全 文 ：2008 , Vol.25 No.8化学与生物工程
Chemistry &Bioengineering64　
收稿日期:2008-03-20
作者简介:孙海燕(1985-),女 ,吉林辽源人 , 硕士研究生 ,研究方向:发酵工程;通讯联系人:宫衡 , 教授。 E-mail:shy311121@163.
com , gongheng@ecust.edu.cn。
一种检测桅子蓝生成反应进程的新方法
孙海燕 ,宓　女 ,刘必成 ,付水林 ,宫　衡
(华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室 ,上海 200237)
　　摘　要:桅子苷经 β-葡萄糖苷酶水解 , 生成葡萄糖和京尼平 , 京尼平与氨基酸反应生成桅子蓝。在反应过程中 ,可以
通过检测桅子苷的减少量或葡萄糖的生成量而达到检测反应进程的目的。采用分光光度法和葡萄糖分析仪法分别检测
桅子苷的减少量和葡萄糖的生成量 ,并与高效液相色谱法进行比较。结果发现 ,葡萄糖分析仪法准确 、可靠 、简单 、快捷 ,
可作为检测桅子蓝生成反应进程的新方法。
关键词:葡萄糖分析仪法;分光光度法;高效液相色谱法;栀子苷
中图分类号:O 657.72　　　　　文献标识码:A　　　　　文章编号:1672-5425(2008)08-0064-03
　　栀子蓝色素是以茜草科(Rubiaceae)植物栀子
(Gardenia jasm inoides E ll is)的果实为原料 ,采用生
物工程技术制得的一种安全 、无毒 、无副作用的食用天
然色素[ 1] ,可替代化学合成蓝色素单独使用 ,也可以与
红 、黄类色素调配成绿 、紫 、棕等色调混合使用[ 2] ,从而
在食品 、制药 、化妆品等领域得到了广泛应用 。我国于
1990 年在制定新增食品添加剂的使用卫生标准时将
其列入 ,用于蛋白质 、糖和淀粉等食品染色[ 3] ,具有良
好的社会经济效益[ 4] 。桅子果中的桅子苷经 β-葡萄糖
苷酶水解 ,生成葡萄糖和京尼平 ,京尼平与氨基酸发生
显色反应生成桅子蓝 。通过检测反应过程中桅子苷的
含量 ,可以检测反应进程 。作者在此采用分光光度法 、
高效液相色谱法(HPLC)、葡萄糖分析仪法测定栀子
苷减少量或葡萄糖生成量 ,并进行比较 ,以期找到一种
准确 、可靠 、简单 、快捷的检测反应进程的方法 ,为桅子
蓝生成反应的进一步研究提供参考 。
1　实验
1.1　仪器与试剂
葡萄糖分析仪 ,水浴锅 ,分光光度计 ,超声波振荡
仪 ,真空抽滤仪 。Wate rs 高效液相色谱仪:Waters
2487 DualλAbso rbance Detector;Waters 1525 Bina-
ry HPLC Pump;Waters 717 plus Auto sampler 。
β-葡萄糖苷酶(黑曲霉发酵所得),栀子苷标准品 ,
栀子苷样品(UV >85);乙腈为色谱纯;三乙胺 ,冰醋
酸 ,己烷磺酸钠(PIC-B6), 3 ,5-二羟基甲苯;水为三次
重蒸水。除特别注明外所用试剂均为分析纯 。
1.2　方法
1.2.1　样品的处理
(1)反应体系:准确称取 0.5 g 桅子苷样品(UV>
85),加 100 mL 蒸馏水至浓度为 5 mg ·mL-1 。取该
浓度桅子苷 4 mL ,加 200 U β-葡萄糖苷酶 , 60℃水浴
反应 。分别于 10 min 、30 min 、90 min 、150 min取样 ,
灭活 。
(2)标准品配制:准确称取桅子苷标准品 0.005 g 、
0.025 g 、0.05 g 、0.25 g ,各加 30 mL 纯水 ,混匀后振
摇 10 min ,于超声波水浴振荡 15 min ,加纯水定容至
50 mL 。
(3)内标物配制:准确称取 0.05 g 3 , 5-二羟基甲
苯 ,加 30 mL 纯水 ,混匀后振摇 10 min ,于超声波水浴
振荡 15 min ,加纯水定容至 50 mL 。
反应体系中不同时间所取样品或标准品在进样前
均以 1∶5(体积比)与内标物混合 。
1.2.2　葡萄糖分析仪方法
葡萄糖分析仪用 0.25 mg ·mL-1的葡萄糖标准
溶液定标 ,进样量为 25 μL。分别配制 0.05 mg ·
mL -1 、0.10 mg ·mL-1 、0.15 mg ·mL -1 、0.20 mg ·
mL
-1 、0.25 mg · mL-1栀子苷溶液 ,进样量均为 25
μL。以葡萄糖浓度为纵坐标 、葡萄糖分析仪显示数据
为横坐标绘制标准曲线。
1.2.3　分光光度计方法
在 238 nm 下测反应体系中不同时间所取样品的
孙海燕等:一种检测桅子蓝生成反应进程的新方法/ 2008 年第 8 期 65　
吸光度值 ,以蒸馏水作空白。
1.2.4　HPLC 方法
色谱柱为 Diamonsil C18柱(5 μm ,200 mm ×4.6
mm);流动相:乙腈∶水(含 5 mmol·L -1PIC-B6 、1%
冰醋酸 ,三乙胺调 pH 值为 3.2)=15∶85;流速:1
mL · min-1 ;紫外检测波长:238 nm 、0.04AUFS;
柱温:35℃;进样量:10 μL;3 , 5-二羟基甲苯为内标
物 。
2　结果与讨论
2.1　反应进程的检测
用黑曲霉发酵所得的 β-葡萄糖苷酶催化桅子苷水
解生成京尼平 ,采用 HPLC 法 、分光光度法和葡萄糖
分析仪法测定反应过程中桅子苷的减少量及葡萄糖生
成量 ,结果如图 1所示。
a.HPLC法　b.葡萄糖分析仪法　c.分光光度法
图 1　三种方法测得的桅子蓝反应进程
Fig.1　The reaction of gardenia blue inspected
by three methods
由图 1a 可知 ,前 30 min ,反应迅速;50 min后 ,反
应趋缓;90 min时 ,桅子苷的转化率已高于 70%;随着
反应时间的延长 , 桅子苷的减少趋于平缓;150 min
时 ,桅子苷的转化率已经高于 90%,此时反应已经基
本进行完全。
由图 1还可知 ,由葡萄糖分析仪法所测定的 β-葡
萄糖苷酶催化桅子苷水解生成京尼平的反应曲线
(图 1b)与 HPLC 法测定的反应曲线(图 1a)基本一
致 ,而分光光度法测定的反应曲线(图 1c)却有很大
不同 。
桅子苷酶解后在生成京尼平的同时亦生成葡萄
糖 ,桅子苷的分子式中只有一个葡萄糖残基 ,理论上桅
子苷的消耗量与葡萄糖的生成量应符合 1∶1的关系。
对 HPLC法测得的桅子苷减少量与葡萄糖分析仪法
测得的葡萄糖生成量进行比较(表 1),结果与理论推
测基本相符。
表 1 HPLC法与葡萄糖分析仪法的比较
Tab.1 The comparison between HPLCmethod
and glucose analyzer method
反应时间/min 10 30 90 150
(HPLC法)桅子苷减少量/mol 0.001337 0.009802 0.016609 0.020743
(葡萄糖分析仪法)葡萄糖生成量/mol 0.001 0.009889 0.017222 0.020278
2.2　三种方法所测转化率比较
根据桅子苷与葡萄糖摩尔比为 1∶1的关系 ,将葡
萄糖的生成量折算成桅子苷的减少量 ,比较三种方法
测定的桅子苷转化率 ,结果见表 2。
表 2　 三种方法测定的桅子苷转化率比较
Tab.2 The comparison of conversion rate
of gardenoside determined by three methods
反应时间/min 10 30 90 150
HPLC法/ % 5.9 43.3 73.4 91.6
葡萄糖分析仪法/ % 4.8 43.7 76.1 89.6
分光光度法/ % 7.6 24.9 61.6 85.4
由表 2可见 ,分光光度法虽然操作简单但误差较
大 ,结果并不可靠;葡萄糖分析仪法不但操作简单快捷 ,
而且准确可靠 ,不仅可以检测桅子苷水解反应的进程 ,
还可为桅子蓝生成反应的进一步研究提供参考。
2.3　葡萄糖分析仪方法精密度实验
取反应 10 min的样品连续进样 5次 ,考察其葡萄
糖含量是否一致 ,结果见表 3。
表 3　 精密度实验结果(n=5)
Tab.3 The results of precise experiments(n=5)
进样号 1 2 3 4 5 平均值
葡萄糖含量/mg 0.185 0.180 0.187 0.177 0.189 0.1836
2.4　葡萄糖分析仪方法回收率实验
取已测定葡萄糖含量的反应 10 min的样品 ,准确
定量添加葡萄糖标准品。采用葡萄糖分析仪方法测定
回收率 ,结果见表 4。
表 4 回收率实验结果(n=5)
Tab.4 The results of recovery experiments(n=5)
编号 样品中葡萄糖含量
mg
加入葡萄糖量
mg
回收率
%
平均回收率
%
1 0.185 0.15 99.35
2 0.180 0.15 100.03
3 0.187 0.15 99.13 99.46
4 0.177 0.15 99.27
5 0.189 0.15 99.50
孙海燕等:一种检测桅子蓝生成反应进程的新方法/2008 年第 8 期66　
2.5　讨论
(1)由于桅子苷水解反应迅速 ,反应体系定时取样
的时间应尽量准确 ,取样后均用沸水煮 10 min达到灭
活目的 ,以防止反应继续进行 。
(2)内标物的物理化学性质要求与被分析物质相
似 ,应能完全溶解于被测样品(或溶剂)中 ,并且不与被
测样品发生化学反应。3 ,5-二羟基甲苯的极性 、化学
结构和桅子苷相似 ,并且溶解于桅子苷水解的反应液
中 ,而水解产物不含 3 , 5-二羟基甲苯 ,所以选取 3 , 5-
二羟基甲苯作为内标物。
3　结论
采用葡萄糖分析仪法 、分光光度法 、高效液相色谱
法检测栀子苷反应进程 ,并对其进行了比较 。结果表
明 ,葡萄糖分析仪法准确 、可靠 、简单 、快捷 ,不但能检
测反应的进程 ,更可为桅子蓝生成反应的进一步研究
提供参考 。
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A Novel Method to Inspect the Synthetic Reaction of Gardenia Blue
SUN Hai-yan ,MI Nǜ , LIU Bi-cheng ,FU Shui-lin ,GONG Heng
(S tate Key Laboratory of B ioreactor Engineering ,East China Universi ty o f
Science and Technolog y ,S hanghai 200237 ,China)
Abstract:Gardeno side from gardenia f ruit is hydrolyzed by β-gluco sidase to produce g lucose and genipin.
Genipin becomes gardenia blue w hen i t is reacted w ith amino acids.During the reaction , the reducing of g arde-
noside and the increasing o f gluco se can be detected to inspect the reaction.In this article , spect ropho tometry
and g lucose analy zer are used to detect g ardeno side and gluco se , and the results are compared to that of HPLC.
The resul ts show g lucose analy zer method is credible and convenient enough to be a novel method to inspect the
synthe tic reaction of g ardenia blue.
Keywords:g lucose analyzer;spect ropho tome try ;HPLC;gardenoside
(上接第 54页)
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Extraction and Identification of Polyhydroxyalkanoate from Bacillus Cereus
Lǜ Zao-sheng , ZHANG Min ,LI Ling-l ing ,LI Zheng
(Collegeo f Chemical Eng ineering and Technology ,Wuhan Universi ty o f Science
and Technolog y ,Wuhan 430081 ,China)
Abstract:Po lyhydroxyalkanoate(PHA)was ex tracted by SDS-N aClO cell broken pret reatment and chlo ro-
fo rm extraction.It w as studied that the si tuation of PHA accumula tion in Baci l lus cereus PH1 when buty ric
acid , valeric acid , capry lic acid , decanoic acid , arachis oil w ere added into the strain cul ture as supplemental car-
bon source.The result show ed that the amount of PHA extraction w ith decanoic acid as the supplemental car-
bon source w as the largest and its e xt ract ion rate w as up to 51.2%.T he ext racted samples of PHA from the
culture w ith dif ferent supplement fat ty acids or lipids as carbon source we re ident ified and analyzed by inf rared
spect rum and gas chromatog raphy , and i t w as found that al l the samples contained polyhydrobuty rate.
Keywords:polyhydroxyalkanoate(PHA);Baci l lus cereus;microorg anism synthesis