全 文 ：大孔吸附树脂纯化贯叶连翘提取物的工艺
雷 雪， 刘富岗， 杨 云*
(河南中医学院药学院，河南 郑州 450008)
收稿日期:2011-11-26
基金项目:2010 河南省郑州市科技攻关 (10PTGS486-1)
作者简介:雷 雪 (1987—) ，女，研究生，从事中药及制剂中活性成分研究及新药开发。E-mail:leixue15003880050@ 163． com
* 通信作者:杨 云，女，硕士生导师，教授。Tel: (0371)65680605，E-mail:Yyun@ china． com． cn
摘要:目的 筛选纯化贯叶连翘提取物的最佳树脂型号及其最佳工艺。方法 以金丝桃素为指标，对大孔吸附树脂的
类型进行筛选，并采用正交试验，对最佳大孔吸附树脂工艺进行考察。结果 最佳大孔吸附树脂为 LSA-10，其最佳
工艺为比上柱量 1. 954 2 mg /g;径高比 1 ∶ 20;药液浓缩比 1 ∶ 1，药液上样体积流量 2 BV /h，分别以 4 BV 蒸馏水、
3 BV 20%乙醇、8 BV 70%乙醇为洗脱剂洗脱，贯叶连翘提取物中的金丝桃素量提高到 1. 5%以上。结论 该工艺合
理、稳定，纯化效果好。
关键词:贯叶连翘提取物;金丝桃素 ;大孔吸附树脂;正交试验
中图分类号:R944 文献标志码:A 文章编号:1001-1528(2012)09-1696-04
Purification of Hypericum perforatum L． extracts with macroporous resins
LEI Xue， LIU Fu-gang， YANG Yun*
(College of Pharmacy，Henan University of Traditional Chinese Medicine，Zhengzhou 450008，China)
KEY WORDS:extracts of Hypericum perforatum L．;hypericin;macroporous resins;orthogonal experiment
贯叶连翘 Hypericum perforatum L． 为藤黄科金
丝桃属的干燥地上部分［1］，其有效成分金丝桃素，
具有明显的抗抑郁、抗病毒、抗肿瘤，以及显著的
抗 DNA、RNA 病毒作用，并可用于治疗艾滋
病［2-5］。大孔吸附树脂为一种有机高聚吸附剂，具
有选择性好、吸附容量大、解析容易、再生简便等
优点［6］。目前市场上的贯叶连翘提取物普遍存在
金丝桃素量较低的现象，严重阻碍了贯叶连翘药材
及其制剂的进一步开发利用［7］。为了得到金丝桃
素量较高的贯叶连翘提取物，且国内外对贯叶连翘
提取物的金丝桃素量应不低于 0. 3%为指标［8］，本
实验采用大孔吸附树脂的方法纯化贯叶连翘提取
物，以金丝桃素为指标，对贯叶连翘提取物纯化
工艺进行静态和动态吸附-解吸研究，最终选取
LSA － 10 型大孔吸附树脂，并确定其最佳纯化
工艺。
1 仪器与试药
BS210S型电子天平 (北京赛多利斯公司) ;
LC—20AT 高效液相色谱仪 (日本岛津公司) ;
METTLER AE240 电子分析天平 (瑞士梅特勒-托利
公司)等。
贯叶连翘药材购于陕西渭南，经河南中医学院
药学院董诚明教授鉴定为藤黄科金丝桃属植物贯叶
连翘的干燥地上部分;金丝桃素对照品 (中药固
体制剂制造技术国家工程研究中心，批号:1158-
080715) ;AB －8、S － 8 大孔吸附树脂 (南开大学
化工厂) ;CAD －45、860021 大孔吸附树脂 (山东
鲁抗股份有限公司) ;D101、DA － 201 大孔吸附树
脂 (天津农药总厂) ;DB － 301、HPD － 600 大孔
吸附树脂 (沧州宝恩化工有限公司) ;LSA － 10、
LSA －20、XDA － 6 大孔吸附树脂 (西安蓝深交换
吸附材料有限责任公司) ;SP － 825 大孔吸附树脂
(日本三菱化学公司) ;色谱甲醇 (天津四友精细
化学品有限公司) ;双蒸水;其余所用试剂的均为
分析纯。
2 方法与结果
2. 1 定量测定
2. 1. 1 色谱条件 依利特 Hypersil ODS2 (5. 0 mm ×
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200 mm，5 μm)［9］;检测波长 590 nm;柱温
30 ℃;检测器为 SPD—20A UV /VIS;流动相为
甲醇-0. 1 mol /L NaH2PO4 (97 ∶ 3) ;体积流量 1
mL /min。
2. 1. 2 标准曲线的绘制 分别精密吸取对照品溶
液 1. 0、2. 0、5. 0、10. 0、15. 0、20. 0 μL 进样，
按 2. 1. 1 项的色谱条件测定，以金丝桃素质量浓度
为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，进
行线性回归。回归方程为:A = 298 457C － 469. 54，
r = 0. 999 9 (n = 6) ，金丝桃素质量浓度在 0. 010 4
～ 0. 208 μg /mL内线性关系良好。
2. 2 大孔吸附树脂类型的选择
2. 2. 1 上柱溶液的制备 称取贯叶连翘药材粉末
150 g，精密称定，加 10 倍量 95%乙醇回流提取 2
次，每次 3 h，乙醇提取液于 50 ℃减压浓缩至
150 mL，即得。
2. 2. 2 大孔吸附树脂的预处理 根据文献报道的
方法对大孔吸附树脂进行预处理［10］。
2. 2. 3 静态筛选最佳大孔吸附树脂 分别称取处
理好的大孔吸附树脂 S － 8、AB － 8、CAD － 45、
860021、DB － 301、D101、DA － 201、HPD － 600、
LSA － 10、LSA － 20、XDA － 6、SP － 825 各 5 g，
置 100 mL锥形瓶中，备用。
在处理好的 12 种大孔吸附树脂中，精密加入
上柱溶液 10 mL，振摇，静置吸附 24 h，精密吸取
未吸附溶液，并蒸干，加甲醇溶解，HPLC 法测定
金丝桃素，并计算各型号树脂静态饱和吸附量，静
态饱和吸附量 = (样品中金丝桃素量 －吸附后滤
液中金丝桃素量) /树脂量 (mg /g干树脂)［11］。
滤出已吸附上柱溶液大孔吸附树脂，置于
100 mL具筛三角瓶中，依次以 30、20、10 mL 的
95%乙醇超声洗涤，合并洗涤液，于 85 ℃水浴蒸
干，用甲醇溶解残渣并转移至 10 mL 量瓶中并定
容，用 HPLC法测定金丝桃素，计算 12 种树脂的
静态洗脱率，静态洗脱率 = (洗脱液浓度 ×洗脱
液体积) /饱和吸附量 × 100%，结果见表 1。
由表 1 可知，LSA － 20、LSA － 10、SP825、
S － 8、XDA －6 5 种大孔吸附树脂较其他类型的大
孔吸附树脂的静态吸附量与洗脱率均较高，其静态
饱和吸附量为 XDA － 6 ＞ LSA － 10 ＞ S － 8 ＞ LSA －
20 ＞ SP － 825 ＞ 1. 35 mg /g，静态洗脱率为 LSA －
20 ＞ LSA － 10 ＞ SP － 825 ＞ S － 8 ＞ XDA － 6 ＞ 90%，
所以选择此 5 种大孔吸附树脂对其进行动态情况下
上柱溶液的吸附与解吸附能力考察。
表 1 大孔吸附树脂静态筛选实验结果
Tab. 1 Static selection results of macroporous resins
树脂类型 静态饱和吸附量 /(mg·g － 1) 静态洗脱率 /%
AB － 8 0. 466 2 89. 6
S － 8 1. 576 0 92. 9
CAD － 45 0. 412 9 97. 5
D101 0. 525 2 98. 8
DA － 201 1. 056 1 92. 0
DB － 301 1. 210 6 86. 9
HPD － 600 1. 353 8 88. 9
LSA － 10 1. 924 0 98. 9
LSA － 20 1. 384 7 99. 3
SP － 825 1. 351 0 91. 8
XDA －6 2. 041 9 95. 9
860021 1. 044 8 90. 6
2. 2. 4 动态筛选最佳大孔吸附树脂 分别称取处
理好的 LSA － 10、 LSA － 20、 S － 8、 SP825、
XDA －6 5 种不同型号的大孔吸附树脂各 10 g，分
别取上柱溶液 40 mL 上样，控制体积流量为
1 mL /min，预吸附 2 h，过柱液重吸附一次，静置
12 h。收集过柱液，然后用蒸馏水洗至无色，再用
80%乙醇洗至无色，分别收集各段洗脱液，测定金
丝桃素浓度，并计算各部分金丝桃素的量。按下式
分别计算比上柱量、比吸附量、比洗脱量。比上柱
量 = (上柱样品液中金丝桃素的量-过柱液中残余
金丝桃素的量) /树脂质量;比吸附量 = (上柱样
品液中金丝桃素的量-过柱液中残余金丝桃素的量-
水洗脱液中金丝桃素的量) /树脂质量;比洗脱
量 = 80%乙醇洗脱部分金丝桃素的量 /树脂质量，
结果如图 1。
图 1 5 种大孔吸附树脂动态吸附性能实验
Fig. 1 Dynamic absorption experiments of 5 kinds of
macroporous resins
从图 1 可以看出，LSA －10 在动态筛选大孔吸
附树脂实验的各指标均为最优，结合静态试验，
LSA －10 大孔吸附树脂静态洗脱率 98. 9%，静态
饱和吸附量 1. 924 0 mg /g，动态比柱量为 1. 954 2、
比吸附量 1. 927 0、比洗脱量 1. 768 2，亦优于其它
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类型树脂，因此选用 LSA － 10 大孔吸附树脂纯化
贯叶连翘提取物。
2. 3 LSA －10 型大孔吸附树脂的工艺参数考察
2. 3. 1 不同质量分数乙醇动态洗脱效果的考察
称取处理好的 LSA － 10 型大孔吸附树脂 10 g，精
密称定。取上柱溶液 40 mL，控制体积流量
1 mL /min上柱，预吸附 2 h，过柱液重吸附一次，
静置 12 h。收集过柱液，分别以 5 BV 的蒸馏水、
20%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇洗脱，
每瓶收集 1 BV的洗脱液，共收集 30 份，其中 1 ～
5 为蒸馏水洗脱液，6 ～ 10 为 20% 乙醇洗脱液，
11 ～ 16 为 50%乙醇洗脱液，17 ～ 22 为 70%乙醇洗
脱液，23 ～ 30 为 95%乙醇洗脱液。将收集到的各
洗脱液 85 ℃水浴蒸干，测定金丝桃素。以金丝桃
素量 (Y)为纵坐标，收集量瓶的编号 (X)为横
坐标，绘制洗脱曲线，结果见图 2。
1 － 5． 水洗脱 6 － 10． 20%乙醇洗脱 11 － 16． 50%乙醇洗
脱 17 － 22． 70%乙醇洗脱 23 － 30． 95%乙醇洗脱
1 － 5． eluted by water 6 － 10． eluted by 20% ethanol
11 － 16． eluted by 50% ethanol 17 － 22． eluted by 70% ethanol
23 － 30． eluted by 95% ethanol
图 2 LSA － 10 型大孔树脂吸附金丝桃素梯度洗脱
曲线
Fig. 2 Gradient elution curve of adsorption hypericin
by LSA －10
图 2 结果表明，50%、70%、95%乙醇洗脱液
为金丝桃素的主要存在部位，占金丝桃素总量的
97. 67%。而其中 50%和 70%乙醇洗脱液中金丝桃
素量占总量的 85. 04%，95%乙醇洗脱液中金丝桃
素量较少。70%乙醇的极性小于 50%乙醇，相对
而言可洗脱下的水溶性杂质较少，可基本涵盖
50%乙醇洗脱液可以洗脱的金丝桃素量，且综合考
虑减少操作工序，节约生产成本等因素，初步确定
洗脱条件为先用蒸馏水、20%乙醇洗去水溶性杂
质，再以 70%乙醇洗脱，收集 70%乙醇洗脱部分。
2. 3. 2 洗脱剂用量的考察 精密吸取上柱溶液
35 mL上柱，依次用蒸馏水、20%乙醇、70%乙醇
洗脱，每瓶收集 1 BV的洗脱液，依次按 1，2，3，
…编号，分别浓缩至干，测定每份洗脱液中金丝桃
素量。以金丝桃素量 (Y)为纵坐标，收集量瓶编
号 (X)为横坐标绘制洗脱曲线，如图 3。
1 － 5． 水洗脱 6 － 10． 20%乙醇洗脱 11 － 21． 70%乙醇洗脱
1 － 5． eluted by water 6 － 10． eluted by 20% ethanol
11 － 21． eluted by 70% ethanol
图 3 70%洗脱剂用量对金丝桃素洗脱终点的判断
Fig. 3 Judgment of elution endpoint of by 70% eluant vol-
ume
从图 3 可知，当蒸馏水用量至 4 BV、20%乙
醇洗脱 3 BV时，洗脱曲线已近横轴且所收集的洗
脱液几乎无色，说明水溶性杂质已除去。采用
70%乙醇洗脱，洗脱至 8 BV 时曲线已接近横轴，
且前 8 BV洗脱液中金丝桃素量约占 70%乙醇总洗
脱量的 96%以上，故确定洗脱液溶媒为 8 BV 70%
乙醇。
2. 3. 3 影响 LSA － 10 型大孔树脂吸附性能因素的
正交试验考察 根据文献 ［12］，大孔吸附树脂的
吸附性能与药液浓缩比、柱径高比、上样体积流量
等因素有关。本实验采用 L9(3
4)正交试验筛选最
佳上柱工艺条件。正交设计的因素水平表见表 2。
表 2 L9(3
4)正交设计因素水平
Tab. 2 L9(3
4)orthogonal design factors and levels
水平 药液浓缩比 A 半径 ∶ 柱高比 B 上样体积流量 C /(BV·h －1)
1 1 ∶ 0. 5 1 ∶ 20 1
2 1 ∶ 1 1 ∶ 10 2
3 1 ∶ 2 1 ∶ 5 3
本正交试验以 70%乙醇洗脱液中金丝桃素量
(以 100 g 贯叶连翘药材计)为考察指标，结果见
表 3，方差分析见表 4。
从表 3、表 4 可知，影响因素大小的顺序为
B ＞ A ＞ C，且方差分析结果表明，A和 B因素对实
验结果有显著意义 (P ＜ 0. 05) ，最终确定最佳搭
配为 A2B1C2，即最佳方案为:药液浓缩比为 1 ∶ 1;
层析柱半径与柱高比为 1 ∶ 20;药液上样体积流量
为 2 BV /h。
2. 4 验证试验 以最佳工艺条件进行放大实验，
经 LSA －10 型大孔吸附树脂纯化后，6 批样品中金
丝桃素量均高于 1. 5%以上，且转移率达 70%以
上。远远高于贯叶连翘提取物 ＞ 0. 3%的国际标准，
证明此工艺合理可行。
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表 3 正交试验设计及结果
Tab. 3 Design and results of orthogonal tests
试验号 A B C D 金丝桃素 /mg
1 1 1 1 1 16. 86
2 1 2 2 2 14. 86
3 1 3 3 3 13. 85
4 2 1 2 3 19. 71
5 2 2 3 1 17. 87
6 2 3 1 2 15. 25
7 3 1 3 2 15. 92
8 3 2 1 3 14. 86
9 3 3 2 1 13. 69
Ⅰ 45. 58 52. 49 46. 97 48. 42 G = 142. 9
Ⅱ 52. 82 47. 59 48. 26 46. 02 CT = 2 268. 0
Ⅲ 44. 47 42. 79 47. 64 48. 42
Ⅰ2 2 077. 12 2 755. 39 2 206. 10 2 344. 85
Ⅱ2 2 790. 43 2 264. 64 2 329. 03 2 118. 09
Ⅲ2 1 977. 50 1 830. 91 2 269. 57 2 344. 76
Rj =Ⅰ2 +Ⅱ2 +Ⅲ2 6 845. 05 6 850. 93 6 804. 69 6 807. 70
SSj = Rj /3-CT 13. 732 15. 691 0. 278 1. 280
表 4 方差分析 (显著性检验)
Tab. 4 Variance analysis chart (significance test)
方差来源 离均差平方和 自由度 方差 F值 显著性
A 13. 732 2 6. 866 10. 724 *
B 15. 691 2 7. 846 12. 254 *
C 0. 278 2 0. 139 0. 217
D 1. 280 2 0. 640
3 讨论
本实验综合考虑静态吸附解吸与动态吸附两方
面对大孔吸附树脂纯化贯叶连翘提取物的影响，在
静态筛选大孔吸附树脂实验中，HPD － 600 大孔吸
附树脂的静态饱和吸附量较高为 1. 353 8 mg /g，静
态解析率却较低，说明 HPD －600 对金丝桃素的保
留能力过强，较难洗脱;而 D101、CAD － 45 的静
态解析率较高，静态饱和吸附量却较低，说明此两
类树脂极性较大，保留金丝桃素的能力较弱，均不
适于纯化贯叶连翘提取物。而 SLA － 10 大孔吸附
树脂既对金丝桃素具有较大吸附量，又且易吸附、
易解吸，其静态饱和吸附量为 1. 924 0 mg /g，静态
洗脱率为 98. 9%，动态比柱量为 1. 954 2、比吸附
量为 1. 927 0、比洗脱量为 1. 768 2，可较高效的纯
化金丝桃素。在 LSA － 10 型大孔吸附树脂纯化前，
贯叶连翘提取物中金丝桃素量为 0. 38%，经其纯
化后，金丝桃素量高于 1. 5%，表明 LSA － 10 适合
于贯叶连翘金丝桃素的纯化，且其最佳工艺条件为
LSA －10 型大孔吸附树脂纯化贯叶连翘提取物，以
层析柱半径与柱高比为 1 ∶ 20;药液浓缩比为 1 ∶
1，药液上样体积流量为 2 BV /h，4 BV 蒸馏水、
3 BV 20% 乙醇为除杂洗脱溶剂，收集 8 BV 的
70%乙醇洗脱液，减压回收，真空干燥，即得纯化
的贯叶连翘提取物。
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