四甲基偶氮唑盐(MTT) Sigma 公司;盐酸二甲
双胍 上海衡山药业有限公司;葡萄糖测定试剂
盒 南京建成生物工程研究所;胰岛素 江苏万邦
生化医药股份有限公司;超纯水。
紫外可见分光光度计 上海光谱仪器有限公
司;超净工作台 苏州净化设备有限公司;酶标
仪 美国BioTek 公司;倒置相差显微镜 日本
OLYMPUS公司;CO2 培养箱 日本三洋(SANYO)公
司;超纯纯水仪 南京易普易达科技发展有限公司;
美国 Corning－Coastar 细胞培养瓶、细胞培养板 上
海艾研生物科技有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 南方红豆杉粗多糖的提取 称取干燥的红豆
杉枝叶适量，打粉过 10 目筛，混合均匀，第一次加 8
倍量的水，提取 2h，第二次加 6 倍量的水，提取 1h，两
次提取液合并，3000r /min 离心，保留上清液，减压浓
缩，浓缩液加入 95%乙醇至体积分数为 80%，充分搅
拌后静置 24h，3000r /min 离心 15min，弃去滤液。将
所得沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙醚多次洗涤，
30℃真空干燥，即得南方红豆杉粗多糖。
1.2.2 南方红豆杉多糖的含量测定
1.2.2.1 标准溶液的配制 精密称取 105℃干燥至恒
重的葡萄糖标准品 10.55mg，加适量水溶解，转移至
100mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀，得到 0.1055mg /mL
葡萄糖标准溶液，备用。
1.2.2.2 苯酚溶液的制备 称取重蒸苯酚 5.0g，加适
量水溶解，转移至 100mL 棕色容量瓶中，加水至刻
度，摇匀，得到 5%苯酚溶液，备用。
1.2.2.3 供试品溶液的制备 精密称取南方红豆杉
多糖粉末 16.68mg，加适量水溶解，室温下超声
15min，转移至 100mL容量瓶中，定容，作为供试品溶
液，备用。
1.2.2.4 标准曲线的绘制 精密吸取葡萄糖标准溶
液 0.1、0.2、0.4、0.5、0.7、0.8、0.9mL 置于 10mL 具塞试
管中，分别加水补齐至 1.0mL，取超纯水 1.0mL 作为
空白对照，加入 5%苯酚溶液 1.0mL 充分混合后，迅
速加入浓硫酸 5.0mL，充分混合，室温放置 5min 后置
沸水中反应 15min。取出并迅速插入冰水浴放置
10min，于 489nm处测定吸收度。以葡萄糖标准溶液
的浓度(μg /mL)为横坐标，吸光度 A 为纵坐标，绘制
标准曲线。
1.2.2.5 南方红豆杉药材中多糖的含量测定 精密
吸取供试品溶液 1.0mL置于 10mL 具塞试管中，取超
纯水 1.0mL作为空白对照，按“1.2.2.4”下方法测定，
计算南方红豆杉药材中多糖的含量。多糖含量(%)
=(CDVW ×103)/m × 100%，式中:C 为供试品溶液
中葡萄糖的浓度(μg /mL) ，D为稀释倍数，V为供试
品溶液的体积(mL) ，W 为药材中粗多糖的得率，m
为供试品的质量(mg)。
1.2.3 南方红豆杉粗多糖的体外降血糖活性的测定
1.2.3.1 HepG2 细胞体外受体模型 HepG2 细胞的
培养:HepG2 细胞复苏后采用含 10% 胎牛血清的
DMEM高糖培养基置于 37℃、5% CO2 培养箱培养，
待贴壁长满后，用 0.25%胰蛋白酶消化，每 3d 1∶3 传
代一次，选取对数生长期细胞进行实验。
胰岛素抵抗 HepG2 细胞模型的葡萄糖消耗实验
及 MTT实验:按文献方法［9－10］稍作改进，将处于对数
生长期的细胞消化后，用含 10%胎牛血清的 DMEM
高糖培养基调整细胞密度为 5 × 104 个 /mL，接种于
96孔培养板中，每孔 100μL细胞悬液。本实验设正常
对照组、模型组、二甲双胍组(终剂量为 10 －3 mol /L)、
南方红豆杉粗多糖组(终剂量分别为 0.5、0.1、0.05、
0.01、0.005mg /mL)。待细胞单层贴壁后，模型组更
换新配制的含有胰岛素浓度为 5 × 10 －7 mol /L 的
DMEM高糖培养基，于 37℃、5% CO2 培养箱中孵育
24h，以造成胰岛素抵抗细胞模型。弃去培养基，给
药组加入不同浓度的不含血清的含药培养基，正常
对照组及模型组则加入不含血清的培养基，各组均
包括含生理胰岛素组与不含生理胰岛素组。于
37℃、5% CO2 培养箱中孵育 24h 后，用葡萄糖临床
试剂盒检测培养基中的葡萄糖含量，计算各组细胞
的葡萄糖消耗量。
葡萄糖消耗实验结束后，每孔加入 5g /LMTT 溶
液 20μL，于 37℃、5% CO2 培养箱中继续培养，4h 后
终止培养，小心吸弃孔中的培养基，每孔加入
150μLDMSO，振荡器振荡 10min，使结晶物充分溶解。
在酶标仪 490nm 波长下测定各孔的吸光度值，以检
测细胞的数目与活力。
1.2.3.2 α－葡萄糖苷酶体外受体模型 南方红豆杉
粗多糖对 α －葡萄糖苷酶的抑制作用:参考文献
［11 －12］的反应体系，96 孔板上加磷酸钾缓冲液
(pH6.8)110μL，再加入 0.2U /mLα － 葡萄糖苷酶
20μL，10μL样品溶液，混匀，37℃恒温 15min 后，加
入 2.5mmol /L PNPG 20μL，混匀后 37℃ 恒温反应
15min。最后加入 80μL 0.2mol /L的 Na2CO3 溶液，于
405nm波长下测 OD值。
以阿卡波糖(Acarbose)为阳性对照，同时设定对
照组(缓冲液 +酶液 +底物) ，空白组对照组(缓冲
液) ，样品测定组(样品 +酶液 +底物) ，样品对照组
(样品 + 缓冲液) ，阳性对照组(Acarbose + 酶液 +
底物。
酶活性抑制率 = {1 －(A样品 － A样品对照)/(A对照 －
A空白) }× 100
2 结果与分析
2.1 标准曲线的绘制
根据葡萄糖标准溶液的浓度和吸光度的线性关
系，可以建立标准曲线，并求出回归方程。结果表明
葡萄糖标准溶液在 1.507～13.563μg /mL 内呈良好线
性关系(见图 1)。南方红豆杉药材中多糖的含量测
定结果为 1.75%。
2.2 方法学考察
2.2.1 精密度实验 精密吸取供试品溶液 1.0mL 置
于 10mL具塞试管中，取超纯水 1.0mL 作为空白对
照，按“1.2.2.4”下方法测定，连续 6 次测定的实验结
果显示，ＲSD为 1.71%，表明该方法具有良好的精确
130
表 1 精密度实验
Table 1 Precision of the measured results
1 2 3 4 5 6 ＲSD(%)
吸光度 A 0.463 0.4455 0.445 0.4445 0.444 0.443 1.71
表 2 稳定性实验
Table 2 Stability of the measured results
时间(min) 0 5 10 15 30 60 90 120 ＲSD(%)
吸光度 A 0.448 0.444 0.443 0.445 0.445 0.445 0.442 0.441 0.49
表 3 重现性实验
Table 3 Ｒeproducibility of the measured results
1 2 3 4 5 平均值 ＲSD(%)
药材中多糖含量(%) 1.79 1.77 1.73 1.74 1.74 1.75 1.35
表 4 加样回收率实验
Table 4 Ｒecovery rate of the measured results
样品体积
(mL)
对照品加入
体积(mL)
样品含量
(μg)
对照品加入量
(μg)
测得量
(μg)
回收率
(%)
平均回收率
(%)
ＲSD
(%)
0.4
0.2
0.2
0.2
0.4
0.4
0.4
0.6
0.6
0.6
20.38
21.1
21.1
21.1
42.2
42.2
42.2
63.3
63.3
63.3
41.53
40.97
40.17
61.42
61.88
60.63
79.60
80.40
81.19
100.12
98.77
96.84
98.15
98.88
96.88
95.12
96.08
97.02
97.54 1.60
图 1 葡萄糖溶液的标准曲线图
Fig.1 Standard curve of glucose standard solution
度(见表 1)。
2.2.2 稳定性实验 精密吸取供试品溶液 1.0mL 置
于 10mL具塞试管中，取超纯水 1.0mL 作为空白对
照，按“1.2.2.4”下方法测定，在反应结束后 0、5、10、
15、30、60、90、120min 测定的实验结果显示，供试品
溶液在 2h之内保持稳定(见表 2)。
2.2.3 重复性实验 称取同一批次干燥的南方红豆
杉枝叶 5 份，按“1.2.2.3”和“1.2.2.4”下方法进行操
作，考察实验方法的重现性。结果显示，ＲSD 为
1.35%，表明该方法重现性较好(见表 3)。
2.2.4 加样回收率实验 精密吸取供试品溶液
0.4mL置于 10mL具塞试管中，共 9 份，依次加入葡萄
糖标准溶液 0.2、0.4、0.6mL，并添加水使终体积为
1.0mL，取超纯水 1.0mL作为空白对照，按“1.2.2.4”下
方法测定，考察加样回收率。结果显示，平均加样回
收率为 97.54%，ＲSD为 1.60%(表 4) ，表明该方法具
有良好的准确度。
2.3 南方红豆杉粗多糖的体外降血糖活性
2.3.1 南方红豆杉粗多糖对胰岛素抵抗 HepG2 细胞
葡萄糖消耗的影响 南方红豆杉粗多糖对胰岛素抵
抗 HepG2 细胞葡萄糖消耗的影响见表 5。
从表 5 数据得出，南方红豆杉粗多糖对胰岛素
抵抗 HepG2 细胞的葡萄糖消耗具有促进作用，当给
药浓度为 0.05mg /mL时，效果最佳。同时，MTT结果
显示，所设的给药剂量对 HepG2 细胞均具有不同程
度的抑制作用，即表示南方红豆杉粗多糖能促进胰
岛素抵抗 HepG2 细胞的葡萄糖消耗并非由于其促进
细胞增殖引起的，在扣除 MTT影响时，南方红豆杉粗
多糖仍表现出较好的促进糖消耗作用。
同时表中数据还显示，建立胰岛素抵抗模型后
细胞有增殖，MTT 值大于正常空白组。而生理胰岛
素的加入则会促进细胞的轻度增殖，扣除 MTT 影响
后发现，南方红豆杉粗多糖与生理胰岛素具有一定
的协同作用。
2.3.2 南方红豆杉粗多糖对 α－葡萄糖苷酶的抑制
活性的影响 南方红豆杉粗多糖对 α－葡萄糖苷酶
的抑制活性的影响见表 6。
表 6 中的数据显示，南方红豆杉粗多糖抑制活
性较好，抑制率明显高于阳性对照药物，且对 α－葡
萄糖苷酶的抑制作用具有剂量依赖性，对南方红豆
杉粗多糖开发成 α－葡萄糖苷酶抑制剂具有实际的
指导意义。
131
表 5 南方红豆杉粗多糖对胰岛素抵抗 HepG2 细胞葡萄糖消耗的影响
Table 5 Effect of crude polysaccharides from Taxus chinensis var.mairei to the glucose consumption of insulin－resistance HepG2 cells
组别
培养条件
药物
(mg /mL)
加入生理胰岛素
(U/mL)
MTT
(A490)
GC
(mmol /L)
GC /MTT
(mmol /L)
正常对照组
－ － 0.830 ± 0.0157 1.667 ± 0.0155 2.008 ± 0.0105
－ 0.001 0.891 ± 0.0201 1.918 ± 0.004 2.153 ± 0.0122
模型组
－ － 0.835 ± 0.0213 1.405 ± 0.0310＊＊ 1.683 ± 0.0109＊＊
－ 0.001 0.910 ± 0.0109 1.579 ± 0.0217＊＊ 1.735 ± 0.0117＊＊
南方红豆杉
粗多糖组
0.5 － 0.405 ± 0.0170##ΔΔ 1.056 ± 0.0100ΔΔ 2.607 ± 0.0120#Δ
0.5 0.001 0.509 ± 0.0231##ΔΔ 1.429 ± 0.0217 2.807 ± 0.0303#Δ
0.1 － 0.638 ± 0.0207##ΔΔ 1.741 ± 0.0210 2.729 ± 0.0108#Δ
0.1 0.001 0.676 ± 0.0310##ΔΔ 2.059 ± 0.0280 3.046 ± 0.0185##ΔΔ
0.05 － 0.778 ± 0.0207##ΔΔ 2.154 ± 0.0167##ΔΔ 2.769 ± 0.0159##ΔΔ
0.05 0.001 0.841 ± 0.0118ΔΔ 2.635 ± 0.0116##ΔΔ 3.133 ± 0.0251##ΔΔ
0.01 － 0.815 ± 0.0194#ΔΔ 1.975 ± 0.0231#Δ 2.423 ± 0.0233#Δ
0.01 0.001 0.879 ± 0.0211 2.317 ± 0.0173##ΔΔ 2.636 ± 0.0210#Δ
0.005 － 0.825 ± 0.0183ΔΔ 1.828 ± 0.0156 2.156 ± 0.0158#Δ
0.005 0.001 0.885 ± 0.0220 4.196 ± 0.128# 2.408 ± 0.0243#Δ
二甲双胍组
10 －3mol /L － 0.815 ± 0.0200 2.448 ± 0.0230##ΔΔ 3.004 ± 0.0299##ΔΔ
10 －3mol /L 0.001 0.882 ± 0.0125 2.870 ± 0.0204##ΔΔ 3.254 ± 0.0183##ΔΔ
注:与正常对照组比较＊＊p ＜ 0.01，与不加胰岛素的模型组比较# p ＜ 0.05，## p ＜ 0.01，与加胰岛素的模型组比较 Δp ＜ 0.05，
ΔΔp ＜ 0.01。
表 6 南方红豆杉粗多糖
对 α－葡萄糖苷酶的抑制活性的影响
Table 6 Effect of crude polysaccharides from
Taxus chinensis var.mairei to inhibitory activity
of alpha－glucosidase
提取物 浓度(mg /L) 抑制率(%) IC50(mg /L)
粗多糖
6.567
12.998
26.066
51.897
103.012
206.998
3.15 ± 0.38
15.78 ± 0.47
40.61 ± 0.12
64.08 ± 0.39
78.11 ± 0.13
85.23 ± 0.27
38.61
阿卡波糖
125
250
500
1000
2000
2.85 ± 0.92
6.99 ± 0.19
28.78 ± 0.38
49.85 ± 0.57
68.74 ± 0.66
1081.41
3 讨论
3.1 南方红豆杉粗多糖对 α－葡萄糖苷酶具有抑制
作用
α－葡萄糖苷酶抑制剂可以防治餐后高血糖症和
缓解高胰岛素血症，同时可以提高糖耐量，具有十分
广阔的应用前景。苦瓜有“药用蔬菜”之称，现代研
究表明苦瓜中皂苷［13－14］、多糖［15－16］可能是其发挥降糖
作用的主要活性成分，苦瓜皂苷和多糖对 α－葡萄糖
苷酶具有抑制活性，其 IC50值分别为 1.03mg /mL 和
10.73mg /mL［17］。茶多糖也显示较强的 α－葡萄糖苷
酶抑制活性，其 α－葡萄糖苷酶 IC50值为 3.2 g /L
［18］。
与上述两种植物比起来，南方红豆杉粗多糖的 IC50值
为 38.61mg /L远优于它们，说明南方红豆杉粗多糖对
α－葡萄糖苷酶抑制活性较高。
3.2 南方红豆杉粗多糖对胰岛素抵抗 HepG2 细胞
的葡萄糖消耗量具有促进作用
在 HepG2 细胞体外模型中，无论是否加入生理
胰岛素，南方红豆杉粗多糖对胰岛素抵抗 HepG2 细
胞的葡萄糖消耗量均具有促进作用，加入生理胰岛
素后更具有协同加强作用。
4 结论
从两种不同的体外降血糖模型实验结果可以初
步判断南方红豆杉粗多糖具有体外降血糖活性，但
还存在一些不足，如胰岛素抵抗模型的分子机制、降
糖的机理还有待进一步研究。此外，南方红豆杉粗
多糖中成分比较复杂，含有多糖的同时还含有蛋白
质、氨基酸等等，对于除去蛋白质后的精多糖降糖活
性如何还有待下一步继续研究，为后续的体内降血
糖实验和进一步开发打下基础。
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