全 文 ：基金项目:国家自然科学基金资助课题(No.21310004060407)。作者简介:季梅(1965-),女 ,高级实验师 ,主要从事天然产物有效成分研究。通讯作者:娄红祥。
文章编号:1671-7554(2007)10-1025-05
壳聚糖对地钱细胞生长和酚类次生代谢的影响
季梅 ,尹德明 ,娄红祥＊
(山东大学药学院药化所 , 济南 250012)
　　摘要:目的　探讨壳聚糖诱导子对地钱细胞生长和酚类次生代谢的影响。方法　对壳聚糖-地钱细胞
诱导体系的细胞生物量 、叶绿素 、活性氧(H2O2 和O -2)、细胞膜通透性和膜脂过氧化产物(MDA)以及酚类次
生代谢物苯丙氨酸解氨酶(PAL)和多酚等生化指标进行测定。结果　细胞生长下降(P <0.05),叶绿素含量
明显低于对照组(P <0.01),胞外 pH 趋向碱性化(P <0.01),活性氧含量急剧增加和膜脂过氧化增强
(P<0.01),次生代谢 PAL活性和多酚含量均显著增加(P<0.01)。结论　壳聚糖通过降低地钱细胞还原能
力而增强其氧化能力 ,从而有利于酚类次生代谢的生物合成 。
关键词:壳聚糖;地钱;细胞培养;次生代谢;酚类物质
中图分类号:R282.71　　文献标志码:A
Cell growth and phenolic compounds induced by chitosan
in suspension cultures of Marchantia polymorpha L.
JI Mei , YIN De-ming , LOU Hong-xiang＊
(Shool of Pharmaceutical Science , Shandong University , Jinan 250012 , China)
　　Abstract:Objective　To study the role of the chitosan elicitor on cell growth and phenolic compound contents of
Marchantia polymorpha L.Methods:Cell biomass , chlorophyll , reactive oxygen species (H2O2 and O-2 ), cell mem-
brane permeability and membrane lipid peroxidation production (MDA)and phenolic secondary metabolism (phenylala-
nine ammonialyase and phenolic compounds)were investigated in suspension cultures of Marchantia polymorpha induced
by the chitosan elicitor.Results　Cell biomass decreased(P <0.05), and chlorophyll content also decreased(P <
0.01), while pH of the medium tended to be alkali(P<0.01).Reactive oxygen species greatly increased(P <0.01)
and membrane lipid per-oxidation markedly intensified (P <0.01).Meanwhile , the PAL activity and phenolic com-
pounds of secondary metabolism had a significant increase (P <0.01).Conclusion　The ability to de-oxidation de-
creases and an oxidation increase of Marchantia polymorpha cells induced by chitosan may favor phenolic compounds bio-
synthesis.
Key words:Chitosan;Marchantia polymorpha L.;Plant cell culture;Secondary metabolism;Phenolic compounds
　　利用壳聚糖诱导子激活植物细胞中的次生代谢
途径已成为提高植物细胞中目标产物产量的常用策
略之一[ 1] ,壳聚糖作为一种 β-1 , 4-氨基葡萄糖聚合
物 ,能显著地诱导植物次生代谢的正效应[ 2] 。悬浮
地钱细胞有其独特的结构及生活习性(不易形成细
胞聚集体 、剪切力敏感性差和光照培养),目前利用
壳聚糖诱导地钱细胞生理机制及次生代谢产物的研
究鲜有报道 。本研究以壳聚糖为诱导子 ,以地钱细
第 45卷第 10期
2007年 10月 　　　　
山　东　大　学　学　报　(医　学　版)
JOURNAL OF SHANDONG UNIVERSITY(HEALTH SCIENCES)　　　　Vol.45 No.10Oct.2007
胞为研究对象 ,考查壳聚糖对地钱细胞生长和酚类
次生代谢的影响 ,旨在为大规模培养地钱细胞生产
次生代谢产物提供理论依据 ,并为探索药用苔藓植
物次生代谢产物规模化生产提供新的途径。
1　材料与方法
1.1　细胞株及培养　实验所用的地钱(Marchantia
polymorpha L.)细胞株是由本实验室诱导而来 。于
培养温度 25 ℃、转数 110 r min 、光照时间 10 h d和
光强 3000 lux 下振荡培养。采用改良的MSK-2[ 3](2 ,
4-D 0.5 mg L , NAA 2 mg L , 6-BA 2 mg L)液体培养
基继代培养 5代以上 ,作为细胞种子 ,将 8 g L 细胞
(干重)接种于装有 50mL 新鲜改良的 MSK-2培养基
的250ml三角瓶中。壳聚糖[分子量(C6H11NO4)n ,
脱乙酰度达≥90%,上海国药集团化学试剂公司]经
1%醋酸溶解后 ,调 pH 至 5.8 ,过滤除菌处理后加入
至细胞培养10 d的三角瓶中 ,终浓度为 80 mg L ,实
验组和对照组所测指标在诱导子添加第 1 , 2 , 3 , 4 ,
5 ,6 ,7 d取样 ,重复 3次 。
1.2　实验方法
1.2.1　生长曲线的绘制　取各测定时间点 10 mL
悬浮细胞 ,离心 ,在干燥箱中烘干至恒重 ,称其干重 ,
以培养时间为横坐标 ,细胞干重为纵坐标 ,绘制生长
曲线 。
1.2.2　pH 的测定　用 PHS-2型精密酸度计(上海
雷磁仪表厂)测定。
1.2.3　叶绿素(chlorophyll)含量的测定　采用丙酮
乙醇混合液法[ 4] ,略有修改。将 10 mL 悬浮地钱细
胞经离心后置于 6 mL 丙酮和无水乙醇等比例混合
浸提液中 ,放于暗处 ,室温下进行浸提 , 652 nm 处测
定光密度 ,叶绿素含量用 mg L表示。
1.2.4　H2O2 含量的测定　胞内 H2O2 含量的测定
参照文献[ 5]的方法。
1.2.5　O -2 含量的测定　胞外 O-2 含量的测定根据
文献[ 6]的方法 , 1 mL 细胞培养液在 10 , 000×g 离
心 20 s , 通过测定 100 μmol L 氮蓝四唑(NBT)在
530 nm下的吸收度减少来测定离心液中的O-2 含量。
同时在比色血中加入 100单位的 SOD以消除影响准
确度的因素 。根据ε550 nm =12.8(mmol L)-1·cm-1
(Murphy , 1998)计算O-2 的含量 。
1.2.6　丙二醛(MDA)含量(μmol g , fresh weight ,FW)
的测定　MDA含量的测定采用 Sofo[ 7] 的方法。
1.2.7　细胞膜透性的测定　采用伊文思蓝(evans
blue)染色法[ 8] 。取 1 g 鲜细胞 ,用 0.5mL 0.05%的
伊文斯兰溶液将细胞染色 5min 后 , PBS 洗 3次 ,以
除去剩余染料 ,然后用含 1%SDS(w v)的 50%(v v)
甲醇于 50 ℃下水浴 30 min ,以抽提蓝色染料 , 在
600 nm下测定吸光值。
1.2.8　苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonialyase ,
PAL)活性的测定 　PAL 的提取和活性测定按照
Yuan
[ 9]的方法 。
1.2.9　酚类积累的测定　取 2mL 培养基滤液 ,加
入 10 mL 乙酸乙酯 ,超声振荡后静止萃取 2 h ,取 5
mL乙酸乙酯组分自然风干后 , 残留物溶于 3 mL
75%乙醇中 , 在 280 nm 下测量其吸光度 ,以 3 ml
75%乙醇为对照 ,以水杨酸为标准 ,以 1μg 水杨酸
在 280 nm处的吸光度代表一个单位的酚积累[ 10] 。
1.3　统计学处理　所有数据均以 x ±s表示 ,应用
SAS统计学软件进行方差分析 ,采用 t 检验进行显
著性检验 ,以 P<0.05为差异有统计学意义。
2　结　果
2.1　壳聚糖对细胞生长的影响　见图 1。由图 1
可见 ,实验组和对照组细胞生物量在前 3 d 没有明
显差异 ,从第 4 d以后 ,实验组细胞生物量显著低于
悬浮培养细胞(n=3 , P<0.05)。
图 1　壳聚糖对细胞生长的影响
Fig.1　Effects of cell growth induced by chitosan
2.2　壳聚糖对胞外 pH 的影响　见图 2。由图 2可
见 ,实验组培养液胞外 pH升高 ,趋向碱性化 ,从第 2 d
起 ,较对照组差异有统计学意义(n=3 , P<0.01)。
图 2　壳聚糖对培养液 pH的影响
Fig.2　Changes of pH of the medium with time
　1026　 山　东　大　学　学　报　(医　学　版) 45卷 10期
2.3　壳聚糖对细胞叶绿素含量的影响　见图 3。
由图 3可见 ,实验组和对照组细胞在前 3 d差异不
明显 ,第 4天后 ,实验组细胞明显低于对照组(n=
3 , P<0.01)。
图 3　壳聚糖对细胞叶绿素含量的影响
Fig.3　Effects of chlorophyll content induced by chitosan
2.4　壳聚糖对细胞胞内 H2O2 含量的影响　见图
4。由图 4可见 ,实验组细胞 H2O2 含量在第 1 天比
悬浮细胞有所升高(n=3 , P<0.05),并在第4天达
到峰值 ,显著高于悬浮培养细胞(n=3 , P<0.01)。
　图 4　壳聚糖对胞内 H2O2 含量(鲜重)的影响
Fig.4　Changes of cellular H2O2 content(fresh weight)
affected by chitosan
2.5　壳聚糖对胞外 O-2 含量的影响　见图 5。由图
5可见 ,实验组细胞分别在第 1天和第 3天出现二
个峰值 ,与对照组相比 ,差异具有统计学意义(n=
3 , P<0.01)。
图 5　壳聚糖对胞外 O-2 含量的影响
Fig.5　Changes of O-2 of the medium affected by chitosan
2.6　壳聚糖对细胞 MDA含量的影响　见图 6。由
图6可见 ,实验组细胞 MDA含量在前 7 d呈上升的
趋势 。第 3天过后 ,实验组细胞 MDA含量显著高于
悬浮培养细胞(n=3 , P<0.01)。
图 6　壳聚糖对细胞MDA含量(鲜重)的影响
Fig.6　Effects of chitosan on the MDA content(fresh weight)
2.7　壳聚糖对细胞膜透性的影响　见图 7。由图 7
可见 ,实验组细胞的膜透性在前 2 d缓慢上升 ,从第
3 d后 ,膜通透性急剧增大 ,并和悬浮细胞的膜通透
性有明显的区别(n=3 , P <0.01)。
图 7　壳聚糖对细胞膜通透性的影响
Fig.7　Effects of chitosan on cell membrane permeability
2.8　壳聚糖对细胞 PAL活性的影响　见图 8。由
图8可见 , 。实验组细胞 PAL 活性在前 3 d 和悬浮
细胞相比无明显差别 ,从第 3天后 ,实验组细胞的
PAL活性远高于悬浮细胞(n=3 , P <0.01)。
图 8　壳聚糖对细胞 PAL活性的影响
Fig.8　Changes of the PAL activity induced by chitosan
2.9　壳聚糖对细胞多酚含量的影响　见图 9。由
图 9可见 ,多酚物质在前 6 d一直呈上升的趋势 ,在
第 6天达到峰值 ,是对照的 1.93 倍(n =3 , P <
0.01)。
季梅 ,等.壳聚糖对地钱细胞生长和酚类次生代谢的影响 1027　 　
图 9　壳聚糖对胞外酚含量的影响
Fig.9　Accumulation of extracelluar phenolic compounds
content induced by chitosan
3　讨　论
壳聚糖作为一种外界刺激物质 ,能诱导植物细
胞防卫基因的表达 ,激活防御酶系的活性[ 11] 。本研
究结果显示 ,壳聚糖可使细胞的生长受到抑制 ,细胞
生长速率的降低有利于次生代谢的生物合成 。
植物细胞与壳聚糖激发子最早结合作用的部位
是质膜[ 12] , 引起质膜去极化和离子流变化 , H+内
流 ,使得细胞质酸性化 ,细胞间碱性化 ,碱性化条件
是激活细胞防御基因及酶活性所必需的条件[ 13] 。
本实验结果表明 ,壳聚糖处理细胞后 , 导致 H+内
流 ,培养液呈碱性化 ,而碱性化条件不利于细胞吸收
有利于其生长的营养物质 ,导致叶绿素缺乏营养而
含量降低 。叶绿素是叶绿体重要的光合色素之一 ,
叶绿素可将光能转化为活跃的化学能 NADPH 和
ATP ,可以说叶绿素含量降低将使细胞还原力 NAD-
PH和能量 ATP 输出减少 ,从而导致叶绿体的光合
效率下降 。
植物细胞受到壳聚糖激发子处理后 ,导致 H+
和Ca2+内流 ,K+外流[ 14] 。细胞胞内缺K +会激发活
性氧的产生[ 15] 。同时 ,作为次生代谢信号分子 ,H+
和Ca2+内流也会诱导 H2O2 含量升高 。本实验结果
显示 ,细胞受到壳聚糖激发子处理后 ,使 H2O2 含量
在前 3天上升幅度较小 ,随着细胞应激信号分子的
扩大 ,出现了第 3天活性氧急剧升高 ,造成活性氧
H2O2大量积累。H2O2 在激发子激发的信号转导中
有很重要的作用 ,它是能够自由穿越细胞的最稳定
活性氧 , H2O2 含量急剧增加能激活防御基因的表
达 ,产生植保素和病程相关蛋白等次生代谢产物 ,最
终使植物产生抗性以抵御外界环境的压力[ 16] ,但过
量的 H2O 2会导致细胞膜脂过氧化。
在质膜氧化还原系统中 ,NADPH-氧化酶是植物
细胞产生 O-2 最重要的酶之一 。壳聚糖通过激活
NADPH-氧化酶活性来促进 O-2 的大量产生[ 14] ,引起
细胞活性降低 ,使活性氧产生与消除处于失衡状态 ,
O
-
2 由于其电负性故其跨膜扩散性较小 ,容易在质
膜外造成积累[ 16] ,过量的胞外 O-2 将攻击膜上不饱
和脂肪酸和蛋白质等物质使之变性 ,从而引起膜脂
过氧化和膜通透性增加 ,甚至导致部分细胞死亡 。
MDA是膜脂过氧化后的产物 ,其含量多少可表
示脂质过氧化和膜系统伤害的程度。细胞受到激发
后 ,会诱导细胞氧化还原酶系活性的升高。从本实
验结果看 ,MDA含量在前 2天与对照组细胞相比差
异不显著 。从第 3天后 ,随着细胞活性氧大幅度升
高 ,使活性氧的水平超过伤害细胞的阈值 ,过量的活
性氧将破坏膜的结构与功能 ,引起膜脂过氧化 ,造成
膜MDA含量增加和细胞膜通透性增大 。
壳聚糖激发子作用细胞导致H+和 Ca2+内流以
及 K+等电解质外流 ,而离子流的跨膜转运有利于
细胞膜通透性的增加。随着细胞活力的下降 ,细胞
活性氧产生的能力大于其消除的能力 ,而活性氧过
量的产生将进攻细胞膜的不饱和脂肪酸和蛋白质
等 ,从而导致细胞膜过氧化。本研究结果显示 ,植物
细胞受到壳聚糖激发子处理后 ,膜通透性从第 3天
后显著升高 ,膜通透性过度增加意味着细胞膜不完
整和部分细胞死亡 。
作为一种诱导酶 ,PAL 的活性可因环境刺激而
激活 。本研究结果显示 ,细胞受到壳聚糖应激后 ,在
前 3天细胞变化幅度小 ,随着应激信号强度的级联
放大反应 ,实验组细胞从第 3天使细胞 PAL活性显
著加强 ,以适应壳聚糖对地钱细胞的诱导效应。
PAL在细胞由初级代谢向苯丙烷次级代谢途径转化
过程中起着关键作用 ,而许多次生代谢产物的合成
要依赖于苯丙烷类代谢途径 ,如酚类次生代谢产物
中的黄酮类 、异黄酮类和木质素 ,萜类次生代谢产物
中的紫杉醇的母核等 ,所以 PAL活性增加有利于细
胞的次生代谢的合成。
酚类是通过莽草酸途径合成的次生代谢产物 ,
酚类物质可通过聚合木质化作用抵抗外界不利环境
条件 。细胞受到应激后 ,激发子诱导调控细胞一系
列连锁防御反应 ,植物防御反应依赖于防御反应基
因的表达 ,并启动相关防御酶系的活性 ,另外 ,酚类
前体物的合成也是 PAL 所催化的 ,因此 PAL 升高有
利于酚类物质的形成。从而使多酚含量急剧升高 ,
并在第 6天达到峰值 ,多酚含量增加有利于细胞的
抗逆性 ,从而建立一个有效的防御体系 。
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[ 收稿日期 2007-08-13]
(编辑:孙玉芝)
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