全 文 ：JTCVM
年第 5 期2014
高乌头总生物碱定量测定方法优化研究
李 芸 1，苗小楼 2，刘峰林 1，马贝红 1，李 康 1，徐 婷 1
（1.甘肃中医学院，甘肃省高校中藏药化学与质量研究省级重点实验室,甘肃兰州 730000；2.中国农业科学
院兰州畜牧与兽药研究所，甘肃兰州 730050）
摘 要：目的：建立高乌头总生物碱含量测定方法。方法：采用酸性染料比色法测定总生物碱含量。以氢溴酸
高乌甲素为对照品，溴甲酚绿为酸性染料，用氯仿进行萃取（pH值 5.4）。采用单因素实验，选择最佳显色条件和检
测波长。结果：最佳显色条件为：醋酸-醋酸钠缓冲液（pH值 3.0±0.1）和 0.1%溴甲酚绿溶液用量均为 10.0 mL，最
佳检测波长为 413 nm。氢溴酸高乌甲素在 4.44-17.76 μg/mL范围内浓度与吸光度呈良好的线性关系，回归方程
为：A=41.977 C－0.1004（r=0.995 2），平均回收率为 91.79%，RSD为 2.52%（n=6）。结论：3批样品测定结果表明，所
建立的方法简便、准确，可用于高乌头总生物碱含量测定。
关键词：高乌头；氢溴酸高乌甲素；总生物碱；酸性染料比色法；含量测定
中图分类号：S853.7 文献标志码：A 文章编号：1000-6354（2014）05-0053-04
DOI:10.13823/j.cnki.jtcvm.2014.05.019
收稿日期：2014-06-04
基金项目：甘肃省自然科学研究基金计划（1107RJZA242）
作者简介：李 芸(1973-)，女，副教授，硕士生导师，主要从事中
药材加工炮制、中药活性成分提取分离和质量标准研
究，E-mail：liyunherb@163.com
高乌头是毛莨科植物高乌头（AconitumsinomontanumNakai）
的干燥根，又名麻布七、口袋七、辫子七、蓑衣七等。高乌头
是甘肃、青海、陕西太白地区、山西、湖北神农架地区、贵州、
四川等地的民间草药[1-6]，根药用，有毒，主要用于祛风除湿、
理气止痛、活血散瘀等。研究表明其主要成分为二萜生物碱[7,8]。
甘肃产高乌头药材质量标准中仅有定性鉴别，没有含量测
定项。总生物碱含量的高低能够反映其有效性，笔者等采用
单因素实验优选高乌头总生物碱的定量测定方法，为该药
材及其炮制品的质量控制提供依据。
1 仪器与试药
1.1 仪器
UV-3300 型紫外可见分光光度计（上海美谱达仪器有
限公司）；101A-2电热鼓风干燥箱（上海市实验仪器总厂）；
分析天平（Sartorius BT 125D，十万分之一）；SB-5200 DTD
超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；PHS-
430 型 pH 计（方舟电子科技有限责任公司）。
1.2 试药
高乌头（购自甘肃省天祝藏族自治县），由中药鉴定教研
室杨抚德教授鉴定为高乌头 (Aconitum sinomontanum Nakai)
属毛莨科(Ranunculaceae)乌头属(Aconitum)的根；氢溴酸高
乌甲素对照品（购自甘肃神龙药业股份有限公司，批号
20001001，含量 97.50 %）；其他试剂均为分析纯。
1.3 0.05 M NaOH溶液的制备
按 2010 版《中国药典》附录方法，取饱和 NaOH 溶液
3.8 mL，加新沸过的冷蒸馏水定容至 1 000 mL，即得。
1.4 0.1%溴甲酚绿的制备
精密称取溴甲酚绿 0.5000 g，用 NaOH溶液（0.05 mol/L）
8.75 mL 研磨，加蒸馏水溶解至 500 mL（pH 值 6.0±0.2），
过滤，以氯仿除去脂溶性杂质，即得。
1.5 醋酸-醋酸钠缓冲溶液的制备
精密称取醋酸钠 0.301 25 g，精密量取冰醋酸 11.2 mL
置 1 000 mL容量瓶中，加蒸馏水至刻度即得（pH值 3.0±0.1）。
2 方法与结果
2.1 对照品溶液的制备
精密称取氢溴酸高乌甲素 11.10 mg，置于 50 mL 容量
瓶中，加入醋酸-醋酸钠缓冲液稀释至刻度，作为对照品溶
液，备用。
2.2 线性关系考察
精密量取对照品贮备液 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0 mL
分别置分液漏斗中，分别加醋酸-醋酸钠缓冲液至 10 mL，
另取醋酸-醋酸钠缓冲液 10 mL 置于分液漏斗中作为空
白对照。在上述分液漏斗中分别加入 0.1%溴甲酚绿溶液
10 mL，振摇 5 min，静置 10 min，用氯仿提取 3 次，每次
10 mL，合并氯仿层，用干燥滤纸滤过于 50 mL 量瓶中，并
用氯仿稀释至刻度，在 413 nm 处测定吸光度，以吸光度
(A)对质量浓度 (C)进行线性回归（见图 1），结果氢溴酸高
乌甲素在 4.44-17.76 μg/mL 线性关系良好，回归方程为：
A=41.977 C－0.1004，r=0.995 2。
浓度 /mg·mL-1
图 1 氢溴酸高乌甲素的标准曲线
Fig.1 Standard curve of Lappaconitine Hydrobromide
实
验
技
术
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2.3 供试品溶液制备方法优化
方法 1：取高乌头粉末 0.2 g，精密称定，用 8 倍量 95%
乙醇超声提取 30 min，过滤，滤液在 60 ℃水浴低温回收溶
剂，残渣用 1 mol/L HCl 酸化，加氨水调节 pH 值至 9，用氯
仿萃取 3次，每次 20 mL。减压回收溶剂，水浴 60 ℃蒸干，
残渣用氯仿定容至 25 mL。
方法 2：取高乌头粉末 0.2 g，精密称定，加入乙醚 ∶氯
仿（3∶1）20 mL、氨试液 1 mL，摇匀静置过夜，过滤，药渣用
乙醚∶氯仿（3∶1）洗涤 3 次，合并滤液，减压回收溶剂，水浴
60 ℃蒸干，残渣用氯仿定容至 25 mL。
上述两种供试液依法测定，结果见表 1。从表 1 可知，
方法 2 比方法 1 操作简单，总生物碱的含量较高，故选用
方法 2 进行提取。
表 1 不同提取方法对高乌头总生物碱含量的影响
Tab.1 Effect of different extraction methods on content
of total alkaloids in Aconitum sinomontanum Nakai
2.4 检测波长的确定与染色条件的优化
2.4.1 最大吸收波长的确定 取氢溴酸高乌甲素对照品
溶液和供试品溶液各 1 mL，按照线性关系考察项下的方
法染色，于 200-700 nm 进行紫外光谱波长扫描（扫描间距
为 1 nm）。结果发现，对照品和供试品溶液均在 413 nm 处
有最大吸收峰，故确定最大检测波长为 413 nm（见图 2）。
图 2 溶液的最大吸收光谱图（1：对照品；2：供试品）
Fig.2 Maximum absorption spectra of samples
(1: reference substances; 2: test articles)
2.4.2 溴甲酚绿染料用量的选择 见图 3。由图 3 可知，
溴甲酚绿染料的用量影响总生物碱的含量，用量太小则影
响阴阳离子对的形成；用量太大，影响 pH 值，从而影响测
定结果。
溴甲酚绿的用量 /mL
图 3 溴甲酚绿的用量对高乌头总生物碱吸光度的影响
Fig.3 Effect of bromocresol green amount on absorbance
of total alkaloids in Aconitum sinomontanum Nakai
2.4.3 醋酸盐缓冲液 pH值的选择 实验对 pH 值为 2.0、
3.0、4.0 及 6.0 醋酸盐缓冲液分别进行考察，发现 pH值为
3.0醋酸盐缓冲液空白稳定，重现性较好。
2.4.4 氯仿萃取 pH值的选择 实验表明，在 pH值为 5.4时，
氯仿萃取效果好，总生物碱含量最高。
2.5 稳定性试验
取供试品溶液，按照标准曲线项下的方法进行操作，
分别在 1、10、20、30、60、90、120、180、240、360 min 测定吸
光度，结果见图 4。结果表明，供试品溶液在 0-30 min 内
吸光度持续上升，在 30 -360 min 内趋于稳定，RSD 为
1.42%，说明供试品溶液在 6 h 内稳定。
图 4 供试品溶液稳定性考察
Fig.4 Research of the stability of the samples
2.6 精密度试验
精密吸取对照品溶液 2 mL，连续测定 6 次，吸光值分
别为 0.261、0.260、0.260、0.262、0.261、0.260，RSD为 0.34%，
说明仪器精密度良好。
2.7 重复性试验
取同一药材样品，平行 6 份，依法测定，结果见表 2。
由表 2 结果可知，样品中高乌头总生物碱平均含量为
3.36%，RSD 为 2.61%，说明重复性良好。
表 2 重复性实验结果 (n=6)
Tab.2 Repetitive experimental results (n=6)
样品号 取样量/g 吸光度 含量/％ 平均含量/％RSD/％
1 0.200 3 0.350 3.34
2 0.201 3 0.342 3.27
3 0.200 5 0.356 3.39
4 0.201 5 0.339 3.25
5 0.201 1 0.361 3.42
6 0.201 0 0.369 3.48
3.36 2.61
方法 A(Abs) (Abs) 含量/%
1 0.310 0.310 0.310 0.310 3.06
2 0.380 0.380 0.380 0.380 3.58
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Research on the optimum method for quantitative determination of total alkaloid in
Aconitum sinomontanum Nakai
LI Yun1, MIAO Xiao-lou2, LIU Feng-lin1, MA Bei-hong1, LI Kang1, XU Ting1
(1. Key Laboratory of Chemistry and Quality for Traditional Chinese (Tibetan) Medicine of Universities in Gansu Province,
Gansu College of Traditional Chinese Medicine, Lanzhou Gansu 730000; 2.Lanzhou Institute of Husbandry and Pharmaceutical
Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Lanzhou Gansu 730050, China)
Abstract：Objective: To establish a method for the determination of total alkaloid in Aconitum sinomontanum Nakai. Methods:
Content of total alkaloids in the samples was determined by acidic dye colorimetry, which was performed with Lappaconitine
Hydrobromide as the reference substance, bromocresol green as the acidic dye, and CHCl3 as the extractant under the condition of
a buffer solution (pH=5.4). The best color conditions and detection wavelengths were chosen by single factor experiment. Results:
The optimum color conditions were: The amount of acetic acid-sodium acetate buffer (pH=3.0 ± 0.1) and 0.1% of bromocresol
2.8 加样回收试验
取已知含量的高乌头药材 0.1 g，精密称定，精密加入
氢溴酸高乌甲素对照品溶液（浓度为 0.315 2 mg/mL）7 mL，
按供试品溶液的制备方法制备溶液，依法测定，结果见
表 3。其平均回收率为 91.79%，RSD 为 2.52%，符合规定。
表 3 加样回收实验结果(n=6)
Tab. 3 Results of sampling recovery test (n=6)
2.9 高乌头总生物碱含量测定
取高乌头药材 3 批，依法测定，计算总生物碱的含量，
结果分别为 2.06%、1.39%、3.36%。
3 讨论
3.1 生物碱含量测定方法的确定
《中国药典》中有关总生物碱的含量测定方法为中和
滴定法，该法虽操作简单，稳定性好，但计量点以显色剂显
色为反应终点，由于操作和视觉效应等因素难以把握和确
定滴定终点，而采用酸性染料比色法测定生物碱含量，具
有样品用量少、专属性强的优势，特别是借助紫外分光光
度计，其灵敏度也相对提高，测定结果更准确。
3.2 最大波长的选择
在实验中对最大吸收波长进行了筛选，将 413 nm 作
为最大吸收波长，这与文献 [9]报道结果相一致。
3.3 0.1%溴甲酚绿溶液用量的选择
在酸性染料比色法中，溴甲酚绿的用量对测定结果准
确性影响较大，只有溴甲酚绿的用量充足才能使总生物碱
与之形成离子对，从而准确测定出总生物碱的含量。实验对
溴甲酚绿的用量进行了考察，结果表明 10 mL为最佳用量。
3.4 pH值对实验的影响
pH 值是酸性染料比色法测定生物碱含量至关重要的
因素，只有选择适宜的 pH 值使生物碱形成阳离子，而同
一 pH 值条件下，酸性染料形成足够的阴离子，阴阳离子
才能定量形成离子对，并完全被有机溶剂萃取，过量的染
料完全保留在水相中，才能保证定量测定，同时缓冲溶液
在维持此过程中 pH 值的稳定性起到重要作用，使未与乌
头碱结合的溴甲酚绿能够稳定地溶解在水层中，因此，控
制适宜 pH 值才能保证生物碱被充分提取。经实验考察，
pH 值为 5.4 时最适宜。
参考文献:
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117-118.
[2] 水飞蓟等二十二种甘肃省中药材质量标准（试行）[S].
甘肃省卫生厅文件，69-70.
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版社，1973:119-120.
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湖北人民出版社，1971：341-341.
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学院，1977：136-136.
[6] 国家中医药管理局，中华本草编委会 .中华本草（第七
卷[M].上海：上海科技出版社，1999：1746-1747.
[7] 陈泅英，刘玉青，杨崇仁. 高乌头的化学成分[J].云南植
物究，1980，4(2)：473-475.
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碱[J].有机化学，2005，25(10)：1235-1239.
[9] 谢海辉，韦璧瑜.高乌头的化学成分及其药理作用研究
进展[J].天然产物研究与开发，2010，22：232-235，154.
[10]吴延吉 .甘肃高乌头有效部位的研究 [D].天津：天津大
学，2007.
样品号
1 0.100 2 3.365 0 2.206 4 5.353 7 90.13
2 0.100 7 3.381 8 2.206 4 5.368 9 90.06
3 0.100 3 3.368 4 2.206 4 5.439 8 93.88
4 0.100 8 3.385 2 2.206 4 5.490 8 95.43
5 0.100 6 3.378 5 2.206 4 5.390 3 91.18
6 0.100 5 3.376 8 2.206 4 5.364 3 90.08
91.79 2.52
取样量
/g
原有量
/mg
加入量
/mg
测得量
/mg
回收率
/％
平均回收
率/％
RSD
/％
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green solution were 10.0 mL, optimum detection wavelength was 413 nm. Lappaconite Hydrobromide had a good linear
relationship with the absorbance in the range of 4.44 μg/mL-17.76 μg/mL, and the regression equation was A=41.977C-0.1004
(r=0.995 2). The average recovery for Lappaconite Hydrobromid was 91.79% with RSD of 2.52%(n=6). Conclusions: Content
determination of total alkaloid in three batches of samples showed that the method is simple, convenient and accurate, and can
be used for the content determination of total alkaloid in Aconitum sinomontanum Nakai.
Key words: Aconitum sinomontanum Nakai; Lappaconite Hydrobromide; total alkaloid; acidic dye colorimetry; quantitative
determination
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
基于CNKI数据库的无乳链球菌文献计量与研究趋势分析
王旭荣 1，杨 峰 1，李 贺 2，王孝武 1，张世栋 1
（1.中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所 农业部兽用药物创制重点实验室 甘肃省新兽药工程重点实
验室，甘肃兰州 730050；2.南海出入境检验检疫局，广东佛山 528200）
摘 要：采用文献计量学方法对中国知网（CNKI）数据库核心期刊收录的无乳链球菌专题的科学文献进行
统计，分析其研究进展并探讨研究趋势。结果显示，无乳链球菌可感染人和多种脊椎动物；对无乳链球菌专题研究
的机构主要有西北农林科技大学、中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所、四川农业大学鱼病研究中心、中国水
产科学研究院珠江水产研究所 4个机构；国内关于该病原的研究主要集中在临床报道、病原分离、耐药性检测等
方面，关于该菌对宿主的致病机制、细菌基因组、细菌蛋白组等方面的研究尚不深入，甚至缺乏。
关键词：无乳链球菌；文献计量学；CNKI
中图分类号：S852.61 文献标志码：A 文章编号：1000-6354（2014）05-0056-04
DOI:10.13823/j.cnki.jtcvm.2014.05.020
收稿日期：2014-06-24
基金项目：甘肃省农业生物技术研究与应用开发项目（GNSW-2013-28）；
甘肃省农业科技创新项目（GNCX-2013-59）；中央级公
益性科研院所基本科研业务费专项资金项目（1610
322014001）
作者简介：王旭荣（1980-），女，博士，助理研究员，主要从事分子病
毒学和分子细菌学研究。
通讯作者：张世栋（1983-），男，助理研究员，主要从事细胞生物学
与药理学研究。
无乳链球菌是一种人畜共患病原菌，可感染人、奶牛、
兔、罗非鱼、牛蛙等多种脊椎动物 [1-6]，人医上将无乳链球
菌称为 B 群链球菌（GBS）。GBS 是目前公认的围产期致病
菌，使带菌孕妇易发生早产、晚期流产、胎儿发育不良、胎
膜早破、子宫内膜炎、泌尿道感染等。另外，GBS 可垂直传
播感染新生儿，主要有早发型和晚发型，早发型以败血症、
肺炎、脑膜炎为主，晚发型的典型表现是脑膜炎。目前，
GBS 是成年人特别是老年人潜在疾病的主要病因和免疫
低下人群的重要侵袭性病原 [6]，在奶牛上主要引起奶牛急
性、亚急性和慢性乳房炎。由于无乳链球菌可感染人和多
种动物，国内关于该病原的研究也逐渐增多、逐渐深入。但
是，目前暂无关于分析无乳链球菌研究现状的报道。笔者
等旨在采用文献计量学方法对无乳链球菌的相关研究情
况进行分析，从宏观角度分析其研究进展，探讨其发展趋
势，为相关领域的科研人员、临床兽医和生产企业提供依
据，并推动本专题内的产学研合作。
1 数据来源与研究方法
本文数据来源是采用 CNKI 数据库，数据采集时间跨
度是 1992 年至 2013 年 12 月 31 日。选用高级检索方式，
检索项选择“关键词=无乳链球菌 or 关键词= B群链球菌”
的精确匹配方式，在 CNKI 数据库中进行 SCI 来源期刊、EI
来源期刊、核心期刊检索，获取相关文献，通过科学计量指
标，对文献进行量化分析。
2 国内无乳链球菌研究现状
2.1 全国范围论文发表逐年变化情况
共检索出 218 篇相关文献，其中原创论文 184 篇，综
述 27 篇，与无乳链球菌相关度低的论文 6 篇（见图 1）。与
无乳链球菌关系紧密的原创性论文 184 篇中，1999 年以
前发文量均为 5 篇以下，2000 年增长到 7 篇，2001-2005
年发文量又处于低迷期，2006 年又增加到 9 篇，2013 年
发文量达到最高，为 29 篇。说明目前关于无乳链球菌的研
究越来越引起科研人员的重视。
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