全 文 ：分离与提取
2011年第 37卷第 5期(总第 281期) 189
星点设计-效应面法优化双水相-超声提取珍珠草多酚
高云涛1，2，蒋进超1，2，张宝通1，2
1(云南民族大学化学与生物技术学院，云南 昆明，650500)
2(国家民委-教育部共建民族药资源化学重点实验室，云南 昆明，650500)
摘 要 利用超声与丙醇-硫酸铵双水相体系耦合对珍珠草多酚进行提取分离，基于单因素实验得到适宜条件:
丙醇体积分数(A)60. 0%、料液比(B)为 1∶ 25. 0(g∶ mL)、超声时间(C)为 30. 0 min、(NH4)2 SO4用量(D)为 0. 35
g /mL。设计了四因素五水平的星点设计-效应面分析对提取条件进行优化，获得的最佳提取条件是:丙醇体积分
数 53. 65%、料液比为 1∶ 23. 97(g∶ mL)、超声时间为 28. 19 min、(NH4)2 SO4用量为 0. 40 g /mL，珍珠草总多酚提取
率 E预测值为 8. 67%，与实验值 E = 8. 72 %(n = 5)相符，优于单因素试验优化结果(8. 61%，n = 5)。
关键词 超声，丙醇-硫酸铵双水相，提取，珍珠草，植物多酚，星点设计，效应面分析
第一作者:博士，教授。
* 云南省社会发展科技计划项目(2007B148M) ;云南省教育厅科
学基金资助项目(06Y195C) ;国家民委 －教育部共建民族药资
源化学重点实验室开放基金项目(MJY07010)
收稿日期:2011 － 03 － 04，改回日期:2011 － 03 － 30
珍珠草，学名叶下珠［1 － 2］(Phyllanthus urinaria
L. ) ，为大戟科袖柑属植物全草，是云南各民族经常
食用或饮用的植物，具有平肝清热、利水解毒和明目
等功效。近年来研究发现，其提取物具有抗乙肝病毒
和保肝作用［3］，是开发前景较好的食疗皆宜的植物。
其所含主要活性成分为没食子酸，短叶苏木酚酸和揉
云实精等植物多酚［4］。植物多酚由于具有抑菌、抑
制肿瘤的形成、抗氧化等活性，日益受到人们关
注［5］。植物多酚常用的提取法有溶剂浸提法、微波
萃取法、酶法提取法、超声提取法等［6］。超声提取法
具有提取效率高，过程温度较低可保持提取物生物活
性等优点［7］。
双水相分离技术(aqueous two phase extraction，
ATPE)是报道较多的新型分离技术［8 － 9］。传统的聚
合物-盐体系使用高黏度聚合物，成本高，不易后续处
理。近年来低级醇-盐双水相水体系受到人们关
注［10 － 11］，该类双水相水体系克服了传统双水相体系
的缺点，过程易放大，易于与其他技术集成［12］。高云
涛等将低级醇-盐双水相与超声提取集成应用于植物
活性成分提取分离 ［13］。
本文将超声波法良好的提取作用与醇-盐双水相
分离体系集成对珍珠草多酚进行提取分离。考虑到
影响因素较多，因素之间可能存在交互作用，研究采
用星点实验设计(central composite design，CCD)［14］，
结合效应面分析法(RSM)［15］对提取工艺进行优化。
CCD采用非线性数学模型拟合，在中心点进行重复
性实验以提高实验精度，预测值更接近真实值，克服
了正交设计和均匀设计等优化法因使用线性数学模
型，精度不够，预测能力较差的不足。
1 实验部分
1. 1 材料与方法
1. 1. 1 材料与试剂
珍珠草全草(西双版纳，干品，购自云南西双版
纳傣医院) ，使用前粉碎至 80 目。
正丙醇，石油醚，硫酸铵，没食子酸标准品(中国
药品生物制品检定所，批号:1100831-200302) ，无水
乙醇，100g /L Al(NO3)3 溶液，50 g /L NaNO2 溶液。
所用试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。
AS3120A超声波清洗器(天津奥特赛恩斯仪器
有限公司) ，旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂) ，
9200 型紫外-可见分光光度计(北京瑞利分析仪器公
司)。
1. 2 实验方法
1. 2. 1 珍珠草多酚的超声提取与双水相分离
丙醇-硫酸铵双水相-超声体系参考文献［13］。
准确称取珍珠草全草粉 2. 00 g 于 100 mL 具塞锥形
瓶中，加入 20 mL 石油醚超声波提取 20 min，以除去
脂溶性成分和叶绿素，过滤，滤渣室温挥发干燥除去
残余的石油醚后加入丙醇与水混合溶液(丙醇初始
体积与水初始体积之比为 0. 6)60 mL，21. 0 g 硫酸铵
形成双水相体系，超声提取一定时间，于分液漏斗中
静置分层，上层丙醇相清液以体积分数 30%乙醇定
DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.2011.05.016
食品与发酵工业 FOOD AND FERMENTATION INDUSTRIES
190 2011 Vol. 37 No. 5 (Total 281)
容，此溶液用于研究珍珠草多酚的提取条件，测定其
中珍珠草多酚含量，计算多酚得率。
在确定多酚提取条件后，在优化的提取条件下提
取珍珠草多酚，取上层丙醇相通过旋转蒸发仪蒸去溶
剂，按固液比 1∶ 20 加入无水乙醇，待丙醇相中残余的
硫酸铵析出完全后，滤去其中固体，继而用旋转蒸发
仪蒸去乙醇，保持于干燥器中真空放置 5 d后备用。
1. 2. 2 叶下珠总多酚含量测定
取一定量 1. 2. 1 中的珍珠草多酚提取液。以酒
石酸亚铁比色法［16］测定总多酚的含量，本文以 100
mg /L没食子酸为标准，测定波长 540 nm，回归方程:
A = 0. 017 9c － 0. 002(r = 0. 999 8) ，式中 c 为总多酚
浓度。
2 结果与讨论
2. 1 提取条件优化
2. 1. 1 多元二次回归模型的建立
选取单因素考察中对珍珠草总多酚提取影响较
大的 4 个因素:丙醇体积分数、(NH4)2SO4 用量、超
声提取时间和料液比，单因素确定的适宜条件是:丙
醇体积分数(A)60. 0%、料液比(B)为 25. 0、超声时
间(C)为 30. 0 min、(NH4)2SO4用量(D)为 0. 35 g /
mL。以这 4 个因素为自变量，珍珠草总多酚提取率
E为因变量，采用星点设计方法进行多元线性回归和
二项式拟合，用效应面法优化工艺条件，并进行预测
分析。
根据星点设计的原理，各因素设置 5 水平，可用
代码值 ± α、± 1，0 表示。对于 4 因素的星点设计 α
= 2. 0，以单因素确定的最佳条件为零水平设计实验
因素水平表，见表 1，实验设计及结果见表 2。
表 1 星点设计因素水平表
因素
水平
－ 2. 0 － 1. 0 0 + 1. 0 + 2. 0
A 40. 0 50. 0 60. 0 70. 0 80. 0
B 10. 0 15. 0 20. 0 25. 0 30. 0
C 10. 0 20. 0 30. 0 40. 0 50. 0
D 0. 15 0. 25 0. 35 0. 45 0. 55
利用 Design-Expert Software 7. 0 软件对表 2 中的
实验数据进行分析后推荐使用“Quadratic”(二次方
程式)的数学模型，进行多元线性回归和二项式拟
合，珍珠草总多酚提取的数学模型如下:
E = － 26. 172 17 + 0. 831 91A + 0. 169 76B －
0. 050 818C + 44. 0765 6D － 2. 406 25 × 10 －3 AB +
2. 140 63 × 10 －3 AC － 0. 274 06AD + 1. 968 75 × 10 －3
BC + 0. 383 13BD + +0. 058 438CD －6. 132 81 × 10 －3
A2 － 5. 156 25 × 10 －3 B2 － 2. 226 56 × 10 －3 C2 －
47. 578 12D2(r = 0. 972 522) (1)
表 2 试验设计及结果
实验号 A B C D 提取率 /%
1 60 20 50 0. 35 8. 30
2 60 20 30 0. 35 8. 78
3 50 25 40 0. 25 6. 08
4 60 10 30 0. 35 7. 78
5 60 20 30 0. 35 8. 78
6 60 20 10 0. 35 7. 43
7 70 25 20 0. 45 7. 45
8 70 15 40 0. 45 7. 78
9 50 15 40 0. 25 6. 12
10 50 25 20 0. 45 8. 30
11 60 20 30 0. 15 6. 40
12 80 20 30 0. 35 6. 80
13 50 15 20 0. 45 7. 85
14 70 25 20 0. 25 6. 63
15 70 15 20 0. 45 7. 43
16 50 25 20 0. 25 6. 60
17 50 25 40 0. 45 8. 20
18 60 20 30 0. 35 8. 70
19 70 15 40 0. 25 7. 53
20 50 15 20 0. 25 7. 10
21 50 15 40 0. 45 7. 33
22 60 20 30 0. 35 8. 70
23 40 20 30 0. 35 5. 80
24 70 25 40 0. 45 7. 78
25 70 15 20 0. 25 7. 58
26 60 20 30 0. 35 8. 78
27 70 25 40 0. 25 7. 30
28 60 20 30 0. 55 7. 30
29 60 20 30 0. 35 8. 80
30 60 30 30 0. 35 8. 70
模型的可靠性可从方差分析及相关系数来考察，
对该回归方程进行回归方差分析(见表 3) ，Prob ＞ F
项表示大于 F 值的概率，模型的显著性分析得 F 值
为 18. 71，Prob ＞ F 项 ＜ 0. 000 1，表明模型高度显著
性，说明模型的可靠性较好，试验设计可靠，模型相关
系数 r = 0. 972 522，进一步说明模型具有较好的可信
度。
同样，D，A2(丙醇体积分数) ，D2 的 F 值分别为
40. 35，123. 76，74. 49，3 项的 Prob ＞ F 项 ＜ 0. 0001，
表明这 3 项对响应值 E 的影响具有高度显著性。而
A，AC，AD，BD，B2，C2 的 Prob ＞ F 值小于0. 050 0
说明这 5 项对响应值 E的影响具有显著性。
分离与提取
2011年第 37卷第 5期(总第 281期) 191
表 3 回归方程的方差分析表
方差来源 自由度 平方和 均方 F 值 P* ＞ F 显著性
模型 14 21. 8 1. 56 18. 71 ＜ 0. 000 1 ＊ ＊
A 1 0. 6 0. 63 7. 51 0. 015 2 *
B 1 0. 1 0. 09 1. 09 0. 313 5
C 1 0. 0 0. 04 0. 43 0. 523
D 1 3. 4 3. 36 40. 35 ＜ 0. 000 1 ＊ ＊
AB 1 0. 2 0. 23 2. 78 0. 116 3
AC 1 0. 7 0. 73 8. 80 0. 009 6 *
AD 1 1. 2 1. 20 14. 42 0. 001 8 *
BC 1 0. 2 0. 16 1. 86 0. 192 7
BD 1 0. 6 0. 59 7. 04 0. 018 *
CD 1 0. 1 0. 06 0. 66 0. 430 8
A2 1 10. 3 10. 32 123. 76 ＜ 0. 000 1 ＊ ＊
B2 1 0. 5 0. 46 5. 47 0. 033 6 *
C2 1 1. 4 1. 36 16. 31 0. 001 1 *
D2 1 6. 2 6. 21 74. 49 ＜ 0. 000 1 ＊ ＊
残差 15 1. 3 0. 08 － －
总变异 29 23. 1
注:* 具有显著性，＊ ＊具有高度显著性。
2. 1. 2 效应面分析
响应面方法(RSM)的图形是特定的响应值 Y 对
应的因素构成的一个三维空间图及在二维平面上的
等高图，可以直观地反映各因素对响应值的影响，从
实验所得的效应面分析图上可以找到它们在反应过
程中的相互作用。
图 1 是丙醇体积分数(A)、料液比(B)、超声时
间(C)、(NH4)2SO4用量(D)对响应值珍珠草总多酚
提取率 E的等高线，从图 1-a、图 1-b 可看出，沿 A 因
素(丙醇体积)向峰值移动，等高线密度明显高于沿
B(料液比) (图 1-a)、C(超声时间) (图 1-b)移动的
密度，这表明，与料液比、超声时间相比，丙醇体积分
数对响应值叶下珠总多酚提取率的贡献大得多。同
样，从图 1-e、图 1-f可知，沿 D 因素(硫酸铵用量)向
峰值移动的等高线密度明显高于沿 B(料液比) (图
1-e)、C(超声时间) (图 1-f)移动的密度，表明与料液
比、超声时间相比，硫酸铵用量对响应值叶下珠总多
酚提取率的贡献更大。而从图 1-c可知，沿 A因素向
峰值移动，等高线密度与 D 因素方向的密度接近，说
明丙醇体积分数与硫酸铵用量对响应值影响相近，图
1-d表明，沿 B因素方向的等高线密度与 C 因素方向
的密度接近，说明料液比与超声时间对响应值影响相
近。
图 2 为丙醇体积分数(A)、料液比(B)、超声时
间(C)、(NH4)2SO4用量(D)对响应值叶下珠总多酚
提取率 E影响的效应面图，由图 2-a ～图 2-f可看出，
在 A、D因素方向，效应面曲线明显较陡，B、C 因素方
向效应面曲线相对较平直，说明 A、D 因素对响应值
E的影响高于 B、C 因素，这与等高线的结果一致。
图 2-c表明，当 A、D 取值较小时，效应面曲线较陡，
说明 A、D取值较小时相互间的交互作用对响应值 E
的影响更大，而图 2-b、图 2-d表明，当 A、B、C 取值较
大时，效应面曲线较陡，说明取值较大时 A与 C、及 B
与 C 相互间交互作用对响应值 E 的影响较大;分别
考查 B与 A、C和 D 的交互作用(图 2-a、图 2-d 和图
2-e) ，B值较大时对响应值 E 的影响较大;而图 2-b、
图 2-d说明在 C与 A、B交互作用中，C值较大时对响
应值 E的影响相对较大。
结合显著性分析(表 3)可知，在所选取的各因素
水平范围内，按照对响应值 E 的影响排序，4 个因素
对响应值 E 的影响的顺序是:D( (NH4)2SO4 用量)
＞ A(丙醇体积分数)＞ B(液料比)＞ C(超声时间) ，
AC(丙醇体积分数与超声时间) ，AD(丙醇体积分数
与(NH4)2SO4 用量)、BD(液料比与(NH4)2SO4 用
量)对响应值珍珠草总多酚提取率 E 的影响存在交
互作用，说明各因素对响应值的影响并非简单线性加
合关系。
2. 2 条件优化、预测与验证
图 2-a ～图 2-f 的效应面开口向下，且随着每个
因素的增大，响应值增大，当响应值增大到极值后，随
着因素的增大，响应值逐渐减小，说明该模型有稳定
点，且稳定点是最大值。
食品与发酵工业 FOOD AND FERMENTATION INDUSTRIES
192 2011 Vol. 37 No. 5 (Total 281)
图 1 丙醇体积分数(A)、料液比(B)、超声时间(C)和(NH4)2 SO4用量(D)对珍珠草总多酚提取率 E影响的等高线图
图 2 丙醇体积分数(A)、料液比(B)、超声时间(C)和(NH4)2 SO4用量(D)对珍珠草总多酚提取率 E影响的效应面图
利用 Design-Expert Software 7. 0 的 Optimization
Choices模块中的 Point Prediction可获得一组响应值最
大的优化条件:丙醇体积分数(A)为 53. 65 %、料液比
(B)为 23. 97、超声时间(C)为 28. 19 min、(NH4)2SO4用
量(D)为 0. 40 g /mL，在优化条件下，珍珠草总多酚提取
率 E预测值为 8. 67 %，参照理论上的优化条件进行验
证试验，试验结果:提取率平均值 E =8. 72 %(n =5)，与
理论提取率接近。与单因素试验确定的最佳条件
(2. 1. 1)进行比较，结果:单因素试验优化提取率平均值
E =8. 61 %(n =5)，由此可见，星点设计-效应面分析的
优化结果优于单因素试验。
3 结 语
研究表明，丙醇体积分数、料液比、超声时间和
(NH4)2SO4用量是影响醇-盐双水相-超声提取珍珠
草多酚的主要因素，4 个因素对响应值 E 的影响的顺
序是:(NH4)2SO4 用量 ＞丙醇体积分数 ＞液料比 ＞
超声时间，各因素对响应值的影响并非简单线性加合
关系，丙醇体积分数与超声时间，丙醇体积分数与
(NH4)2SO4 用量、液料比与(NH4)2SO4 用量对珍珠
分离与提取
2011年第 37卷第 5期(总第 281期) 193
草总多酚提取率 E的影响存在交互作用。CCD 设计
RSM优化获得的最佳条件下的珍珠草总多酚提取率
优于单因素试验结果，能有效提高珍珠草总多酚提取
率，并且能充分考虑到各因素间的相互作用，因此，
CCD设计 RSM应用于中药活性成分的提取分离，有
较好的应用前景值。
参 考 文 献
［1］ 国家中医药管理局《中华本草》编委会编． 中华本草
［M］．上海:上海科学技术出版社，2000:5076．
［2］ 何广新，周进军．珍珠草的生药学研究［J］．中国民族民
间医药杂志，1998(3) :36 － 37．
［3］ 任进余，秦存林．苦味叶下珠、叶下珠的药理作用及其作
用机理［J］．国外医学·中医中药分册，1999，12(2) :3
－ 6．
［4］ 周宇，袁福华，杨连辉，等．叶下珠化学成分的研究进展
［J］．药学实践杂志 2007，25(4) :206 － 209．
［5］ 张德权，台建祥，付勤．生物植物多酚的研究及应用概况
［［J］．食品与发酵工业，2003，25 (6) :52 － 58．
［6］ 欧阳平，张高勇，康保安． 植物多酚的新兴提取技术原
理、应用及前景［J］． 天然产物研究与开发，2003(6) :
563 － 566．
［7］ Ma Yaqin，Ye Xingqian，Hao Yunbin，et al． Ultrasound-as-
sisted extraction of hesperidin from Penggan (Citrus reticu-
lata)peel［J］． Ultrasonics Sonochemistry，2008，15(3) :
227 － 232．
［8］ Karakatsanis A，Liakopoulou-Kyriakide M． Comparison of
PEG / fractionated dextran and PEG /industrial grade dex-
tran aqueous two-phase systems for the enzymic hydrolysis
of starch［J］． Journal of Food Engineering，2007，80(4) :
1 213 － 1 217．
［9］ Natália Luiza Penna Dallora，Joo Gabriel Degam Klem et
al． Partitioning of model proteins in aqueous two-phase sys-
tems containing polyethylene glycol and ammonium carba-
mate［J］． Biochemical Engineering Journal，2007，34(1) :
92 － 97．
［10］ Liu Xiaohai，Gao Yuntao，Tang Runsheng，et al． On the
extraction and separation of iodide complex of cadmium
(II)in propyl-alcohol ammonium sulfate aqueous bipha-
sic system［J］． Separation and Purification Technology，
2006，50(2) :263 － 266．
［11］ 施跃坚，高云涛．金(Ⅲ)在双水相体系中的分配行为
及萃取机理研究［J］． 云南民族大学学报:自然科学
版，2009，18(4) :344 － 347． ．
［12］ 林东强，朱自强，姚善泾，等．生化分离过程的新探索双
水相分配与相关技术的集成化［J］．化工学报，2000，51
(1) :1 － 6．
［13］ 高云涛，付艳丽，李正全，等．超声与双水相体系耦合提
取芒果核多酚及活性研究［J］．食品与发酵工业，2009，
35(9) :164 － 167．
［14］ Rosa P A J． Application of central composite design to the
optimisation of aqueous two-phase extraction of human an-
tibodies［J］． Chromatogr A，2007，1 141 (1，2) :50 － 60．
［15］ Paquot M，Blecker C，Attia H． Optimization of pectin ex-
traction from lemon by-product with acidified date juice u-
sing response surface methodology［J］． Carbohyd Poly-
mer，2008，74(2) :185 － 192．
［16］ 许 陈．法桐落叶中植物多酚的测定与提取研究［D］．
南京:南京理工大学，2006:14 － 15．
Optimization of Ultrasound-assisted Aqueous Two-phase Extraction
of Polyphenols from Phyllanthus urinaria L． by Central Composite
Design and Response Surface Methodology
Gao Yun-tao1，2，Jiang Jin-chao1，2，Zhang Bao-ton1，2
1(School of Chemistry and Bio-technology，Yunnan University of Nationalities，Kunming 650500，China)
2(Key Lab of National Medicine Supported Jointly by State Ethnic Affairs Commission and Ministry of Education，
Kunming 650500，China)
ABSTRACT Ultrasound-assisted propyl alcohol ammonium sulfate aqueous two-phase extraction of polyphenols from
Phyllanthus urinaria L． was investigated． The best condition for the single factor experiment was:propyl-alcohol con-
centration 60. 0%，liquid /solid ratio B 25. 0，extraction time C 30min． A Response surface methodology，with a five
levels，four variables central composite designs was applied based on the single factor optimization experiment． The
best condition was:propyl-alcohol concentration 53. 65%，liquid /solid ratio 23. 97，extraction time 28. 19 min，and
ammonium sulfate concentration 0. 40 g /ml． An experimental extraction yield of 8. 72 %(n = 5)was achieved under
the optimal extraction which was very close to the optimal prediction extraction yield (8. 67 %) ，and was higher than
that of single factor optimization experiment(8. 61 %，n = 5)．
Key words ultrasonic，propy1-alcohol ammonium sulfate aqueous two-phase，extraction，Phyllanthus urinaria，poly-
phenols，L．，central composite design，response surface methodology