全 文 ：收稿日期: 2004- 06- 24
基金项目:广西省自然科技攻关项目( 0235022 - 1B)
作者简介:朱华( 1960- ) ,男,广西南宁人,教授,博士生导师。
文章编号: 1009 - 5276( 2005) 01 - 0020 - 03
硅胶柱色谱 /RP - HPLC/LC- ESI -MS分离纯化
鉴定拳卷地钱中芹菜素 - 7 -O - B- D-葡萄糖醛酸苷
朱 华1,肖建波2 ,邹登峰1,周春山2
( 11 广西中医学院, 广西 南宁 530001; 21 中南大学化学化工学院, 湖南 长沙 410083)
摘 要: 目的:建立分离纯化鉴定拳卷地钱中芹菜素 - 7 - O -B- D -葡萄糖醛酸苷的硅胶柱色谱 /RP -
HPLC / LC - ESI - MS 方法。方法: 拳卷地钱叶经过 80% 乙醇提取后, 减压蒸馏, 得粗提物。拳卷地钱叶粗
提物用甲醇溶解后上硅胶柱, 用甲醇 -氯仿配比为 25B1, 25B2, 25B3 , ,2B25, 1B25 混合溶液洗脱, 各洗脱液
进行 RP - HPLC 分析,较纯的洗脱液进行 LC - ESI - MS 分析 ,为制备分离黄酮类化合物单体提供指导。结
果:氯仿与甲醇配比为 25B15、25B16、25B17、25B18 的洗脱液经过 RP - HPLC 分析为单一组分, tR 为
1211min,与对照品芹菜素 - 7 - O -B- D -葡萄糖醛酸苷共注射进行 RP - HPLC 实验, 发现峰高增加, tR为
1211min, UV [Kmax为 336 /296( sh) /267nm ]和 IR光谱与芹菜素 - 7 - O -B- D - 葡萄糖醛酸苷基本一致。
LC - ESI - MS 测定结果表明,与对照品芹菜素 - 7 - O - B- D - 葡萄糖醛酸苷的分子量相同为 446。结论:
由此可以鉴定该洗脱组分为芹菜素- 7 - O -B- D -葡萄糖醛酸苷。
关键词: 拳卷地钱;柱层析; RP - HPLC; LC - ESI - MS;芹菜素- 7 - O -B- D -葡萄糖醛酸苷
中图分类号: R931 文献标识码 : B
地钱( Marchantia L1)又名地衣,苔藓属植物,广泛分
布于各地, 多生于阴暗潮湿的地方 [1 ]。我国苔藓植物资
源十分丰富, 已报道的约有 3000 种, 对苔藓植物的化学
成份研究更少 [2 ]。药用始载于5名医别录6、5本草纲目6
中谓之/石衣0 , 味淡, 性凉, 归肝经。地钱的化学成分主
要包括黄酮类化合物、联苄类化合物、香豆素类及萜类化
合物等 [3~ 5 ]。其中,黄酮类化合物以芹菜素、木犀草素、
槲皮素及其苷为主 [6 ]。关于拳卷地钱中化学成分的研究
报道较少。
芹菜素 - 7 - O -B- D -葡萄糖醛酸苷( apigenin - 7
- O -B- D - g lucuronide, 分子结构见图 1) , 具有多种生
物活性,抗氧化能力强。本文建立了分离纯化鉴定拳卷
地钱中芹菜素 - 7 - O - B- D - 葡萄糖醛酸苷的硅胶柱
色谱 / RP - HPLC /LC - ESI - MS 方法, 为广西地区大量
拳卷地钱资源的开发利用提供证据。
图 1 芹菜素 - 7 - O -B- D -葡萄糖醛酸苷分子结构
1 实验部分
11 1 材料、仪器和试剂 Bruker VECTOR 22 型红外光
谱仪, KBr 压片; 756MC 型紫外可见分光光度计, 上海精
密仪器有限公司; LCQ 型电喷雾质谱, 全扫描, Finnigan;
BT8100 高效液相色谱仪( Bio tronic 公司) ; BT8200UV 检
测器;旋转蒸发仪 (上海申科仪器公司)。乙醇、石油醚、
乙酸乙酯等试剂均为 AR级;硅胶 AR级, 青岛海洋化工
厂;甲醇和乙腈为色谱纯。开管玻璃柱自制。芹菜素 - 7
- O -B- D -葡萄糖醛酸苷对照品由中国药品生物制品
检定所提供;药材由广西中医学院提供,经广西中医学院
周子静教授鉴定为拳卷地钱( Marchantia convoluta)。
11 2 色谱和红外光谱条件 柱色谱 层析柱 68cm @
25mm, 硅胶预处理活化后, 与供试品溶液混合,挥发除去
溶剂,干法装柱, 下层铺垫少量硅胶和玻璃纤维。配制不
同极性的氯仿 - 甲醇混合溶液, 极性由小到大, 分别为
25B1, 25B2, 25B3, ,25B25, 24B25, 23B25 , ,1B25(氯仿
/甲醇= V /V ) , 每份配制 50mL。按极性由小到大顺序萃
取,缓慢自柱口加入混合溶剂, 此时柱中会产生少量气
泡,用硬质玻璃棒搅动柱内硅胶, 以除去气泡。静置
10min 后,用真空泵抽下洗脱液, 每一配比的洗脱液收集
一流份,同时进行高效液相色谱跟踪检测洗脱液中黄酮
类化合物的种类和含量。
RP - HPLC 色谱柱为 Kromasil C18 柱 ( 250 @
41 6mm i1 d, 5Lm, Hanbon Science & Technology Co1 ,
L td) ; 流动相为乙酸B甲醇B乙腈B磷酸B水= 10B200B100B
10B200( V /V ) ; 流速 01 60mL /min, 检测波长 350nm;柱温
25 e ;进样量 610LL。
LC - ESI - MS 检测条件, ESI: 正离子 41 5KV, 负
离子 315KV。流动相甲醇B水 = 40B 60, 检测波长
350nm。电喷雾离子阱, N2 为壳气, 质量扫描范围: 150
~ 800m /z,分辨率 m /z( 13000 m#z -1 /sce) , Skimmer: -
40volt, cut off: 50m /z。
UV 压片方式:先压一空白的 KBr 片,用滴管将供试
品溶液滴于 KBr片上, 置于红外灯下烘干。
11 3 实验溶液的配制 拳卷地钱黄酮类化合物的提取
第 23卷 第 1期
2 0 0 5 年 1 月
中 医 药 学 刊
CHINESE ARCHIVES OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE
Vol. 23 No. 1
Jan . , 2 0 0 5
中医药
20
学刊
DOI：10.13193/j.archtcm.2005.01.18.zhuh.008
与分离 称取拳卷地钱干燥品 20g, 加入 80%乙醇水溶
液 200mL, 提取温度 70e , 时间 01 5h, 提取次数 3 次, 过
滤,合并滤波,减压蒸馏,回收乙醇 ,浓缩至干,得拳卷地
钱总黄酮粗提物。将粗提物用少量甲醇溶解后, 拌入适
量处理后的硅胶, 水浴加热,挥发除去溶剂后按/ 柱色谱0
法进行柱层析, 收集各洗脱部分。
供试品溶液的配制 上述洗脱液同时进行高效液相
色谱跟踪检测萃取液中黄酮类化合物的种类和含量, 根
据高效液相色谱图, 将配比为 25B15, 25B16, 25B17, 25B
18的洗脱液合并, 减压蒸馏, 回收溶剂, 蒸干后用甲醇溶
解, 于 14000g 离心 10min, 取上清液作为 LC - ESI - MS、
UV 和 IR的供试品溶液。
对照品溶液的配制 用甲醇溶解对照品芹菜素 - 7
- O -B- D -葡萄糖醛酸苷, 用前 14000g 离心 10min, 上
清液作为对照品溶液。
11 4 芹菜素 - 7- O -B -D -葡萄糖醛酸苷的鉴定 将
供试品、对照品和两者混合溶液分别进行 RP - HPLC 分
析, 表明配比为 25B15, 25B16, 25B17, 25B18 的洗脱液组
分为单一组分。按供试品溶液分别进行 LC - ESI - MS、
UV 和 IR测定。
2 结果与讨论
21 1 装柱方式的选择 本文采用干法装柱,让黄酮类化
合物先吸附在硅胶表面, 再根据黄酮类化合物性质的差
异,用不同极性的溶剂萃取。自制的开管玻璃柱, 直径
25mm,长 68cm。装柱时下层预置玻璃纤维, 以防溶剂萃
取时硅胶脱落, 将吸附总黄酮后的硅胶轻轻倒入柱内, 并
不断敲击玻璃柱, 柱底抽真空,使硅胶紧密, 装柱均匀。
图 2 粗提物( A)及供试品溶液( B)的 HPLC 图谱
21 2 拳卷地钱粗提物及供试品溶液的 HPLC 分析 拳
卷地钱粗提物和供试品溶液的 HPLC 图谱见图 2。配比
为 25B15, 25B16, 25B17, 25B18 的洗脱液的 HPLC 图谱
(图 2 - B)只出现一色谱峰, tR= 121 1min, 对应于拳卷地
钱叶的粗提物 HPLC 图谱(图 2 - A )中 tR= 121 2min 的
组分。结果表明,给该洗脱组分为单一组分,可经硅胶柱
色谱一步从拳卷地钱叶粗提物中分离并纯化出来。
21 3 供试品溶液的紫外光谱 供试品溶液进行紫外扫
描,以甲醇为空白, 紫外光谱图见图 3 - 1。Kmax ( nm)为
336 /296( sh) /267nm, 与对照品溶液的紫外光谱基本一
致。供试品溶液中加入少量 NaOH 后, 最大吸收峰位置
发生改变(图 3 - 2) ,这与黄酮类化合物的紫外图谱非常
相近,佐证了结论。
图 3 供试品溶液的紫外光谱图
21 4 供试品溶液的红外光谱 红外光谱采用 KBr 压
片,吸收峰出现的位置为 ( cm - 1 ) (见图 4) : 3421cm - 1处
一宽峰, 为羟基的伸缩振动, 示意有羟基( - OH)存在;
2958、2925、2855cm - 1尖峰(中等强度) 为饱和碳氢的伸
缩振动,表明有饱和的 C - H 键存在; 而芹菜素上无饱和
的 C - H 键, 显示这是取代的葡萄糖醛酸上的饱和的 C
- H 键的吸收峰, 1400、1422cm - 1处为 C - H 键的弯曲振
动吸收峰; 1736cm -1处为强尖峰, 为羰基的伸缩振动, 其
波数比一般的羰基的伸缩振动峰要高, 佐证取代的葡萄
糖醛酸分子中羧基上的羰基存在, 1625cm - 1尖峰 (中等
强度)表明苷元部分的羰基存在, 1167cm - 1、1122cm - 1处
表明位置分子中醚键( - O - )的存在。
图 4 供试品溶液的红外光谱图
21 5 供试品溶液的 LC - ESI -MS 分析 供试品溶液
分别进行正离子化和负离子化 LC - ESI - MS 分析, 结
果见图 5。图 5 - A 为供试品溶液的正离子 ESI - MS 图
谱,在 270、4461 9、469 和 485 处有最强峰。用正离子源
第 1期 朱 华等:硅胶柱色谱 /RP - HPLC /LC - ES I - MS 分离纯化鉴定拳卷地钱中芹菜素 - 7 - O -B- D -葡萄糖醛酸苷
中医药
21
学刊
为离子化方式对黄酮类化合物进行分析, 由于该方法易
形成 [M+ Na ]+ 和 [M + K ]+ 的离子峰, 而此两者的质量
数相差 16, 根据质量数可以推断出黄酮类化合物的分子
量。469 - 4461 9 = 221 1 ( Na+ ) ; 485 - 4461 9 = 3811
( K+ ) ; 485 - 469= 16( M Na+ - M K+ )。
从图 5 - A 可以看出, 黄酮类化合物在离子化的过
程中产生了许多 [ M+ Na ] + 和 [ M+ K ] + 的离子峰,且芹
菜素 - 7 - O -B- D -葡萄糖醛酸苷的糖苷键被打断, 形
成芹菜素的分子离子峰: 270 [M - glu+ H ] + 。故判断分
子离子峰为 44619 [M+ H ]+ ,其分子量为 446, 与芹菜素
- 7 - O -B- D -葡萄糖醛酸苷一致。
图 5 供试品溶液的 LC - ESI - MS 图谱
A1 正离子 B1 负离子
用负离子源为离子化方式对黄酮类化合物进行分
析,由于该方法不易形成 [ M+ Na ] + 和 [ M+ K ] + 的离子
峰,一般只形成分子离子峰 [ M - H ] - , 而几乎无碎片峰,
有利于分子量的直测定。因此负离子离子化方式是正离
子源离子化方式的补充 ,根据质量数可以推断出黄酮类
化合物的分子量。
图 5 - B 为供试品溶液的负离子 ESI - MS 图谱, 在
445[ M - H ] -处有最强峰, 佐证了分子量为 446 的结论。
3 结 论
拳卷地钱叶经过 80%乙醇提取后, 减压蒸馏, 得粗
提物。拳卷地钱叶粗提物用甲醇溶解后上硅胶柱, 氯仿
与甲醇配比为 25B15, 25B16, 25B17, 25B18 的洗脱液经过
RP - HPLC 分析为单一组分, tR 为 121 1min,Kmax ( nm)
为 336、296( sh)、267nm, 与对照品芹菜素 - 7 - O -B - D
-葡萄糖醛酸苷共注射进行 RP - HPLC 实验, 发现峰高
增加, tR 为 1211min, 供试品溶液的 UV 和 IR 光谱佐证
了结论。LC - ESI - MS 测定结果表明:与对照品芹菜素
- 7 - O -B- D -葡萄糖醛酸苷的分子量相同为 446。由
此可以鉴定该洗脱组分为芹菜素 - 7 - O - B- D - 葡萄
糖醛酸苷,为广西地区大量拳卷地钱资源的开发利用提
供了证据。
参考文献:
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Isolation, Purification and Identification of apigenin-7-O-B-D-glucuronide in
Ma rchantia convoluta with Silica Column Chromatography, RP-HPLC and LC-ESI-MS
ZHU Hua
1
, XIAO Jian-bo
2
, ZOU Deng-feng
1
, ZHOU Chun-shan
2
(11Guangxi College of TCM, Nanning 530001, Guangxi , C hina;
21Department of Chemist ry and Chemical Engineering, Cent ral Sou th Universi ty, Changsha 410083, Hunan,C hina)
Abstract: Obj ective: The methods of silica column chromatography , RP-HPLC, UV, IR and LC-ESI-MS fo r isolating,
purifying and identifying apigenin-7-O-B-D-glucuronide in Marchantia convo luta w as established in this article. Methods: The
crude ex tracts of Marchantia convo luta leaves was obtained after Marchantia convoluta leaves were ex tracted with 80%
ethanol and the ex tracts w ere concentrated under reduced pressure. The obtained crude extracts disso lved with methanol w ere
subjected to silica gel column and eluted with the successive eluting solv ent mix ture of methanol-chlo roform. The eluted frac-
tion w as analyzed by RP-HPLC. The fur ther degree of purity w ere analy zed with UV , IR and LC-ESI-MS. Result : The elu-
tion chloroform-methanol 25B15, 25B16, 25B17, 25B18 were indicated to consist of only one kind of constituent by HPLC and
UV , w hich retention time( tR) andKmax ( nm) were 121 1 min and 336 /296( sh) /267nm respectively. The HPLC experiment of
the co - injections of this fraction with the standard of apig enin-7-O-B-D-g lucuronide resulted in an overlapping and accumu-
lating effect with the similar re tention time. The UV and IR spectra of the test solution w ere similar to the apig enin-7-O-B-D-
glucuronide. On the o ther hand, the LC-ESI-MS experiments indicated that the molecular weight is 446. Conclus ion: So the
fraction can be identified as apigenin-7-O-B-D-glucuronide.
Key words: Marchantia convo luta; column chromatography ; RP-HPLC; LC-ESI-MS; apigenin-7-O-B-D-glucuronide
中 医 药 学 刊 2005 年第 23卷
中医药
22
学刊