全 文 ：响应面法优化四角菱果壳总多酚提取工艺
吕 寒1， 黄 鑫2， 陈 剑1， 任冰如1， 李维林1 *
(1． 江苏省 中国科学院植物研究所，江苏 南京 210014;2． 盐城工学院，江苏 盐城 224051)
收稿日期:2015-09-28
基金项目:江苏省科技基础设施建设计划-科技公共服务平台项目 (BM2011117);江苏省药用植物研究重点实验室项目 (YY201401)
作者简介:吕 寒 (1980—) ，女，助理研究员，从事植物化学研究。Tel: (025)84347081，E-mail:xiaohan1814@ 163． com
* 通信作者:李维林 (1966—) ，男，研究员，从事药用植物药效研究。Tel: (025)84347002，E-mail:lwlcnbg@ mail． cnbg． net
摘要:目的 通过响应面法对四角菱果壳总多酚提取工艺进行优化。方法 Folin-Ciocalteu 比色法测定总多酚含有量，
以其提取率为评价指标，乙醇体积分数、提取时间、料液比为影响因素，在单因素试验基础上，采用响应面法优选提
取工艺。结果 最佳条件为乙醇体积分数 51. 3%，料液比 1 ∶ 20，提取两次，每次 1 h，总多酚提取率为 11. 09%。结
论 该工艺稳定可靠，可以用于四角菱果壳总多酚的提取。
关键词:四角菱;果壳;总多酚;Folin-Ciocalteu比色法;响应面法
中图分类号:Ｒ284. 2 文献标志码:B 文章编号:1001-1528(2016)10-2288-03
doi:10. 3969 / j． issn． 1001-1528. 2016. 10. 043
四角菱 Trapa quadrispinosa Ｒoxb． 为菱科菱属一年生水
生草本植物，在我国湖泊、河湾等淡水水域有着广泛分布
或栽培［1］。菱角又名水栗、沙角、芰实，为菱的果实，
《本草纲目》记载，菱角别名芰实，能解暑、解伤寒积热、
止消渴、解酒毒［2］。研究发现，该属植物的果壳中含有多
酚、黄酮、生物碱、多糖等多种成分［3-5］，其中多酚类成分
主要为没食子酸及其衍生物，具有很强的抗氧化活性和抗
肿瘤活性［3，6-7］，但其提取方法尚未见报道。
本研究采用 Folin-Ciocalteu比色法测定四角菱果壳总多
酚含有量［8］，并以其提取率为评价指标，在单因素试验基
础上，通过响应面法对提取工艺进行优化，为四角菱果壳
开发利用提供实验基础。
1 仪器与材料
KQ-300DE型数控超声波清洗器 (昆山市超声仪器有
限公司);Mettler EL204 电子天平 (梅特勒-托利多仪器有
限公司);二列回孔智能水浴锅 (南京科尔仪器设备有限
公司) ;Mettler EL204 电子天平 (瑞士梅特勒-托利多公
司) ;Molecular Devices SpectraMax Plus 384 型酶标仪 (美国
Molecular Devices公司);Thermo Finnpipette 精密单通道加
样器 (赛默飞世尔科技公司) ;Transferpette-8 型精密八通
道移液排枪 (德国普兰德公司)。
四角菱采自山东微山湖，经江苏省中国科学院植物研
究所李维林研究员鉴定为四角菱 Trapa quadrispinosa Ｒoxb．
的果实。将菱角的壳与种仁分离，常温阴干，粉碎，过 60
目筛。没食子酸对照品 (中国食品药品检定研究院);Fo-
lin-Ciocalteu试剂 (美国 Sigma-Aldrich 公司)。无水乙醇、
无水碳酸钠均为分析纯 (南京化学试剂有限公司)。
2 方法与结果
2. 1 总多酚含有量测定
2. 1. 1 对照品溶液配制 精密称取干燥的没食子酸对照品
适量，10%甲醇溶解，配制成 0. 112 mg /mL对照品溶液。
2. 1. 2 标准曲线绘制 在 96 孔板中加入对照品溶液 0、5、
10、20、30、40、50 μL，加水溶液补足至 50 μL，加入
50 μL 10% Folin-Ciocalteu 试剂，振荡 3 min 后加入50 μL
10%Na2CO3 溶液，充分混匀，室温下静置 1 h后，将 96 孔
板放入酶标仪中，在 760 nm波长处测定各样品吸光度，重
复 3 次，取其平均值。以吸光度 (Y)对没食子酸质量浓
度 (X)绘制总多酚含有量标准曲线，得到回归方程为 Y =
34. 596X + 0. 058 9 (Ｒ2 = 0. 999 1) ，在 0. 56 ～ 5. 6 μg范围内
呈良好的线性关系。
2. 1. 3 测定方法 精密移取提取液 5 μL，置于 96 孔平板
中，加入溶剂补足 50 μL。同法加入 Folin-Ciocalteu 试剂和
Na2CO3 溶液，760 nm 波长下测定吸光度。以不加显示剂
的样品溶液为空白对照组，按“2. 1. 2”项下标准曲线求
得总多酚含有量 (以没食子酸计)，重复 3 次。经方法学
验证，发现其有着良好的精密度、重复性和准确度。
2. 2 总多酚提取率的计算 公式为总多酚提取率 = (m1 /
m) × 100% (m1 为提取液中总多酚质量，m 为四角菱果
壳质量)。
2. 3 单因素试验
2. 3. 1 提取溶剂 称取四角菱果壳粉末 1. 0 g，加入 30 倍
量 水， 10%、 20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、
80%、95%乙醇超声提取 40 min。结果，10 种溶剂下总多
酚提 取 率 分 别 为 0. 70%、 0. 98%、 1. 62%、 2. 42%、
2. 28%、2. 45%、3. 37%、3. 07%、1. 49%、0. 87%，即随
着乙醇体积分数增加，总多酚提取率先增加后减小，60%
乙醇时最高。
2. 3. 2 提取方法 称取四角菱果壳粉末 1. 0 g，一组加入
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60%乙醇，加热回流提取两次，每次 1 h;一组相同溶剂超
声提取两次，每次 30 min;一组相同溶剂渗滤提取两次，
每次 24 h。结果，加热回流提取下总多酚提取率为 6. 47%，
超声提取为 4. 47%，渗滤提取为 5. 63%，即加热回流提取
时总多酚提取率最高。
2. 3. 3 料液比 称取四角菱果壳粉末 1. 0 g，以 60%乙醇
为提取溶剂，加入 6、8、10、15 倍量提取溶剂，加热回流
提取 1 h。结果，4 种料液比下总多酚提取率分别为
4. 89%、5. 64%、6. 20%、6. 50%，即 1 ∶ 15 料液比时总多
酚提取率最高。
2. 3. 4 提取时间 称取四角菱果壳粉末 1. 0 g，加入 60%
乙醇，加热回流提取 0. 5、1、1. 5、2 h。结果，不同提取
时间下总多酚提取率分别为 5. 95%、6. 63%、7. 19%、
7. 06%，即加热回流 1. 5 h时总多酚提取率最高。
2. 3. 5 提取次数 称取四角菱果壳粉末 1. 0 g，加入 60%
乙醇，加热回流提取 1、2、3 次，每次 1. 5 h。结果，不同
提取次数下总多酚提取率分别为 6. 73%、7. 34%、7. 76%，
即提取次数越多，总多酚提取率越高。从经济角度和实际
生产考虑，选择提取两次。
2. 4 响应面法优化工艺 根据 Box-Benhnken 中心组合设
计原理，在单因素试验基础上，采用 3 因素 3 水平响应面
分析方法，以乙醇体积分数 (A)、料液比 (B)、提取时
间 (C)为自变量，总多酚提取率为响应值 (Y)进行试
验 (提取温度固定为 90 ℃，提取次数固定为两次)。结果
见表 1。
表 1 实验设计及实验结果
试验号 A乙醇 /% B料液比
C提取
时间 /h
Y总多酚
提取率 /%
1 0(60) － 1(1 ∶ 10) 1(2) 9. 75
2 0(60) 0(1 ∶ 15) 0(1. 5) 8. 41
3 0(60) 0(1 ∶ 15) 0(1. 5) 8. 74
4 0(60) 0(1 ∶ 15) 0(1. 5) 8. 91
5 0(60) － 1(1 ∶ 10) － 1(1) 8. 27
6 0(60) 1(1 ∶ 20) － 1(1) 10. 98
7 1(70) 0(1 ∶ 15) － 1(1) 7. 47
8 1(70) 1(1 ∶ 20) 0(1. 5) 7. 44
9 0(60) 0(1 ∶ 15) 0(1. 5) 8. 50
10 － 1(50) 1(1 ∶ 20) 0(1. 5) 8. 63
11 0(60) 1(1 ∶ 20) 1(2) 7. 35
12 1(70) － 1(1 ∶ 10) 0(1. 5) 8. 11
13 － 1(50) － 1(1 ∶ 10) 0(1. 5) 8. 34
14 － 1(50) 0(1 ∶ 15) 1(2) 8. 25
15 0(50) 0(1 ∶ 15) 0(1. 5) 8. 63
16 － 1(50) 0(1 ∶ 15) － 1(1) 9. 43
17 1(70) 0(1 ∶ 15) 1(2) 8. 06
采用 Design Expert 8. 06 软件对表 1 数据进行拟合回
归，建立回归模型 Y = 8. 64 － 0. 45A － 0. 008 75B － 0. 34C －
0. 24AB + 0. 44AC － 1. 28BC － 0. 65A2 + 0. 14B2 + 0. 31C2，各
因素的方差分析结果见表 2。由表可知，模型 P 值小于
0. 01，表明二次方程拟合显著;失拟项 P 值大于 0. 05，表
明失拟项相对于绝对误差不显著;各因素影响大小依次为
乙醇体积分数 ＞提取时间 ＞料液比;二次项 A2 影响显著，
其他不显著;交互项 BC 影响极显著，AC 显著，AB
不显著。
表 2 方差分析
来源 离差平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性
A 1. 59 1 1. 59 18. 86 0. 003 3 ＊＊
B 0. 000 612 5 1 0. 000 612 5 0. 007 3190. 932 4 —
C 0. 94 1 0. 94 11. 21 0. 012 3 *
AB 0. 23 1 0. 23 2. 75 0. 141 0 —
AC 0. 78 1 0. 78 9. 36 0. 018 6 *
BC 6. 53 1 6. 53 78. 01 ＜ 0. 000 1 ＊＊
A2 1. 76 1 1. 76 21. 03 0. 002 5 ＊＊
B2 0. 081 1 0. 081 0. 97 0. 362 4 —
C2 0. 41 1 0. 41 4. 87 0. 064 1 —
残余 0. 59 7 0. 084 — — —
模型 12. 22 9 1. 36 16. 22 0. 000 7 ＊＊
失拟项 0. 43 3 0. 14 3. 69 0. 119 7 —
纯误差 0. 16 4 0. 039 — — —
总和 12. 80 16 — — — —
注:* P ＜0. 05，＊＊P ＜0. 01
各因素响应面图见图 1 ～ 3，可知各因素对总多酚提取
率的影响不是简单线性关系;决定系数 Ｒ2 为 0. 954，ＲSD
值为 3. 39%，表明模型拟合度良好，实验误差小，可进行
分析和预测。通过回归模型预测，最佳工艺条件为乙醇体
积分数 51. 3%，料液比 1 ∶ 20，提取时间 1 h，在此条件
下，总多酚提取率理论上可达 11. 19%。
图 1 料液比和乙醇体积分数
2. 5 验证试验 以最佳工艺重复 3 次试验，测得总多酚提
取率为 11. 09%，与理论值 11. 19%接近。
3 讨论
多酚易与植物组织中的蛋白质、生物碱、花色素等物
质通过氢键和其他疏水键方式结合，水可以自由通过细胞
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图 2 提取时间和乙醇体积分数
图 3 提取时间和料液比
膜，但对氢键和疏水键无断裂作用，而有机溶剂能够有效
破坏氢键和疏水键，从而使多酚游离出来。其提取一般采
用丙酮、乙醇等有机溶剂，前期预试验发现，含水丙酮和
乙醇对四角菱果壳中的多酚类物质均有较高的提取率，但
从成本、安全性和产业化角度考虑，最终选择乙醇作为提
取溶剂进行优化。
响应面法是研究几种因素间交互作用的回归分析方法。
正交设计只能处理离散的水平值，而响应面法可以找出整
个区域上各个因素的最佳组合，并得到最优响应值［9-10］。
本研究在单因素试验基础上，采用响应面法对四角菱果壳
总多酚的提取工艺进行优化，发现乙醇体积分数和提取时
间都对其提取率有显著影响，最佳工艺条件为乙醇体积分
数 51. 3%，料液比 1 ∶ 20，提取时间 1 h，所得结果与预测
值较为吻合，表明该方法稳定可靠。
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