全 文 ：土霉素对白网纹草组织培养中污染菌的抑制作用
梁明勤 ,梁新安 ,申顺先 ,李庆伟
(河南农业职业学院,河南中牟451450)
摘要:在白网纹草组织培养中 ,为了降低污染 ,提高成活率 ,在初代培养基中加入不同浓度的土霉素来抑
制污染菌的生长。结果表明 ,在白网纹草初代培养基中加入20 ～ 30mg/L 的土霉素 ,污染率降低 25个百
分点以上 ,成活率则提高 10个百分点以上。对杂菌分离培养共发现细菌 9种 ,真菌19种 ,其中肠杆菌 、
毛霉和交链孢霉是主要的污染菌。
关键词:土霉素;白网纹草;污染;抑制
中图分类号:S682.36　　文献标识码:A　　文章编号:1004-3268(2007)04-0096-03
Inhibitory Effects of Oxytetracycline on Pollutant
Bacteria during Fittonia Verschaffelti Tissue Culture
LIANG Ming-qin ,LIANG Xin-an ,SHEN Shun-xian ,LI Qing-wei
(Henan College of Agricultural Vocation , Zhongmu 451450 , China)
Abstract:The different concentrations of oxytetracycline were added to the first generation tissue culture
medium samples of Fittonia verschaffelti to restrain pollutant bacteria.The experimental results show ed
that adding 20～ 30mg/L oxytet racycline to the culture medium reduced the pollution rate by more than 25
percentage point and the survival rate increased by more than 10 percentage point.9 kinds of bacteria and 19
kinds of fungus were isolated from the infectious microbes , in which Enterobacterium , Mucor and Alternar-
ia were the dominant.
Keywords:Oxytetracycline;Fittonia verschaffelti ;Pollution;Inhibition
　　污染在植物组织培养过程中是一个很普遍的现
象 ,因污染而导致试验失败的现象经常发生。污染主
要是由细菌和真菌引起的[ 1] ,外植体带菌就是一个重
要原因。邢震等[ 2]对野外直接采用的外植体和经室内
黄化处理的外植体组织培养效果对比分析发现 ,经黄
化处理的外植体污染率低 ,但分化明显没有野外直接
采用的外植体强。对于植物中的内生细菌 ,由于潜伏
较深 ,表面灭菌方法无法将其消除 ,随着培养时间的增
加 ,会慢慢表现出来[ 3] 。周俊辉等[ 4] 对玛丽安万年青
采用减压灭菌 ,利用减压抽走植物组织中的气体使消
毒剂更易进入植物内部 ,从而增强杀菌效果 ,使污染率
明显降低。有人也在培养基中添加抗菌素等措施防止
和减少污染[ 5] 。由于网纹草表面有绒毛 ,在建立网纹
草快繁体系时 ,极易污染 。为了提高成活率 ,减少污
收稿日期:2006-12-10
作者简介:梁明勤(1975-),男 ,河南南阳人,助理讲师 ,本科 ,主要从事植物组织培养方面的研究。
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2007年第 4期
DOI :10.15933/j.cnki.1004-3268.2007.04.031
染 ,在初代培养基中加入土霉素来抑制污染菌的生长 ,
并探讨土霉素对网纹草生长的影响。
1　材料和方法
1.1　材料
试验材料采自河南农业职业学院花木中心 ,以白
网纹草新梢茎段作为外植体。试验于2005年8月在河
南农业职业学院生物技术中心进行 ,杂菌鉴定在河南
农业职业学院微生物实验室进行。
1.2　消毒与接种
剪取白网纹草嫩芽茎段 ,去掉叶片 ,在自来水下冲
洗30min ,然后在肥皂水中浸泡5min ,并用软毛刷轻轻
刷洗茎段表面 ,再用自来水冲洗干净。在无菌环境条
件下 ,用无菌水将材料冲洗 3遍 ,用 70%～ 75%的酒精
溶液表面灭菌 30s ,然后用 0.1%升汞溶液浸泡 8min ,
无菌水冲洗 6 ～ 8次。及时切除材料两端和灭菌剂接
触的部分 ,剪成单芽茎段分别接种在培养基中 ,每瓶2
个茎段。
1.3　培养基及培养条件
培养基以 MS培养基为基础培养基 ,激素浓度为
6-BA 0.1mg/L ,土霉素浓度分别为 20 ,30 ,40 ,50 ,70 ,
100mg/L ,以不加土霉素的处理为对照(ck)。培养温度
25 ～ 28 ℃,光照强度2000～ 3000lx ,光照时间12h/d。
1.4　统计分析
细菌菌斑表面湿润 、光滑 ,呈黏液状物 ,真菌菌斑
周围不整齐 ,表面粗糙絮状[ 1] 。接种后每 5d统计一次
细菌和真菌污染率(污染率=污染茎段数/接种茎段总
数);10 d后每 5d统计一次白网纹草芽的萌发和生长
情况 ,最后统计成活率(芽萌发且无污染)。
1.5　杂菌分离鉴定
将污染的杂菌进行分离培养 ,采用平板划线分离
鉴定 ,细菌用牛肉膏蛋白胨培养基培养 ,真菌用马铃薯
葡萄糖培养基培养。分别配制 2种培养基 ,趁热倒在
培养皿中制成平板 ,然后经 121℃高压蒸汽灭菌
30min。在无菌条件下 ,用接种环蘸取细菌菌苔在平板
表面进行划线 ,用接种钩轻轻挑取真菌菌丝在平板上
划线。将接种的培养皿倒置 ,放在 28 ℃的恒温培养箱
中培养 2d ,然后对单个菌落用斜面培养基进行纯化培
养 ,把分离得到的纯菌种用显微镜观察鉴定。
2　结果与分析
2.1　杂菌种类的鉴定
对细菌的分离培养共得到 4个属 9种(表 1),其中
肠杆菌属比例最大 ,共 5个种 ,占 55.6%,假单胞菌属
次之 ,占22.2%。真菌污染主要是由霉菌引起的 ,共分
离得到7个属 19种(表 2),其中毛霉属和交链孢霉属
占 63.2%。在培养中还发现 ,肠杆菌属是细菌中最先
污染的 ,毛霉属和交链孢霉属是真菌中最先污染的 ,说
明这 3种菌对土霉素有较强的抵抗作用。
表 1　细菌种类鉴定
细菌属名 菌种数 占细菌总数比例(%)
肠杆菌属(Enterobacterium) 5 55.6
假单胞菌属(Pseudomonas) 2 22.2
链球菌属(S treptococcus) 1 11.1
芽孢杆菌属(Brevibacterium) 1 11.1
合计 9 100
表 2　真菌种类鉴定
真菌属名 菌种数 占真菌总数比例(%)
毛霉属(Mucor) 6 31.6
交链孢霉属(Alternar ia) 6 31.5
镰刀菌属(Fusarium) 2 10.5
青霉属(Penici llium) 2 10.5
丝核菌属(Rhizoctonia) 1 5.3
根霉属(Rhizopus) 1 5.3
曲霉属(Aspergi llus) 1 5.3
合计 19 100
2.2　土霉素对细菌的抑制作用
从表3可以看出 ,在培养初期 ,添加不同浓度土霉
素的培养基污染率均低于对照。接种 10d后 ,污染率
都有较快的增长 ,培养25d时 ,添加土霉素的污染率均
等于或低于22.5%,此对照(50.0%)降低 25个百分点
以上 ,说明土霉素对细菌有较强的抑制作用。随着土
霉素浓度的增加 ,污染率明显降低。
表3　土霉素对细菌的抑制作用
浓度
(mg/ L)
接种茎段
(个)
污染率(%)
5d 10d 15d 20d 25d
20 40 2.5 10.0 17.5 22.5 22.5
30 40 5.0 10.0 12.5 17.5 20.0
40 40 2.5 7.5 10.0 15.0 15.0
50 40 0.0 5.0 5.0 5.0 7.5
70 40 0.0 0.0 0.0 2.5 2.5
100 40 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
ck 40 15.0 35.0 37.5 42.5 50.0
2.3　土霉素对真菌的抑制作用
由表4可以看出 ,土霉素对真菌的抑制效果比较
好 ,培养5 d后 ,污染率也只有 2.5%,明显比对照低。
20d后污染率不再增加 ,而添加土霉素的培养基污染率
均等于或低于15.0%,比对照(40.0%)降低 25个百分
点以上 ,且随着土霉素浓度的增加 ,污染率也逐渐
降低。
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河南农业科学
表 4　土霉素对真菌的抑制作用
浓度
(mg/ L)
接种数
(个)
污染率(%)
5d 10d 15d 20d 25d
20 40 2.5 12.5 15.0 15.0 15.0
30 40 0.0 7.5 10.0 10.0 10.0
40 40 2.5 7.5 10.0 12.5 12.5
50 40 0.0 5.0 5.0 7.5 10.0
70 40 0.0 0.0 2.5 5.0 5.0
100 40 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
ck 40 10.0 25.0 35.0 40.0 40.0
2.4　土霉素对白网纹草芽萌发和生长的影响
从表 5可以看出 ,不同浓度的土霉素对白网纹
草芽的萌发和生长影响较大 , 添加 20mg/L 和
30mg/ L 土霉素的培养基茎段生长正常 ,成活率分
别达到20.0%和 22.5%,比对照(10.0%)提高 10
个百分点以上。随着土霉素浓度的增加 ,网纹草芽
的萌发推迟 ,生长缓慢 ,并且出现褐化和死亡现象。
在培养中还发现 ,添加土霉素的培养基无玻璃化苗 ,
而在对照中发现有玻璃化苗 ,说明土霉素对防止玻
璃化苗有一定的作用。
表 5　土霉素对白网纹草茎段萌芽的影响
浓度
(mg/ L)
接种数
(个)
单芽茎段萌发率(%)
10d 15d 20d 25d
芽成活率
(%) 芽生长情况
20 40 2.5 5.0 12.5 25.0 20.0 生长正常
30 40 2.5 5.0 10.0 22.5 22.5 有稍微褐变现象
40 40 2.5 2.5 7.5 15.0 12.5 有褐变现象 ,生长稍慢
50 40 0.0 0.0 2.5 2.5 2.5 有褐变和死亡现象 ,生长慢
70 40 0.0 0.0 2.5 2.5 2.5 半数褐变死亡
100 40 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 全部褐变死亡
ck 40 5.0 7.5 15.0 27.5 10.0 有玻璃化现象
总之 ,在培养基中添加 20 ～ 30mg/L 的土霉素芽成
活率最高 ,且对网纹草芽的生长影响不大。
3　讨论
在对一些珍贵而稀少的植物资源进行组织培养
时 ,提高外植体成活率 、降低污染率非常重要 。用高
浓度的杀菌剂处理外植体 ,在降低污染率的同时 ,也
降低了成活率 ,相反 ,较低浓度的杀菌剂虽然成活率
高 ,但污染率也高 ,最终都可能导致试验失败或工厂
化生产的时间延迟。
在培养基中添加合适的抗生素 ,可以抑制污染
菌的生长 ,提高成活率。不同植物对不同抗生素具
有不同的耐受浓度 ,高浓度的抗生素一般都会对植
物产生伤害作用[ 5 , 6] 。我们也发现同样存在这种情
况 ,随着土霉素浓度的增加 ,培养基出现不同程度的
褐变和材料死亡现象 ,但对照并没有出现褐变及死
亡 ,反而出现了玻璃化苗 ,而添加土霉素的没有产生
玻璃化现象 ,具体机理有待于进一步探索。
在建立白网纹草组织培养快繁体系时 ,由于污
染而成活率非常低 ,为了提高成活率 ,我们在初代培
养基中添加不同浓度的土霉素 ,结果表明 ,在网纹草
培养基中添 20 ～ 30mg/ L 的土霉素对污染菌的生
长有一定的抑制作用 ,污染率比对照低 25个百分点
以上 ,而对网纹草芽的萌发和生长影响不大 ,并且成
活率也远高于对照 。将污染的杂菌进行分离培养共
发现细菌和真菌 11个属 28种 ,在白网纹草组织培
养中应重点防治肠杆菌属 、毛霉属和交链孢霉属的
污染。
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