全 文 ：收稿　2002-12-02　　　　修定　2003-06-04
资助　黑龙江省教育厅项目(编号:9551093)。
　＊ 　 E-mail:gaoyongchao2003 @ yahoo.com.cn , Tel:0531-
8789300
＊＊　通讯作者(E-mail:shaw eis@china.com , T el:0452-2742571)。
大量元素对牛角藓愈伤组织悬浮细胞的生理效应
高永超1 , 2 , ＊　薛　红1 　沙 　伟1 , ＊＊　张　晗1(1齐齐哈尔大学生命科学与工程学院生物系 , 齐齐哈尔
161006;2山东省科学院生物技术研究中心 , 济南 250014)
提要　以 MS 培养基为基本培养基 ,对牛角藓进行细胞悬浮培养的结果表明 , 大量元素明显促进细胞的生长发育 , 大量元
素浓度越高 ,促进作用越明显。
关键词　牛角藓;大量元素;悬浮培养
Physiological Effect of Major Elements on the Suspended Cells of Cratoneuron
filicinum
GAO Yong-Chao1 , 2 , ＊ , XUE Hong1 , SHA Wei1 , ＊＊ , ZHANG Han1(1Department of Biology , College of Life Science and Engi-
neering , Qiqihar University , Qiqihar 161006;2Biotechnology Research Center , Shandong Academy of Sciences , Jinan 250014)
Abstract　The effects of dif ferent concentrations of majo r elements on the physiological and biochemical char-
acters of the suspended cells of Cratoneuron f il icinum were studied.The results show ed that the major ele-
ments presented obvious effect on the g row th and development of the suspended cells.The ef fect increased
w ith the concentration of major elements.
Key words　Cratoneuron f ilicinum ;majo r element;suspension culture
　　在国外 ,大部分采用植物细胞悬浮培养技术 ,
研究和生产苔藓植物中含有的特殊的次生代谢产
物[ 1] 。人们已对很多苔藓植物(包括苔类 、藓类 、
角苔类)的化学成分作过分析 ,从苔藓植物中分离
到的次生代谢物质中有生物碱 、黄酮 、萜类 、木脂体
以及酚类化合物等[ 2] 。许多苔藓植物中还含有重
要的药用成分 ,如 Asakaw a 等[ 3] 曾从两种苔藓植
物中分离得到具有较强的抗癌活性的美登素类化
合物(may tansinoside 15-methoxyansamitocin)。因
而 ,加强对苔藓植物悬浮培养的研究是十分必要
的。在国内 ,苔藓植物组织培养的研究刚刚起步 ,
苔藓植物配子体组织培养的报道极少 ,直接用苔藓
植物的愈伤组织进行悬浮培养的报道尚未见 。
本文以牛角藓配子体诱导出的愈伤组织为原
料 ,建立了松散易碎 、生长旺盛的悬浮细胞系 ,研究
不同培养基成分对悬浮细胞生长的生理生化特性
的影响 ,以期为今后进行次生代谢产物的生产奠定
基础 。
材料与方法
　　试验材料牛角藓(Cratoneuron f ilicinum)采
于大兴安岭克一河杜鹃山庄 。采集后用无菌土培
养 ,上面覆盖一层塑料膜 ,以保持水分 。
选取室内培养的牛角藓幼嫩的茎段 ,用0.01%
HgCl2灭菌 10 s ,然后用无菌水冲洗 4 ～ 5次。将消
毒后的茎段切成 1 cm 左右的小段 ,接在愈伤组织
诱导培养基(MS+2 , 4-D 2 mg·L-1)上 ,调整 pH
至 5.8 ,每瓶接 3 ～ 4段。在室温 24 ～ 26℃下诱导
愈伤组织 。而后 ,愈伤组织每隔 2周继代 1次。继
代时挑选生长状态良好 、嫩绿色的愈伤组织 。
愈伤组织悬浮培养时选取继代 2次以上 、生长
旺盛 、结构疏松的愈伤组织。用镊子轻轻夹取愈伤
组织(不要带有固体培养基),放在含有不同成分的
50 mL MS 液体培养基中 ,振荡使其制成单细胞悬
浮液 。用灭过菌的吸管吸取 5 mL 悬浮液 ,加入到
45 mL 液体培养基中 ,振荡培养。每 50 mL 培养
基中加约 0.1 g(DW)愈伤组织[ 即 2 g (DW)·
595植物生理学通讯　第 39 卷 第 6 期 , 2003 年 12 月
DOI :10.13592/j.cnki.ppj.2003.06.010
L-1] 。摇床转速为 100 ～ 110 r·min-1 ,室温 、漫射
光下培养 。
悬浮细胞生长量测定用细胞干重法[ 4] 。按公
式:增加干重(ΔGn)=测量干重(Gn)-接种干重
(G0)计算 ,再换算成每升培养基增加的细胞干重
克数(g·L-1),即细胞生长速率。
可溶性蛋白含量按文献 5 、6 的方法测定 。细
胞悬浮液在6 000×g离心 15 min ,弃去上清液 ,取
0.5 g(FW)沉淀物加入 5 mL 预冷的 0.2 mol·L-1
磷酸缓冲液(pH 6.0)冰浴研磨后 ,以 17 000×g离
心 20 min。保留上清液用于测定可溶性蛋白质含
量。取 0.5 mL 可溶性蛋白质提取液 ,加 5 mL 考
马斯亮蓝 ,静置2 min ,用光径为 1 cm 的比色杯 ,以
蒸馏水作空白对照 ,用 721型分光光度计测定 595
nm 处光密度值 , 蛋白质含量以 mg·g -1(FW)表
示。标准曲线以牛血清蛋白为标准绘制。悬浮细
胞中 蛋 白 质含 量 根 据 公 式:蛋 白质 含 量
(mg·g-1)=蛋白质浓度(μg·mL-1)×5(mL-1)×
103/0.5(g)计算。
测定叶绿素含量时 ,取细胞悬浮液 6 000×g
离心 15 min ,弃上清液 。取 0.5 g(FW)沉淀物 ,置
于研钵中 ,加 5 ～ 6 mL 蒸馏水以及少许碳酸钙和
适量石英砂 ,仔细研磨成匀浆 ,用蒸馏水定容至 10
mL。用移液管吸取 2.5 mL ,置于一大试管中 ,加
入 10 mL 丙酮 ,摇动试管 ,促使叶绿素溶于丙酮
中。静置片刻 ,过滤后即为叶绿素丙酮提取液 。用
光径为 1 cm 的比色杯 ,以 80%的丙酮作空白对
照 ,用 721型分光光度计测定 663和 645 nm 处光
密度值 ,叶绿素含量用 mg·g -1(FW)表示。按文
献 7计算叶绿素含量 。
测定总含磷量时 ,取细胞悬浮液 6 000×g 离
心15 min ,弃上清液。取 0.5 g(FW)沉淀物 ,加 5
mL 5%的过氯酸 , 用研钵于 0℃下研磨成匀浆 ,
5 000×g 离心 10 min ,倾去上清液。用同样方法
再提取 2 次 ,以完全除去酸溶性蛋白。残渣用乙
醇-乙醚-氯仿(2∶2∶1)混合液 、于室温下 5 000×g 提
取 4次 ,每次提取 15 min ,以除去磷脂。核酸残渣
干燥后 ,加 2.5 mL 5%的三氯乙酸 ,放在 90℃恒温
水浴中水解 30 min。水解液以 721型分光光度计
测定 268.5 nm 处 OD 值 , 以同样条件(90℃, 30
min)下处理过的 5%三氯乙酸作为空白对照 ,比色
杯光径为 1 cm 。根据 εP =9850 , 用公式 C =
(30.98×D268.5)/9850计算总磷含量。式中 , C 为
磷浓度(g·L-1), D268.5为样品在 268.5 nm 处测得
的光密度 , εP为磷原子的吸收系数[ 8] 。
测定鲜 、干重比例时 ,细胞悬浮液以 6 000×g
离心 15 min ,称鲜重 ,鲜细胞置于 60℃下 ,烘干 12
h以上至恒重时 ,按公式:鲜/干重=细胞鲜重(g)/
细胞干重(g)计算比值[ 9] 。
结果与讨论
1　不同浓度大量元素对细胞生长的影响
　　在大量元素含量不同的培养基中 ,细胞的增长
量均随时间的延长而增加。在无大量元素和 1/2
大量元素的培养基中 ,细胞的生长均在前 2 d有一
个停滞期 ,细胞干重增长幅度不大 。无大量元素的
培养基中 ,培养 10 d的细胞干重也未达到接种干
重的 1倍 。1/2大量元素的 MS 培养基中在第 10
天才达到接种时干重的 1.5倍 。而在全大量元素
的 MS 培养基中 ,培养 4 ～ 6 d时有一个明显的细
胞增长停滞期 ,第 6天后悬浮细胞的干重呈直线上
升。在液体培养基中 ,细胞增长量随着大量元素浓
度的加大而增大 ,细胞生长速率也变快 。这显然是
大量元素提供了细胞生长所需的无机盐之故 ,而无
机盐是决定着细胞新陈代谢过程的 ,同时它也是决
定细胞中激素和氨基酸积累数量和速度的因
素[ 10] 。这在细胞干重上也反应出来(图 1)。而
Martin[ 11]报道 ,对大多数种类的苔藓植物来讲 ,培
养基浓度降为原来的 10%,对于其生长速度和形
态几乎没有影响。而本试验中 ,大量元素对细胞的
生长速度和细胞内的一系列代谢活动均产生明显
的影响。当培养基中加入全量的大量元素时 ,细胞
的生长速度明显加快 ,并且细胞内可溶性蛋白含量
图 1　不同浓度大量元素对细胞生长的影响
Fig.1　The effect of different concentrations of major elements
on g rowth of suspended cells
596 植物生理学通讯　第 39 卷 第 6 期 , 2003 年 12 月
也相应增加 ,细胞内的渗透势相对稳定 ,细胞的鲜
干重比值变化较小。
2　不同浓度大量元素对蛋白质含量的影响
　　由图 2可以看出 ,随着离子浓度的增加 ,细胞
内可溶性蛋白含量呈“S”形变化 。在无大量元素
的培养基中可溶性蛋白一直处于积累状态 。随着
离子浓度的增加 ,细胞内可溶性蛋白含量先下降 ,
后上升。培养到第 8天时积累量达到最高峰 ,而后
降低 。
图 2　不同浓度大量元素对细胞蛋白含量的影响
Fig.2　The effect of different concentrations of major elements
on the content of protein in the cells
　　大量元素中除氮元素外 ,磷元素也与蛋白质的
合成有关 。缺乏磷元素时 ,蛋白质合成降低。K 、
Ca 、Mg 、S 等元素都影响植物细胞的酶活性和方
向 ,决定着新陈代谢的过程。培养基中大量元素含
量越高 ,蛋白质积累越多 。这与我们的试验结果相
符。且在这 3种培养基中 ,蛋白质的含量均随时间
的延长不断增加 。在 1/2大量元素的培养基中 ,第
8天后 ,悬浮细胞蛋白质的含量陡然下降 ,其原因
可能是培养基中的无机离子已经被消耗殆尽 ,不能
合成蛋白质 ,而前期合成的可溶性蛋白转化为结构
性蛋白[ 9] 。在无大量元素培养基中培养的悬浮细
胞中可溶性蛋白一直呈上升趋势(图 2),可能是由
于培养基中缺乏生长所必需的元素 ,因而导致其代
谢途径变化。朱宝成等[ 12]在掌叶半夏细胞的悬浮
培养中发现 ,细胞内可溶性蛋白含量在最初培养的
20 d内一直呈上升趋势。他认为细胞内蛋白含量
的增加与细胞旺盛的生长和分裂有关 ,随着细胞的
衰老 ,蛋白含量逐渐下降 。
3　不同大量元素对叶绿素含量的影响
　　在大量元素含量不同的 3种培养基中 ,无论是
叶绿素 a、b ,或是总叶绿素含量 ,均比培养前有所
下降 ,但下降的比例和程度不同。叶绿素 a下降的
比例较小 ,叶绿素 b则较大。此外 ,随着离子浓度
的增大 ,细胞中叶绿素含量也增多 。这可能是由于
培养基中无机元素含量影响到叶绿素合成之故 。
叶绿素合成与无机离子的含量呈正相关(表 1)。
这一结果与前人[ 13]报道相符 。
表 1　不同浓度大量元素培养前后细胞中
叶绿素含量的变化
Table 1　The variat ion of chlorophyll content in
dif ferent concent rat ions of major elements
mg·g -1(FW)
大量元素
含量/ %
叶绿素 a
培养前 培养后
叶绿素 b
培养前 培养后
叶绿素 a + b
培养前 培养后
0 0.163 0.051 0.109 0.004 0.27 0.055
50 0.163 0.085 0.109 0.046 0.27 0.132
100 0.163 0.093 0.109 0.085 0.27 0.178
　　矿质元素对叶绿素形成有很大的影响[ 14] 。氮
和镁是叶绿素的组成元素 ,铁 、锰 、铜 、锌等是叶绿
素形成过程中某些酶的活化剂起间接作用。本实
验中 ,悬浮细胞中叶绿素的含量恰好与此论断相
符。但叶绿素总含量全部低于正常值 ,这与 Katoh
等[ 15 ,16] 的结论相反。他用两种不同的培养基
MSK-1和 MSK-2对地钱进行悬浮培养时发现 ,地
钱悬浮培养细胞叶绿体发育较好 ,叶绿素含量高 。
其中在 MSK-1上培养的地钱悬浮培养物叶绿素的
含量是原来细胞的 2 倍。但是这种情况的出现依
赖于光的存在 ,在暗处则停止生长 。
4　鲜/干重比值和总含磷量的变化
　　从鲜/干重的比值也不难看出 , 大量元素对细
胞代谢产物积累有很大作用。无大量元素和 1/2
大量元素的培养基中 , 鲜/干重比值均升高;全大
量元素培养基的鲜/干重比值略有下降(表 2)。液
体培养基中 , 离子浓度不同会造成培养基的渗透
压发生变化 , 从而影响细胞的含水量。无大量元
素的培养基中培养 10 d后 , 鲜/干重比值升高 。这
可能是因为渗透压降低会导致细胞含水量增加的
缘故。培养基中离子浓度越大 , 细胞的渗透压越
趋于正常 ,细胞鲜/干重比值越小 。此外 , 培养基
597植物生理学通讯　第 39 卷 第 6 期 , 2003 年 12 月
中大量元素的缺乏 , 还会引起细胞中蛋白积累量
下降(图 2), 从而导致细胞干重下降 , 这也可能是
细胞鲜/干重比值变化的一个重要原因 。
3种培养基培养的悬浮细胞中总磷含量均下
降 , 且总磷含量与液体培养基大量元素的含量呈
负相关(表 2)。离子浓度越高 , 细胞中总磷含量就
越低 。其原因可能是培养基中磷含量越高 , 细胞
的生长和分裂速度也越快 , 细胞的衰老死亡相应
加快 , 从而导致细胞裂解 ,磷释放到培养基中 , 残
存磷元素则在新细胞中再次分配 , 因此细胞中磷
元素含量逐渐下降。
表 2　不同浓度大量元素下培养前后悬浮细胞鲜/干重
比值及总磷含量的变化
Table 2　The changes of f resh-dry-weight rat io and general phosphorus
content in dif ferent concent rat ions of major elements
大量元素含量/ % 鲜/干重比值培养前 培养后
总磷含量/mg﹒g -1
培养前 培养后
0 3.33 5.14 0.362 0.256
50 3.33 4.21 0.362 0.176
100 3.33 3.29 0.362 0.114
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