全 文 ：中华补血草 Syntaxin基因的克隆
张 莹，陈世华* ，韩会玲，窦伟红，尹海波，赵吉强，郭善利* (烟台大学生命科学学院，山东烟台 264005)
摘要 ［目的］对中华补血草 Syntaxin基因进行克隆。［方法］以中华补血草叶片为材料，提取总 RNA并进行反转录反应。依据已知
Syntaxin基因 5端 EST序列信息设计巢式引物，以反转录得到的 cDNA为模板，利用 2轮 PCR扩增 cDNA3末端(3RACE)，获得 Syntaxin
基因 3端序列。［结果］获得 1 090 bp的 DNA片段。分析表明，该片段编码 LsSyntaxin全长基因，其中开放阅读框长 816 bp，编码 271个
氨基酸。该基因编码的 Syntaxin蛋白相对分子量为 30 254． 3 Da，理论等电点为 5． 55。［结论］为研究 Syntaxin基因在补血草中的功能及
其在补血草泌盐过程的作用奠定了基础。
关键词 中华补血草;3Race;Syntaxin基因;克隆
中图分类号 Q943． 2 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611(2012)06 －03245 －03
Cloning of Syntaxin Gene in Limonium sinense Kuntze
ZHANG Ying et al (Life Sciences College of Yantai University，Yantai，Shandong 264005)
Abstract ［Objective］The aim was to clone Syntaxin genes in Limonium sinense Kuntze． ［Method］ Limonium sinense Kuntze leaves were
used as materials and total RNA was extracted and transcribed reversely． Nested primers were designed as per EST sequences at gene 5’re-
gion of Syntaxin，and cDNA obtained through reverse reaction was taken as the template． Sequences of Syntaxin gene at 3’region were a-
chieved through two rounds of PCR amplifications． ［Result］DNA fragments (1 096 bp)were obtained． For LsSyntaxin，open reading frame
(ORF)was 816 bp and the encoded amino acids were 271． The relative molecular weight of Syntaxin was 30 254． 3 Da and isoelectric point
in theory was 5． 55． ［Conclusion］Syntaxin genes from Limonium sinense Kuntze were cloned． The research laid foundation for study of Syntax-
in gene function in Limonium sinense Kuntze and salt-secreted process．
Key words Limonium sinense Kuntze;3Race;Syntaxin gene;Clone
基金项目 国家自然科学基金(30870199) ;山东省自然科学基金
(Y2007D34) ;山东省科技攻关项目(2010GNC10937)。
作者简介 张莹(1985 － ) ，女，山东济宁人，在读硕士研究生，研究方
向:植物抗逆分子生物学。* 共同通讯作者，陈世华，副教
授，博士，从事植物发育分子生物学研究，E-mail:csh-yantai
@ 163． com;郭善利，教授，博士，从事植物发育分子生物学
与基因工程研究，E-mail:gsl@ ytu． edu． cn。
收稿日期 2011-11-10
突触融合蛋白(Syntaxin)是一类具有 SNARE结构域、参与
调控细胞内膜泡运输(膜囊泡与靶膜融合)相关的蛋白［1］。动
物细胞中，在突触前区该类蛋白参与突触小泡泊靠与融合、与
胞吐及神经递质释放相关;该家族的成员还可通过调控膜泡的
运输及融合，影响免疫系统的转运及胰岛素释放等过程［2］。
植物中，Syntaxin亚家族的成员众多。Syntaxin蛋白通过
膜泡运输参与植物细胞板形成［3］、与离子通道蛋白相互作
用、植物的抗病性及植物的向重力性应答等众多生理过
程［4］。但有关 Syntaxin 参与植物盐胁迫应答的相关研究尚
未见报道。对盐胁迫条件下构建的中华补血草 cDNA 表达
文库中补血草 Syntaxin相关(LsSyntaxin)EST序列分析表明，
该基因在中华补血草中的表达受盐胁迫诱导。但该基因参
与盐胁迫应答的分子机理在植物中尚未见报道。
中华补血草(Limonium sinense Kuntze)属白花丹科
(Plumbagenaceae)补血草属(Limonium)多年生泌盐草本植
物［5］，生长并分布于我国滨海各省区沿海潮湿的盐土及内蒙
古自治区呼伦贝尔盟境内的湖泊边沙土上［6］。在高盐环境
中，该植物可通过其盐腺结构排出植物体内过多的盐分，以
应对高盐胁迫、适应高盐生长环境。细胞水平的观察表明植
物泌盐过程同植物的膜泡运输、膜泡融合相关。但是，植物
泌盐的分子机理、参与植物泌盐相关基因的研究仍相对较
少。笔者以已知的 Syntaxin 基因 EST 序列设计引物，对
LsSyntaxin基因进行克隆，为研究该基因在补血草中的功能
及其在补血草泌盐过程的作用奠定基础。
1 材料与方法
1． 1 材料 烟台大学生命科学学院温室内栽培的中华补血
草幼苗。克隆载体 pMDl8-T、DL2000 Marker、RNAiso RNA提
取试剂盒及 PrimeScriptⅡ1ST Strand cDNA Synthesis Kit 均购
自 TaKaRa公司;琼脂糖凝胶回收试剂盒购自 TianGen 天根
时代北京公司;大肠杆菌 DH5α(Escheriachia coli)为实验室
保存;KOD DNA聚合酶购自宝日生物技术有限公司;其他试
剂为国产分析纯。试验中所有提取 RNA 所需容器均用
DEPC水处理 2周后灭菌烘干后备用。
1． 2 中华补血草总 RNA 的提取及反转录 将中华补血草
幼苗用 3% NaCl处理 24 h，取 200 mg叶片，加入液氮研磨成
粉末并转入含有入 1 ml RNAiso RNA提取试剂的 1． 5 ml EP
管中，涡旋混匀，室温放置 5 min 后，4 ℃ 12 000 r /min离心
5 min，上清液移至新的 1． 5 ml 离心管中，加入 300 ml 氯仿，
颠倒混匀(20 ～30次) ，4 ℃ 12 000 r /min离心10 min，取上清
液至新的 1． 5 ml离心管中，加 2倍体积预冷的异丙醇混匀，
－20 ℃静置 10 min，4 ℃下 12 000 r /min离心 10 min，弃上清
液，沉淀加入 1 ml 75%乙醇洗涤，4 ℃下 12 000 r /min 离心
1 min，弃上清液，沉淀置冰上于超净工作台中干燥后加 10 ～
30 ml RNase-free water 溶解沉淀。提取的 RNA电泳检测后，
按照 PrimeScriptⅡ1ST Strand cDNA Synthesis Kit操作说明以
Oligo(dT)25-AP为引物进行发转录反应合成 cDNA。
1． 3 引物序列 基于中华补血草 cDNA表达文库中 Syntax-
in基因 5端已知 EST序列，利用 Primer premier5． 0软件设计
5端巢式 PCR，引物序列如下:
BXC-Syntaxin-F1 GTAAAGAAGAGAGAGAGCGACG
BXC-Syntaxin-F2 AAGACAGAGAGGGCAGAAAGA
安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2012，40(6):3245 － 3247 责任编辑 朱琼琼 责任校对 卢瑶
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2012.06.199
Oligo(dT)25 APGACTCGAGTCGACATCGATTTTTTTTTTTTTTT
TTTTTTTTTT
AP GACTCGAGTCGACATCG
引物由北京华大六合基因公司合成。
1． 4 3RACE 克隆 Syntaxin 基因 3端序列 参照 BD
SMART RACE cDNA AmpIification Kit(Clontech公司)说明书
操作步骤进行。
1． 4． 1 Syntaxin基因 3序列的第 1轮扩增。首先以反转录得
到 cDNA为模板，以 F1 和 Oligo(dT)25-AP为上下游引物、利用
高保真聚合酶KOD进行第一轮PCR扩增。反应体系25 μl，包
括:10 ×Buffer 2． 5μl，dNTPs 1 μl，模板(高保真酶 PCR产物)1
μl，Taq酶 0． 5 μl，F1 1 μl，Oligo(dT)25-AP 1 μl，无菌水 18 μl。
PCR扩增条件为:94 ℃ 5 min;94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃
90 s共 30循环;72 ℃延伸 10 min。
1． 4． 2 Syntaxin基因 3序列的第 2 轮扩增。以第 1 轮 PCR
产物为模板，F2和 AP引物组合进行第 2 轮 PCR扩增，反应
体系同上，Tm 值提高至 56 ℃，其他条件不变。通过 2 次
PCR 获得 3RACE扩增产物，琼脂糖凝胶电泳检测并纯化。
1． 5 连接与转化 用试剂盒回收并纯化 PCR扩增到的目的
条带，连接到载体 pMD18-T载体，16 ℃连接过夜，连接体系
为 10 μl，包括 SolutonI 1 μl，T-Vector 1 μl，PCR产物 8 μl。
链接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞后，放入37 ℃
恒温培养箱培养过夜，挑取单克隆进行扩菌培养后提取质
粒，经酶切检测后挑选阳性克隆送华大六合测序。
2 结果与分析
2． 1 Syntaxin基因 3序列的克隆与序列分析 对 3RACE
的巢式 PCR第1轮扩增的产物进行电泳检测，结果表明 PCR
反应扩增出分布于 1 kb的非特异目的条带(图 1)。以第 1
轮 PCR产物为模板和 F2 + AP引物组合进行第 2 轮 PCR扩
增，检测结果表明经过第 2 轮 PCR 反应得到了分布于 1 kb
大小的特异产物条带。
注:1． DNA marker 2 000;2．以 F1 和 Oligo(dT)25-AP为引物的 PCR
扩增产物;3．以 F2 和 AP为引物的 PCR扩增，得到约 1 000 bp
左右的目的条带。
图 1 高保真酶 2轮 PCR电泳结果
2． 2 测序结果 对连有 PCR产物的 MD18-T阳性克隆质粒
进行 DNA 测序，得到 1 066 bp的核苷酸片段(图 2)。
注:下划线部分为 F1引物对应序列;下划线黑体部分为 AP引物对应序列;黑体 ATG与 TGA之间为序列为 Syntaxin基因的开放读码框。
图 2 利用 F2、AP分别为上下游引物进行 PCR扩增产物所得测序的结果
2． 3 PCR扩增所得产物的序列分析
2． 3． 1 克隆产物的开放读码框及序列比对分析。利用 NC-
BI的 ORF(http:/ /www． ncbi． nlm． nih． gov /gorf /gorf． html)软
件寻找扩增得到的 Syntaxin基因的开放读码框(ORF) ，该基
因的 ORF区共 816 bp，3非翻译区为 222 bp(图 2)。
利用 Blast(http:/ /www． ncbi． nlm． nih． gov /BLAST /)进
行核苷酸序列及其编码的氨基酸序列(图 3)进行比对分析，
结果表明自补血草中扩增得到的序列编码 271 个氨基酸的
突触融合蛋白，该蛋白同大豆(Glycine max)、马铃薯(Sola-
num tuberosum)中的突触融合蛋白具有 70%的相似性。
利用 Pfam 25． 0 (http:/ /pfam． sanger． ac． uk /search /
sequence)程序对该基因进行蛋白家族预测，表明该基因编码
6423 安徽农业科学 2012 年
图 3 中华补血草 syntaxin基因推导得到的氨基酸序列
SNARE膜融合复合体超家族中的 Syntaxin类蛋白，该蛋白具
有一个单一的 C端跨膜结构域、一个 SNARE domain(H3)和
一个 N端调控结构域(Habc)。
2． 3． 2 克隆产物编码蛋白属性分析。利用 ProtParam(ht-
tp:/ /web． expasy． org /protparam/)和 SignalP3． 0Server (ht-
tp:/ /www． cbs． dtu． dk /services /SignalP /)分别对该基因编码
蛋白的分子量及等电点、信号肽序列进行分析，结果表明
ProtParam预测 LsSyntaxin 蛋白的分子式为 C1327 H2168 N376 O421
S4，相对分子质量为 30 254． 3 Da，理论等电点为 5． 55，不稳定
系数为 38． 46，属于不稳定的酸性蛋白;SignalP3． 0Server分析
结果表明该基因编码的蛋白序列中无信号肽序列，而信息肽
是引导前体蛋白通过细胞膜分泌到胞外的一段序列，这说明
该 Sybtaxin 为非分泌性蛋白(Non-secretory protein)。利用
ProScale (http:/ /web． expasy． org /cgi-bin /protscale /protscale．
pl)以默认算法(Hphob． /Kyte＆ Doolittle)进行疏水性分析，
结果如图 4所示。
注:横坐标中“－”表亲性，“+”表疏水性。
图 4 中华补血草突触融合蛋白蛋白疏水性分析
3 结论与讨论
试验表明，基于已知的补血草 Syntaxin 基因序列，利用
3RACE扩增，成功克隆到了编码中华补血草 LsSyntaxin蛋白
的全长 LsSyntaxin 基因序列。试验中，利用 F1 和 Oligo
(dT)25-AP引物组合对 LsSyntaxin基因进行 PCR 扩增，得到
的条带较弥散，通过提高 Tm值并利用巢式引物 F2和 AP组
合，进一步提高了 PCR扩增的特异性，获得了较为理想的特
异目的条带。
突触融合蛋白是一类与真核细胞内膜泡运输过程密切
相关的蛋白。在动物和植物中，Syntaxin与 SNAP-25 和 Syn-
aptobrevin(或Vamp)同属 SNARE类蛋白，它们与细胞内的膜
泡运输、膜泡融合过程密切相关。已有研究表明，Syntaxin类
蛋白在动物细胞中主要参与神经递质的释放、激素的外分泌
等膜泡的运输及融合相关过程。
植物中，Syntaxin蛋白亚家族的成员众多。植物突变体
相关研究表明，Syntaxin类蛋白通过广泛参与植物细胞中的
膜泡运输过程，影响植物的细胞分裂、抗病、抗盐及植物的向
重力性应答等众多生理过程［4，7 －8］。植物防御应答反应信号
可通过调节突触融合蛋白快速磷酸化，参与内吞转运小泡和
膜靶向融合过程［9 －11］。
植物细胞内的膜泡运输及融合过程也与植物的盐胁迫
应答密切相关。液泡可将进入细胞中的过量离子区隔化，液
泡的发生与囊泡的融合密切相关。泌盐盐生植物在应答高
盐胁迫过程中，可通过泌盐盐腺结构排出进入体内的盐分。
形态结构及生理分析表明，植物泌盐过程与细胞内的许多含盐
膜泡运输及融合过程密切相关，但对分子水平上的植物泌盐过
程了解较少，且突触融合蛋白在植物泌盐过程中的作用及对含
盐囊泡运输融合的影响皆缺少分子水平的研究，中华补血草中
编码突触融合蛋白基因的克隆可为进一步通过转基因操作，分
析该基因编码蛋白的细胞定位分析、比较分析盐生植物和甜土
植物中此类基因功能的异同等相关研究奠定基础。
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