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种业导刊，2016 年第 11 期
Journal of Seed Industry Guide
柳兰中总黄酮含量的测定
芦永昌 1，2，钱 帅 1，2，毛继祖 1，2，许生胜 1，马禅娟 1
（1. 青海民族大学药学院，青海 西宁 810007；
2. 青海省青藏高原植物化学重点实验室）
柳兰为柳叶菜科柳兰属植物柳兰的全草，生长
在海拔 2 700 ～ 4 200 m 的山坡林缘及河谷湿草，分
布于西北地区，味辛、苦，性平；有小毒;有利水渗湿，
理气消胀，活血调经之功效。柳兰的藏药名为“贡
布甲班区孜”，可治风寒湿热、疮疖疹毒、皮肤瘙
痒。药理研究表明，柳兰有抗炎、抗氧化、抗焦虑
及抑制前列腺细胞增殖的作用。柳兰全草含槲皮素，
金丝桃苷等黄酮或多酚类化合物，但至今还未见对
柳兰中总黄酮含量测定的相关研究报道。本研究以
芦丁为对照品，通过 AlCl3 显色法对柳兰中总黄酮
中图分类号：R284 文献标志码：A 文章编号：1003-4749（2016）11-0013-04
柳兰 ;总黄酮 ;分光光度法 ; AlCl3 显色法关键词：
利用正交实验对分离提取条件进行优化，研究柳兰中黄酮类化合物的分离提取和测定方
法，以芦丁为标准品，采用 AlCl3 显色—分光光度法测得柳兰中总黄酮含量为 1.60%，样品平均回
收率 99.15%，RSD 为 1.51%（n = 5）。结果表明，最佳分离提取条件为：乙醇浓度为 50%，固液比
为 1∶30（g • mL-1），提取温度为 95℃，提取时间为 4h。
摘 要：
收稿日期：2016-07-15
基金项目：青海省重点实验室发展专项（2014-Z-Y13），青海民族大学校级理工自然科学项目（2015XJZ05）
作者简介：芦永昌 (1965-)，男，陕西蓝田人，教授，主要从事中藏药质量控制工作。
Assay Study on Total Flavanoids in Chamaenerion angustifolium
LU Yongchang1, 2, QIAN Shuai1, 2, MAO Jizu1, 2, XU Shengsheng1, MA Chanjuan1
(1. College of Pharmacy, Qinghai Nationalities University, Xining 810007, China;
2. Key Laboratory of Plant Resources of Qinghai-Tibet Plateau in Chemical Research)
Abstract: This paperi, the extraction and separation of the total flavones from Cham aenerion
angustifolium were studied. The extraction process conditions were optimized by using orthogonal test.
Under the above conditions,the content of total flavones from dry Cham aenerion angustifolium was 1.60%.
The average recovery rate and RSD were 99.15% and 1.51% respectively（n = 5）. Results showed that
the optimal extraction conditions were as ethanol concentration 50%，ratio of raw material to ethanol
solution 1∶30（g • mL-1），extraction temperature 95 ℃ and extraction time 4 h.
Key words: cham aenerion angustifolium; total flavonoids; UV-Vis spectrophotometry; AlCl3 coloration
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芦永昌等 柳兰中总黄酮含量的测定
的含量进行测定，以期为其生物活性评价及药理作
用研究提供依据。
1 材料与仪器
1.1 材料与试剂
芦丁对照品（批号：20040412，上海润捷化学
试剂有限公司）；石油醚（沸程：60 ～ 90℃）；无
水乙醇、亚硝酸钠、氢氧化钠、硝酸铝、氯化铝均
为分析纯。
柳兰于 2015 年 7 月采自青海省互助县北山林场，
经青海民族大学药学院毛继祖教授鉴定，阴干粉碎，
过 80 目筛保存待用。
1.2 仪器
FW7362M/24 电子分析天平（德国制造）；
SHB-111 循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限
公司）；HH-6 数显恒温水浴锅（金坛市杰瑞尔电器
有限公司）；T6 新世纪紫外可见分光光度计（北京普
析通用仪器有限责任公司）。
2 试验方法
2.1 柳兰样品的预处理
取待用柳兰样品用滤纸包好，放入索氏提取器中
用石油醚加热提取 6h 后置于通风处晾干。
2.2 芦丁标准溶液的配制
芦丁标准溶液：准确称取适量芦丁标准对照品，
加适量无水乙醇溶解，稍加热溶解，冷却后移入容量瓶，
用乙醇定容。
2.3 柳兰中总黄酮的提取
精密称取 2.00 g 经石油醚抽提后的柳兰样品，
置于圆底烧瓶中，按固液比为 1∶30（g •mL-1）加入
50% 的乙醇溶液，在 95℃的温度下加热回流提取 4h，
将提取液过滤后定容于 100mL。
2.4 标准曲线的绘制
准确移取 0mL、0.40mL、0.80mL、1.20mL、
1.60mL、2.00mL、2.20mL 芦丁标准溶液于 7 个
25mL 容量瓶中，各加入 1% 的 AlCl3 溶液 3.00mL，
用 10% 的乙醇定容，显色 20min 后在 417 nm 处测定
吸光度，同时以未加标准芦丁的溶液作空白参比。以
吸光度 A 为纵坐标，芦丁浓度 c 为横坐标作图，回归
方程为：A=28.766c+0.0062，R=0.9998。
0.5
0.45
0.4
0.35
0.3
0.25
0.2
0.1 5
0.1
0.5
0
吸
光
度
A
值
320 370 420 470 520 570
WL/nm
图 1 NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 显色法吸收曲线
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
吸
光
度
A
值
310 360 410 460 510 560
WL/nm
图 2 酸性条件下 AlCl3 显色法的吸收曲线
2.5 样品中总黄酮含量的测定
取适量样液于 25mL 容量瓶中，按照测定芦丁
标准液吸光度的步骤，同时做试剂空白，以试剂空
白为对照，于 417 nm 处测定吸光度 A；计算柳兰
中总黄酮的含量（%），重复 5 次，取平均值。按
下列公式计算：柳兰中总黄酮含量 =c×V1×V2/
(V3×W×1 000)×100%，式中：c 为由回归方程计算
得到的待测液的浓度，V1 为提取液体积（mL）；V2
为稀释后提取液体积（mL）；V3 为移取样液的体积
（mL）；W 为柳兰的重量。
3 结果与分析
3.1 显色方法的选择
采 用 两 种 显 色 方 法： 在 碱 性 条 件 下 的
NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 显色法和在酸性条件下
的 AlCl3 显色法分别实验。两种方法显色机理不同，
前者显色后溶液为橙红色，而酸性条件下 AlCl3 显
色法为黄色溶液。在 300 ～ 600 nm 检测最大波长，
见图 1 和图 2。
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由图1-2可见，芦丁标准品经AlCl3 显色后在417nm
处有较明显的吸收峰，而 NaNO2-Al(NO3)3-NaOH
显色法中芦丁与 Al3+ 配合物在可见光波长范围内
（390 ～ 780 nm）的峰值在 510 nm 左右，但该处的
吸收峰相对于 AlCl3 显色法较弱。考虑到柳兰的黄酮
提取液样品中可能含有较多的杂质，且在碱性条件下，
有些非黄酮类物质会在 510 nm 附近有最大或较强吸
收，因而选用 AlCl3 显色法测定柳兰中黄酮类化合物
具有更好的专属性。
3.2 溶剂的选择及样品预处理
黄酮类物质水溶性较差，醇溶性较好，常用甲醇
和乙醇作提取溶剂，但考虑到甲醇的毒性，而且乙醇
不仅可以去除一部分亲水性蛋白质、果胶及其他水溶
性杂质，而且毒性小，价格低廉，可以回收利用，因
此采用乙醇作为提取溶剂。但直接将柳兰用乙醇提取，
会不可避免地将脂溶性色素一起提取出来，为了消除
叶绿素等物质的影响，本试验采用 60 ～ 90℃沸程石油
醚索氏提取 6h的方法进行简单的提纯，排除部分干扰
物质。样品经石油醚脱脂、脱色脱蜡处理可提高总黄
酮的提取率。这可能是由于蜡质的破坏及脂类的消除，
有利于极性提取剂的渗透和黄酮类物质的渗出。
3.3 正交试验
在单因素试验的基础上，选取影响柳兰总黄酮
提取效果各因素中有意义的水平做正交试验，选择
乙醇的浓度（A）、料液比（B）、提取温度（C）、
提取时间（D）4 个因素，采用四因素三水平 L9（34）
正交试验表安排试验，确定最佳提取工艺，因素及
水平见表 1，试验分析结果见表 2，方差分析结果见
表 3。
水平
因素
乙醇浓度 (A)/
%
料液比 (B)/
(g/mL)
提取温度(C)/
℃
提取时间 (D)/
h
1 50 1∶30 75 2
2 60 1∶35 85 3
3 90 1∶40 95 4
表1 正交试验中的因素及水平
试验编号
因素
吸光度 合计
A B C D
1 1 1 1 1 0.289 0.289 0.291 0.869
2 1 2 2 2 0.422 0.417 0.452 1.291
3 1 3 3 3 0.802 0.781 0.795 2.378
4 2 1 2 3 0.371 0.368 0.372 1.111
5 2 2 3 1 0.235 0.233 0.236 0.704
6 2 3 1 2 0.247 0.293 0.244 0.784
7 3 1 3 2 0.616 0.623 0.616 1.855
8 3 2 1 3 0.439 0.434 0.446 1.319
9 3 3 2 1 0.135 0.132 0.135 0.402
K1 1.513 1.278 0.991 0.658
K2 0.866 1.105 0.935 1.31
K3 1.192 1.188 1.65 1.603
R 0.647 0.173 0.715 0.945
最优组 A1 B1 C3 D3
表 2 正交试验结果分析
芦永昌等 柳兰中总黄酮含量的测定
注：Ki代表各因素 i水平下吸光度的总和，R表示极差。
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由表2分析结果可知，因素C和D的第3水平较好，
因素A的第1水平较好， 因素B的3个水平差别不大。
于是选出来的最优提取条件是 A1B1C3D3，即柳兰中总
黄酮的最佳提取分离条件是：乙醇浓度为 50%，固液
比为 1∶30（g •mL-1），提取温度为 95℃，提取时间
4h。由表 3 可知，因素 C、D 高度显著，因素 A、B
不显著。影响柳兰中总黄酮提取的个因素主次顺序为：
提取时间>提取温度>乙醇浓度>料液比。
3.4 柳兰中总黄酮含量的测定
在最佳提取条件下，用 AlCl3 显色法测得柳兰中
总黄酮含量为 1.60%（RSD%=0.61，n=5）。
4 方法学考察
由于 AlCl3 显色法测定结果较 NaNO2-Al(NO3)3-
NaOH 显色法测定结果准确，对 AlCl3 显色法在线性
关系良好的基础上进一步进行方法学考察。
4.1 稳定性实验
按照绘制标准曲线时采用的显色方法在 417 nm 处
测定吸光度的稳定性，每隔 5min 测一次，结果表明，
该方法在 30min 内稳定性良好。
4.2 精密度实验
精密量取定容后的提取液，加入配好的AlCl3溶液，
再用 10% 乙醇定容至 25mL，待 20min 后在 417 nm
下测定吸光度，测得RSD%为 0.14%（n=5）。
4.3 回收率实验
称取已知含量经石油醚抽提后的柳兰干品 5 份，
每份 0.75 g，分别加入适量的芦丁对照品，按照
前述操作进行处理，测定吸光度，计算平均回收率
99.15%，RSD% 为 1.51（n=5）。结果表明，该方法
准确度良好。
5 小结
实验结果表明：柳兰中黄酮类化合物的最佳分离提
取条件为：乙醇浓度为 50%，固液比为1∶30（g •mL-1），
提取温度为 95℃，提取时间为 4h。用 AlCl3 显色法
测得柳兰中总黄酮的含量为 1.60%，样品平均回收率
为 99.15%，RSD 值为 1.51%。
参考文献：
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芦永昌等 柳兰中总黄酮含量的测定
因素 偏差平方和 自由度 F比 F临界值 显著性
A 0.627 2 13.933 19.000
B 0.045 2 1.000 19.000
C 0.938 2 20.844 19.000 *
D 1.402 2 31.156 19.000 *
误差 0.04 2
表 3 方差分析
注：*代表影响达显著水平（P＜ 0.05）。