全 文 ：野大豆群体DNA随机扩增产物的限制性内切酶消化
魏　伟 　钟　敏　王洪新　恽　锐　胡志昂 　钱迎倩
(中国科学院植物研究所　北京　100093)
摘要　为了提高 RAPD 方法检测野大豆(Glycine soja L.)群体 DNA 多态性的能力 , 随机扩增产物用限
制性内切酶(MspⅠ 、HinfⅠ 、TaqⅠ 、EcoRⅠ 、SalⅠ 、Dra Ⅰ和 HaeⅢ)消化 ,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分
离后用银染法检测酶切产物 ,结果发现:1.有的限制性内切酶能够消化野大豆群体 DNA 的随机扩增产
物 ,有的却不能。 2.有的限制性内切酶消化无 RAPD个体的扩增产物后能够产生多态性 DNA 片段 , 有
的内切酶不能产生。 3.有的引物的无 RAPD 个体的扩增产物经限制性内切酶消化后能够产生多态性的
DNA片段;有的引物的扩增产物虽然可被内切酶消化 , 但不能够产生多态性 DNA 片段。实验证明 , 用
限制性内切酶消化扩增产物 ,确实能够提高 RAPD方法检测野大豆群体 DNA 多态性的能力。
关键词　随机扩增多态性 DNA ,限制性内切酶 , 多态性 DNA片段 , 野大豆群体
RESTRICTION ENDONUCLEASE DIGESTION OF AMPLIFICA-
TION PRODUCTS GENERATED BY RAPD TECHNIQUE IN
A POPULATIONOF GLYCINE SOJA
WEI Wei 　ZHONG Min　WANG Hong-Xin　YUN Rui　HU Zhi-Ang 　QIAN Ying-Qian
(Insti tu te of Botany , The Chinese Academy of Sciences , Beijing 100093)
Abstract　In a population of Glycine soja L., the polymo rphic loci could be hardly detected
by RAPD markers , using several primers.These non-polymorphic amplification products
w ere cleaved by some rest riction endonuclease , such as Msp Ⅰ , Hin f Ⅰ , Taq Ⅰ , EcoRⅠ ,
Sal Ⅰ , Dra Ⅰ and HaeⅢ.After cleaving , the digested amplif ication products w ere detected
on polyacry lamide gel elect rophoresis w ith silver staining .It w as found that:1)some re-
st riction endonucleases could not , and some others could ef fectively digest the random ampli-
cation products of the DNAs of G.soja;2)some endonucleases could produce polymorphic
DNA fragments af ter digestion of the non-polymorphic products , but others could not even
af ter digestion;3)non-polymo rphic amplification products amplified by some primers could
produce polymo rphic DNA fragments after digestion , while those by other primers could
not.It could be concluded that the restriction endonuclease digestion of amplification prod-
ucts could increase significantly detectability of polymo rphic DNA by RAPDs technique.
Key words　Random amplif ied polymo rphic DNA , Restriction endonuclease , Polymorphic
DNA fragment , Population of Glycine soja
目前 ,检测植物群体遗传多样性的分子标记主要有限制性片段长度多态性(RFLP)以


通讯联系人。Author for correspondence.
收稿日期:1996-10-04　接受日期:1997-03-04
现在地址:中国农业大学生物技术系 ,北京 100094。 Present address:Department of Biotechnology , China Agricul-
ture University , Beijing 100094.
中国科学院“八·五”基础性研究重点课题资助。 Supported by a Key Program of the Eighth Five Years in Basic
Research of the Chinese Academy of S ciences.
植　物　学　报　1998 , 40(5):412 ～ 416
Acta Botanica Sinica
及基于DNA扩增技术的随机扩增多态性 DNA(RAPD)、随机引物 PCR(AP-PCR)和 DNA
扩增指纹(DAF)等。RFLP 是利用限制性内切酶能够识别专一的碱基序列这一特点 , DNA
序列变异导致酶切位点的消失或增加 ,因而表现在限制性片段长度的变化上 。Caetano-
Anollés[ 1]将那些基于 DNA扩增技术的分子标记概括为多种随机扩增谱(MAAP),认为用
多种限制性内切酶消化模板 DNA 或随机扩增产物可以显著增加 MAAP 的DNA多态性 。
可以说 ,Caetano-Anollé s的这种方法是 RFLP 标记和 MAAP 标记的有机结合 。前文[ 2]报
道了野大豆群体 RAPD的研究。有的引物的扩增产物 DNA 多态性很低甚至是单态的 。我
们试图通过限制性内切酶消化这些随机扩增产物来提高 RAPD 标记检测野大豆群体
DNA多态性的能力 ,以便更好地研究野大豆群体的遗传分化 。
1　材料和方法
1.1　材料
用前文[ 2]研究中所提取的野大豆(Glycine soja L .)基因组 DNA及其随机扩增产物 。
1.2　扩增产物限制性内切酶消化
根据前文[ 2]随机扩增产物的检测结果 ,选取无多态位点即没有 RAPD个体的扩增产
物作为酶切对象 。限制性内切酶包括 Msp Ⅰ(10 U/μL)、Hinf Ⅰ(10 U/μL)、Taq Ⅰ (10
U/μL)、EcoRⅠ(10 U/μL)、Sal Ⅰ(20 U/μL)、Dra Ⅰ(16 U/μL)和 Hae Ⅲ(16 U/μL)。酶
切参考 Caetano-Anollés等[ 3]的方法 ,略加修改。酶切反应液总体积为 20 μL ,其中扩增产
物2μL 、限制性内切酶 1μL(10 ～ 20 U/μL)、相应的10倍反应缓冲液2 μL ,以及15μL去
离子水 ,混匀后 ,37 ℃水浴保温 1.5 ～ 3 h(保温时间依酶的不同而有所不同)。
1.3　酶切结果的检测
同前文[ 4] ,用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后银染显示。
2　结果和分析
我们选取引物 OPD03 、OPD05 、OPD04 、OPD07 、OPD11 、OPD15和 OPD18的随机扩
增产物作为酶切对象 ,选择无 RAPD个体(表 1)的扩增产物酶切后与酶切前对照 。本实验
所用到的几种限制性内切酶如表 2所示 ,它们在上述 7种引物中没有切口 。
表 1　扩增引物序列及无 RAPD 的个体
Table 1　Sequences of arbitrary primers and individuals of non-RAPDs
Primer S equence　　　 Individuals of non-RAPDs　　　
OPD03 5′-GTCGCCGTCA-3′ ①1)4-14 , 4-16 , 4-192);②4-1 , 4-3 , 4-8 , 4-9 , 4-10
OPD05 5′-TGAGCGGACA-3′ 4-9 , 4-10 , 4-12 , 4-14 , 4-15 , 4-19 , 4-20
OPD04 5′-TCTGGTGAGG-3′ ①4-8 , 4-17;②4-10 , 4-11 , 4-12 , 4-14
OPD07 5′-TTGGCACGGG-3′ 4-1 , 4-3 , 4-5 , 4-8 , 4-11 , 4-17 , 4-18
OPD11 5′-AGCGCCAT TG-3′ 4-8 , 4-12 , 4-11 , 4-17
OPD15 5′-CATCCGTGCT-3′ ①4-8 , 4-18;②4-10 , 4-11 , 4-14 , 4-17
OPD18 5′-GAGAGCCAAC-3′ 4-8 , 4-9 , 4-11 , 4-12 , 4-14
1)A group of individuals that have no RAPD;2)Symbols for individuals.
根据酶切结果看 , Taq Ⅰ 、Dra Ⅰ没有消化扩增产物 ,其它 5种酶都较好地消化了扩增
产物 ,说明扩增产物中可能没有 Taq Ⅰ和 Dra Ⅰ的识别序列 ,而具有其它 5种限制性内切
5 期 魏　伟等:野大豆群体 DNA 随机扩增产物的限制性内切酶消化 413　
酶的识别序列。
各种限制性内切酶消化扩增产物产生新的片段数量不一样 ,这与该种扩增产物中各
种内切酶的识别序列存在的情况有关。一般来讲如果源 DNA 是环状的(如脊椎动物的线
粒体基因组),消化片段的数量等于限制性位点的数量。但是 ,实际情况往往不是这样 ,限
制性位点数目的真实统计要通过对限制性位点作图来完成 。通常 ,如果所研究的序列是完
整的 ,那么我们就可以通过产生消化片段的数目来统计限制位点的数目[ 5] 。由于随机扩
增产物一般是线性的 ,我们可以做这样一个假设 ,本实验所研究的限制性位点的数目等于
新产生限制性消化片段的数目减 1。根据实验结果 ,我们给出了扩增产物中存在各种内切
酶识别序列的情况(表 2)。从表 2可以看出 ,限制性内切酶 Hae Ⅲ对野大豆群体 DNA的
随机扩增产物的识别位点最多(平均 10个), Sal Ⅰ较少(平均 1 个),Taq Ⅰ和Dra Ⅰ则没
有(为零)。
表 2　本实验所用到的几种限制性内切酶及其识
别序列
Table 2　The restriction endonucleases and its recogni-
tion sequences
Rest riction
endonucleases
Recognition
sequences
Mean of numbers
for recogni tion loci
Dra Ⅰ T TT←AAA 0
EcoRⅠ G←AATTC 6
HaeⅢ GG←CC 10
Hinf Ⅰ G←ANTC 9
MspⅠ C←CGG 8
Sal Ⅰ G←TCGAC 1
TaqⅠ T←CGA 0
野大豆群体中无 RAPD个体的扩增产
物经 5 种限制性内切酶(EcoR Ⅰ 、Hae Ⅲ 、
Hin fⅠ 、Msp Ⅰ和 Sal Ⅰ)消化后的变化见
表 3。在表3中 ,引物 OPD07和OPD18的扩
增产物经多种限制内切酶消化后虽然也有
DNA片段的消失和出现 ,但不能产生多态
性的 DNA 片段 。另外几种引物(OPD03 、
OPD04 、OPD05和 OPD15)的扩增产物经一
定的内切酶消化后却能够产生多态性的
DNA片段 。　　引物 OPD03 、OPD04 、OPD05和OPD15的扩增产物被有的限制性内切酶消化后一些
片段消失了 ,出现了另外一些片段 ,但没有产生多态性的 DNA片段;然而 ,它们的扩增产
物经另外的限制性内切酶消化后 ,伴随一些片段的消失和出现 ,产生了多态性的 DNA片
段。例如 ,引物 OPD03 的扩增产物经限制性内切酶 EcoR Ⅰ消化后 ,没能产生多态性的
DNA片段;但是经 Msp Ⅰ和 Hinf Ⅰ消化后分别产生了多态性的 DNA片段。
扩增产物经限制性内切酶消化 ,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后银染检测DNA多态
图 1　引物 OPD11 的无 RAPD个体
扩增产物被内切酶消化的结果
Fig.1　The restriction endonuclease
dig estion of non-RAPD amplification
products generated by primer OPD11
1～ 3.The amplif icat ion products of individ-
uals 4 ～ 8 , 4 ～ 12 and 4 ～ 17 by primer
OPD11 , respectively;4 ～ 6.The digested
p roducts of lane 1～ 3 by HaeⅢ;7～ 9.The
digested products of lane 1 ～ 3 by Dra Ⅰ ;
10.The amplif icat ion products of individual
4～ 11 by primer OPD11;11.The digested
p roducts of lane 10 by HaeⅢ;12.The di-
gested products of lane 10 by HaeⅢ;
13.λDNA/HindⅢ marker;14.PBR-
332/HaeⅢ marker.
414　 植　　物　　学　　报 40 卷
性的一个例子见图 1。图 1中 ,引物OPD11的无 RAPD个体的扩增产物 ,用内切酶 Dra Ⅰ
消化后看不出多态性的变化(槽 7 ～ 9和 12);但是用 HaeⅢ消化后 ,较大扩增片段消化得
比较完全 ,新出现了 775 bp 、450 bp 、224 bp 、198 bp和 175 bp的消化片段 ,其中 450 bp和
175 bp的片段只出现在个体 4-12的 HaeⅢ消化产物中(槽 5),775 bp的片段则出现在 4-
8 、4-11 、4-17(槽 4 、11 、6)的 HaeⅢ消化产物中。所以在 Hae Ⅲ消化产物的电泳谱上 , 775
bp 、450 bp和 175 bp这 3个位点是多态的。
表 3　限制性内切酶消化扩增产物后的变化
Table 3　The changes of digested amplification products by restriction endonuclease
Primer
Rest rict ion
endonuclease
Disappeared
f ragments(bp)
New emerged
fragments(bp)
Polymorphic
f ragments(bp)
OPD03
Msp Ⅰ ＊ 341 , 372 , 250 , 234 , 217 , 205 , 173 , 155 , 146 , 311 ,
117 , 50 , 45 , 38 341 , 173 , 146
Hin f Ⅰ ＊ 732 , 540 , 288 , 234 , 217 , 205 , 173 , 146 , 138 , 131 ,
117 , 110 , 109 , 70 , 61 288 , 109
EcoRⅠ 846 , 657 450 , 268 , 260 , 142 Non
OPD04
HaeⅢ ＊ 627 , 629 , 587 , 497 , 455 , 370 , 344 , 310 , 306 , 267 ,
242 , 235 , 221 , 209 , 98 209 , 98
EcoRⅠ ＊ 697 , 648 , 527 , 520 , 442 , 399 , 370 , 360 , 297 , 268 ,
242 , 213 , 209 , 191 , 180 , 170 , 119, 98 , 84 Non
OPD05
Msp Ⅰ ＊ 630 , 438 , 406 , 349 , 139 , 124 Non
Hin f Ⅰ ＊ 323 , 311 , 220 , 182 , 134 Non
EcoRⅠ 833 , 502 , 341 434 , 473 , 321 , 124 , 362 362
OPD07
HaeⅢ 1856 , 703 , 465 594 , 555 , 426 , 273 , 229 , 175 , 157, 115 Non
EcoRⅠ 640 , 483 310 , 192 , 184 , 153 , 140 , 123 Non
Sa lⅠ ＊ 476 , 261 Non
OPD11 HaeⅢ 842 , 485 , 379 , 330 775 , 450 , 224 , 198 , 175 775 , 450 , 175
OPD15
HaeⅢ ＊ 685 , 625 , 537 , 434 , 408 , 340 , 315 , 213 , 184 , 163 ,
156 , 124 , 105 , 80 , 64 213
EcoRⅠ ＊ 762 , 786 , 739 , 521 , 505 , 315 , 305 Non
OPD18
HaeⅢ ＊ 625 , 517 , 503 , 476 , 405 , 394 , 325 , 317 , 265 , 205 ,
160
Non
EcoRⅠ ＊ 546 , 427 , 334 Non
Msp Ⅰ 861 , 836 , 680 ,
621 , 507 , 434 810 , 690 , 587 , 457 , 173 , 149 , 129 Non
Hin f Ⅰ 700 , 680 , 621 ,
507 , 434 406 , 394 , 303 , 246 , 168 , 151 , 145, 124 , 113 , 93 Non
＊Fragments that have not been kept count of.
3　讨论
Caetano-Anollés等[ 3]用限制性内切酶 HaeⅢ 、S au 3A 消化大豆的随机扩增产物后 ,
与酶切前相比较 ,只是几条扩增片段的消失以及几条消化片段的出现[ 3] ,电泳谱的基本
模式没有改变。与之稍有不同 ,当我们用限制性内切酶 HaeⅢ 、EcoRⅠ和 Sal Ⅰ消化野大
豆群体 DNA的随机扩增产物后 ,较长的 DNA 扩增片段变化不大 ,主要变化表现在较短
扩增片段(<860 bp)的消失和出现。然而 ,当我们用内切酶 Hinf Ⅰ和 Msp Ⅰ消化野大豆
群体 DNA的随机扩增产物(引物为 OPD03和 OPD05 ,消化结果见表 3)后 ,较长的扩增片
段消失了 ,出现了许多高浓度 、短的消化片段 ,电泳谱的模式完全被改变了(没有照片),与
Caetano-Anollés等[ 3]的描述完全不同。这种不同可能与所用限制性内切酶的量有关 ,本实
5 期 魏　伟等:野大豆群体 DNA 随机扩增产物的限制性内切酶消化 415　
验用 10 ～ 20单位的内切酶消化 2 μL 的扩增产物 ,而 Caetano-Anollés等[ 3]仅用 4个单位
的内切酶来消化 2μL 的扩增产物 。具体的原因和机理有待于进一步研究探讨。
从表 2可以看出 ,扩增产物被识别 4碱基的内切酶消化后新产生的限制性片段最多
(如 HaeⅢ消化后新产生 11个片段),被识别 6碱基的内切酶消化后 ,新产生的限制性片
段最少(如 Sal Ⅰ消化后仅新产生 2条片段)。其原因可能是由于 6碱基内切酶的一般酶
切机率是每4 kb才有一个切点(46=4 kb),而 4碱基的酶切机率是每 256 bp有一切点(44
=256 bp)。
一般来讲 ,酶切前后消失了的扩增片段长度总和与新出现的消化片段总和应该相等 。
但本文中除个别情况下消失的扩增片段与新出现的消化片段长度相差不大(图 1;表 3)
外 ,消失的扩增片段长度与新出现的片段长度总和有较大的差距。这可能有两方面的原
因:1)没有统计较长的扩增片段的消失以及较长消化片段的出现 ,其中后者尤为重要;2)
短的消化片段在电泳谱上没有检测到 ,或者新出现的消化片段的高浓度可以补偿扩增片
段和消化片段间长度的差别 ,即许多较短的消化片段在凝胶上具有相同的迁移率 ,银染显
色后形成高浓度的带 。上述第一点可以通过认真统计较长片段在酶切前后的变化而得到
改正;第二点可以通过改进电泳方法 ,提高电泳的分辨率而使问题得到解决 。
文中的方法和思路也见于某些 RFLP 的研究中 。Williams等[ 6]根据水稻的基因组克
隆序列 ,合成了成对的引物 ,进行 PCR ,然后用若干个识别 4 ～ 6 个碱基序列的限制性内
切酶消化 PCR产物 ,来检测不同品种间的碱基变化或小的插入和缺失 ,取得了满意的结
果。这个方法的主要优点在于它能够避免繁琐的 Southern杂交 ,节约基因组 DNA ,而且还
可以检测出用 Southern杂交所不能检测的 DNA 多态性。在扩增前用限制性内切酶消化
模板 DNA 或在扩增后用内切酶消化扩增产物可以提高 MAAP 检测 DNA 多态性的能
力[ 1 ,3] 。后者在本文中得到证实 。这种 MAAP和 RFLP 的巧妙结合 ,除在遗传多样性的研
究中有重要作用外 ,它还将用在不必了解基因组 DNA 序列的有关信息以及不必消耗大
量基因组 DNA的条件下进行抗性基因 、植物繁育系统以及濒危物种保护的研究中 。
致谢　中国科学院植物研究所徐卫辉博士在洗印照片方面给予热情帮助 ,特致谢忱 。
参 考 文 献
1　Caetano-Anollés G.MAAP:A versatile and universal tool for genome analysis.Plant Mol Biol , 1994 , 25:1011～ 1026
2　Wang Hong-Xin(王洪新), Hu Zhi-Ang(胡志昂), Zhong Min(钟敏), Lu Wen-Jing(陆文静), Wei Wei(魏伟), Yun
Rui(恽锐), Qian Ying-Qian(钱迎倩).Genet ic dif ferentiation and physiological adaptation of w ild soybean(Glycine so-
ja)populations under saline condit ions:isozymatic and random amplified polymorphic DNA study.Acta Bot S in(植物学
报), 1997 , 39:34～ 42(in Chinese)
3　Caetano-Anollé s G , Bassam B J , Gresshof f P M.Enhanced detection of polymorphic DNA by mult iple arbit rary amplicon
profi ling of endonuclease-digested DNA:ident ification of markers t ightly linked to the supernodult ion locus in soybean.
Mol Gen Genet , 1993 , 241:57～ 64
4　Hu Zhi-Ang(胡志昂), Yun Rui(恽锐), Zhong Min(钟敏), Dong Fu-Gui(董夫贵), Wang Hong-Xin(王洪新), Qian
Ying-Qian(钱迎倩).Comparison and improvement of polymorphism ampli fication methods used for detecting DNA di-
versity of plants.Acta Bot S in(植物学报), 1997 , 39:144～ 148(in Chinese)
5　Hoelzel A R , Bancrof t D R.S tatist ical analysis of variation.In:Hoelzel A R eds.Molecular Genetic Analysis of Popula-
tion.London:IRL Press , 1992.
6　Williams M N V , Pande N , Nair S et al.Rest riction fragment length polymorphism analysis of polymerase chain reaction
products amplified f rom mapped loci of rice(Oryza sat iva L.)genomic DNA.Theor App l Genet , 1991 , 82:489～ 498
416　 植　　物　　学　　报 40 卷