全 文 ：铜污染对三叶草幼苗生长及活性氧代谢影响的研究 3
储　玲　刘登义 3 3 　王友保　李　影　刘慧君
(1 安徽师范大学 重要生物资源保护与利用研究安徽省重点实验室 ,生物多样性研究中心 ,芜湖 241000)
【摘要】　通过水培实验研究了重金属铜 (Cu)污染对三叶草 ( Trif olium pratense)幼苗生长及活性氧代谢系
统的影响. 结果表明 ,低浓度 Cu 污染 ( < 10mg·L - 1)对三叶草幼苗生长无明显抑制现象 ,甚至促进幼苗生
长 ,植株干重、鲜重和叶片可溶性蛋白及叶绿素含量均略微升高 ,丙二醛 (MDA) 水平降低 ,活性氧清除系
统内超氧化物歧化酶 (SOD) 、过氧化氢酶 (CA T)和过氧化物酶 ( POD)活性均略微升高 ,保护酶系统仍保持
平衡. 但随 Cu 浓度 (10～100mg·L - 1增加则显示出一定的负效应 ,三叶草幼苗与对照组相比 ,植株矮小 ,须
根短且数目少 ,植株干重、鲜重和可溶性蛋白含量均明显减少 ,叶片发黄 ,叶片色素含量下降 ,并随 Cu 浓
度的增加而变化更显著. 同时 ,随 Cu 浓度增加 ,叶片细胞膜透性增大 ,电导率显著升高 ,MDA 水平上升 ,且
活性氧清除系统遭到破坏 ,保护酶系统失衡 , SOD 和 CA T 活性显著下降 ,分别降低了 26. 7 %和71. 3 % ,而
POD 活性却明显上升 ,比对照升高了 10. 6 倍.
关键词 　铜 　三叶草 　生长 　活性氧 　代谢
文章编号 　1001 - 9332 (2004) 01 - 0119 - 04 　中图分类号 　X171. 5 　文献标识码 　A
Effect of copper pollution on seedling growth and activate oxygen metabolism of Trif olium pratense. CHU
Ling ,L IU Dengyi , WAN G Youbao , L I Ying , L IU Huijun ( Provincial Key L aboratory of Conservation and
Ex ploitation of Biological Resources in A nhui , Biodiversity Research Center , A nhui Norm al U niversity ,
W uhu 241000 , China) . 2Chin. J . A ppl . Ecol . ,2004 ,15 (1) :119～122.
The effect of copper ( Cu) pollution on the seedling growth and activate oxygen metabolism of Trif olium
pratense was studied by water cultivation experiments. The results showed that under low concentration of Cu
( < 10mg·L - 1) , the growth of Trif olium pratense seedlings could be improved , their fresh/ dry weight and the
contents of soluble protein and chlorophylls in leaves increased slightly , the MDA content of leaf cells decreased ,
the activities of SOD , CA T and POD in the activate oxygen metabolism system slightly increased , and the bal2
ance of protective enzyme system was hold. However , with the increase of Cu concentration (10～100mg·
L - 1) , there existed an obvious negative effect on the growth of Trif olium pratense seedlings. The seedlings un2
der high concentrations of Cu were shorter and smaller , their fibrous roots were shorter and fewer , and their
fresh/ dry weight and the contents of soluble protein and chlorophylls in leaves decreased drastically. With the in2
crease of Cu concentration , the membrane penetration , electric conductivity and MDA content of leaf cells in2
creased. Furthermore , the activate oxygen metabolism system was destroyed , the balance of protective enzyme
system was broken , the activities of SOD and CA T decreased by 26. 67 % and 71. 31 % , respectively , while the
POD activity increased by 10. 6 times.
Key words 　Copper , Trif olium pratense , Growth , Activate oxygen , Metabolism.3重要生物资源保护与利用研究安徽省重点实验室专项基金、安徽省自
然科学基金(03043501) 、教育部科学技术重点研究基金资助项目.3 3 通讯联系人
2003 - 07 - 08 收稿 ,2003 - 09 - 08 接受.
1 　引 　　言
近年来 ,随着矿产的大量开采和冶金工业的迅
速发展 ,大量重金属 Cu、Pb、Zn、As 等进入环境 ,造
成严重污染. Cu 作为一种重要的金属 ,其污染物在
生态系统中的危害 ,也引起了国内外有关研究人员
的重视 ,吴燕玉[14 ] 、余国营 [17 ] 、郑春荣 [18 ] 、胡正
义[6 ] 、Abuzid[1 ]等学者对此从不同角度进行过深入
研究 ,但研究对象多为水稻、小麦、玉米等栽培农作
物 ,而对野生植物受重金属毒害研究甚少 ,而且 ,在
开采矿产资源过程中产生的固体废弃物堆积成的尾
矿废弃地上还以野生自然定居的植物为多 ,特别是
耐贫瘠耐干旱的豆科植物. 故本文以安徽铜陵铜尾
矿废弃地的主要复垦植物三叶草为例[5 ] ,通过水培
实验研究了 Cu 对豆科植物三叶草几项生理生态指
标的影响 ,为深入研究 Cu 对三叶草的伤害及三叶
草的耐铜机制提供参考 ,并为进一步开展对铜尾矿
废弃地的植被复垦工作提供参考途径.
2 　材料与方法
211 　实验材料与设计
21111 供试植物 　三叶草 ( Trif olium pratense) 采于安徽铜
陵五公里铜尾矿废弃地 ,在同一繁殖系内选取植株高度、生
物量大致相同三叶草幼苗 ,自来水、蒸馏水各冲洗数次 ,直至
蒸馏水中检测不出 Cu 离子 ,然后用 Hoagland 营养液稳苗栽
培 2 d ,于实验前用剪刀剪取 1cm 长的匍匐茎 (每茎保留 3 片
应 用 生 态 学 报 　2004 年 1 月 　第 15 卷 　第 1 期 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
CHIN ESE JOURNAL OF APPL IED ECOLO GY ,Jan. 2004 ,15 (1)∶119～122
营养叶) ,且每匍匐茎上须根等数 (5 根)等长 (0. 5cm) .
21112 实验设计 　以 Hoagland 营养液为稀释液 ,一次性加
入 CuSO4·5H2O ,使溶液含 Cu 量 (以纯 Cu 计算) 分别为 10、
20、50、100 mg·L - 1 ,以培养液为对照 (培养液中 Cu 浓度为
0. 32 mg·L - 1 ,可不考虑其影响) [13 ] . 在直径为 18cm 的塑脂
餐盒中分别加入上述处理液 400ml ,每盒中放 10 株植物体 ,
设 3 个重复. 在 20 ℃/ 17 ℃、9000～12000 Lx 下培养 ,每天光
照 14h. 各处理每 3 天更换处理液一次 ,培养 14 d ,取样分
析.
212 　测试指标与方法
21211 植株生长状况的测定 　测定最长根长、平均根长、平
均须根数、地上部分高度及植株干重和鲜重生物量.
21212 叶片细胞膜透性的测定 　称取三叶草叶片 0. 2g ,剪
成 1cm 长小段 ,加入装有 20ml 双蒸水的三角瓶中 ,于电动振
荡机上以 400 次·min - 1的速度振荡 1h ,用 DDS212 型电导
仪测定电导率 (μs·cm - 1) .
21213 叶片色素含量的测定 　分别取鲜叶 0. 25g ,采用分光
光度法[3 ] ,用 80 %丙酮研磨提取后 ,于 665、645 和 440nm 处
测定光密度 (mg·g - 1·FW) .
21214 蛋白质含量的测定 　采用考马斯亮蓝 G2250 法[19 ] ,
于 595nm 波长处测定光密度.
21215 MDA 水平的测定 　按林植芳的硫代巴比妥酸 ( TBA)
法[3 ]测定 (μmol·g - 1·FW) .
21216 POD 活性的测定 　采用分光光度法 [3 ] ,以每分钟光
密度的变化值 ,即ΔOD470 min - 1·g - 1 FW 表示酶活性单位.
21217 CA T 活性的测定 　采用过氧化氢分解量法[11 ]测定
(U·g - 1·FW·min - 1) .
21218 SOD 活性的测定 　参照陈建勋的方法 [19 ] ,利用其对
氮蓝四脞 (NB T) 的光抑制作用 ,酶液在 12000r·min - 1冷冻
离心 20min ,于 560nm 处测定光密度 (ΔOD560 ·g - 1 ·FW·
h - 1) .
3 　结果与讨论
311 　Cu 处理对三叶草生长的影响
　　在 Cu 胁迫下 ,三叶草受到的影响显而易见 ,植
株表现出单株鲜重、干重、叶片可溶性蛋白质含量、
平均须根数、平均须根长、最长须根长及地上部分高
度均在低 Cu 浓度 ( < 10mg·L - 1) 时略微升高 ,然后
随着 Cu浓度增加而递减 (表 1) ,但总体呈递减趋势 ,相
关系数 r 分别为 - 0. 90443 3 、- 0. 8804 3 、- 0. 84893 、
- 0. 93133 3 、- 0. 93663 3 、- 0. 87393 、- 0. 94793 3 ( 3 显
著相关性 ,3 3 极显著相关性 ,下同) ,为显著或极显著负
相关.这和受重金属元素影响植株根尖细胞有丝分裂数
明显减少 ,分裂速度减慢 ,以致生物量减少的报道相
符合[2 ] . 究其原因可能是因为 Cu 是植物生长发育
必需的微量元素 ,所以低浓度 Cu 能促进植物生长 ;
而高浓度溶液中产生 Cu 毒害 ,是通过影响酶促生
理活动 ,进而对植物的光合、呼吸代谢功能产生不良
影响 ,从而使三叶草表现出生长不良[18 ] .
表 1 　不同 Cu处理对三叶草生长的影响
Table 1 Effect of Cu treatments on the growth of Trif olium pratense
项目
Items
Cu 浓度 Cu concentration (mg·L - 1)
0 (CK) 10 20 50 100
单株鲜重 Fresh weight of each plant (mg) 829. 9 1035. 2 836. 8 671. 4 460. 0
单株干重 Dry weight of each plant (mg) 81. 2 92. 5 85. 4 77. 0 65. 0
蛋白质含量 Protein content (mg) 33. 1 55. 0 41. 3 26. 2 8. 4
平均须根数 Number of root 11. 0 13. 0 9. 0 8. 0 4. 0
平均须根长 Average length of root (cm) 3. 0 2. 8 2. 2 2. 0 1. 5
最长须根长 Max. length of root (cm) 4. 0 4. 5 4. 5 3. 5 3. 0
地上部分高 Above2ground height (cm) 15. 0 17. 0 14. 0 10. 0 7. 0
312 　Cu 处理对三叶草叶片电导率的影响
　　细胞膜是选择透过性膜 ,它能调节和控制细胞
内外物质的运输和交换 ,其透性是评定植物对污染
物反应的指标之一. 三叶草叶片外渗液电导率随溶
液中 Cu 浓度的增加先增后减再速增 ,总体呈上升
趋势 , 呈极显著正相关 (图 1 ) , 相关系数 r =
0. 9382 3 3 ,回归方程为 Y = 53. 2639 + 0. 9706 ×X.
研究结果表明 ,Cu 处理对叶片电导率影响明显 ,在
Cu 处理下 ,10、20、50 和 100mg·L - 1浓度情况下 ,叶
片电导率分别是对照组的 157. 832 %、141. 391 %、
159. 381 %和 317. 213 %. 可见 ,低浓度 Cu 处理 ,叶
片电导率虽先增后减 ,但对三叶草影响很小 ,而随着
处理液浓度的增大 ,对植株的影响特别显著. 其原因
图 1 　Cu 处理对三叶草叶片电导率的影响
Fig. 1 Effect of Cu treatments on electric conductivity of Trif oli um
pratense leaf .
可能是 Cu 为植物生长必需元素 ,所以少量 Cu 对植
物影响很小 ;但大量 Cu 进入三叶草后 ,Cu 与细胞膜
蛋白的 - SH 或磷脂分子层的磷脂类物质反应 ,造
成膜蛋白的磷脂结构改变 ,致使细胞膜结构改变 ,膜
系统遭受损坏 ,透性增大 ,使细胞内一些可溶性物质
外渗 ,从而电导率增大[12 ] .
313 　Cu 处理对三叶草叶片色素含量的影响
　　叶绿素是植物进行光合作用的色素 ,叶绿素含
量高低在一定程度上反映了光合作用水平 ,叶绿素
含量低 ,光合作用弱 ,会导致植物鲜重降低. 三叶草
021 应 　用 　生 　态 　学 　报 　　　　　　　　　　　　　　　　　　15 卷
经 Cu 处理后 ,叶片叶绿素 a、叶绿素 b、叶绿素 a + b
和类胡萝卜素含量均在低 Cu 浓度 ( < 10mg·L - 1 )
时增高 ,然后随 Cu 浓度增加而递减 ,总体呈下降趋
势 ,呈负相关性(图 2) ,相关系数 r 分别为 - 0. 9520 3 3 、
- 0. 9465 3 3 、- 0. 9506 3 3 和 - 0. 8593 3 . 随 Cu 浓度增
加 ,叶绿素含量先微增后递减 ,可能是因为少量 Cu 弥
补了植物体内质体蓝素所需 ,而质体蓝素又是光合
作用的电子传递体系中的一员 ,故低浓度 Cu 使叶
绿体含量先微增 ;而叶绿体含量后递减可能是由于
高浓度 Cu 进入植物体内使叶绿体酶活性失调 ,致
使叶绿素分解加快. 同时 ,由于 Cu 局部积累较多 ,
与叶绿体中蛋白质上 - SH 结合或取代其中 Fe2 + 、
Zn2 + 、Mg2 + 致使叶绿素蛋白中心离子组成发生变
化而失活.
图 2 　Cu 处理对三叶草叶片色素含量的影响
Fig. 2 Effect of Cu treatments on leaf pigment content of Trif oli um
pratense.
Ⅰ. 叶绿素 a Chlorophyll a , Ⅱ. 叶绿素 b Chlorophyll b , Ⅲ. 叶绿素 a +
b Chlorophyll a + b , Ⅳ. 类胡萝卜素 Carotenoid.
314 　Cu 处理对三叶草膜脂过氧化水平的影响
　　MDA 是膜脂过氧化的重要产物 ,可与蛋白质、
核酸、氨基酸等活性物质交联 ,形成不溶性的化合物
(脂褐素)沉积 ,干扰细胞的正常生命活动[15 ] . 三叶
草 MDA 含量随 Cu 浓度增大先略降而后逐渐升高
(图 3 ) , 呈 极 显 著 正 相 关 性 , 相 关 系 数 r 为
0. 9924 3 3 .在 Cu 处理下 ,10、20、50 和 100mg·L - 1
的浓度情况下 ,叶片 MDA 含量分别是对照组的
96. 65 %、110. 68 %、154. 93 %、218. 24 %. 高浓度 Cu
处理使植物体内 MDA 高度积累 ,其含量的增加显
示膜脂过氧化水平升高 ,造成膜透性增大 ,膜结构受
损伤程度加深 ,使作物的抗逆能力减弱[7 ] ;而低浓
度 Cu 处理不会损害植物 ,因为 Cu 是植物生长必需
微量元素 ,这和前文所述一致.
图 3 　Cu 处理对三叶草 MDA 水平的影响
Fig. 3 Effect of Cu treatments on the MDA content of Trif oli um
pratense .
315 　Cu 对三叶草 POD、SOD、CA T 活性的影响
　　POD、SOD、CA T 共同组成植物体内一个有效
的活性氧清除系统 ,三者协调一致的共同作用 ,能有
效清除植物体内的自由基和过氧化物[4 ,8 ,15 ] . 在一
定范围内 ,SOD、CA T 共同作用能把 O2 -. 和 H2O2 转
化成 H2O 和 O2 ,并能起到减少具毒性和高活性的
·OH的形成 , POD 和 CA T 则可催化 H2O2 形成
H2O ,从而有效阻止 O2 -. 和 H2O2 的积累 ,限制这些
自由基对膜脂过氧化的启动[7 ,9 ,10 ,16 ] .
图 4 　Cu 处理对三叶草 POD、SOD 和 CAT 活性的影响
Fig. 4 Effect of Cu treatments on the activity of POD ,SOD and CAT of
Trif oli um pratense.
　　重金属 Cu 处理后 ,三叶草体内活性氧清除系
统遭到破坏 ,叶片内 SOD 和 CA T 活性随 Cu 浓度的
增高先略微增高再递减 (图 4) ,但总体均呈下降趋
势 ,分别呈显著和极显著负相关性 ,相关系数 r 分别
为 - 0. 9110 3 和 - 0. 9361 3 3 ;而叶片内 POD 活性随
Cu 浓度的增高后略降而后迅速增加 ,呈极显著正相
关性 ,相关系数 r 为 0. 9817 3 3 . 三叶草体内 SOD、
CA T 活性随 Cu 浓度升高而变化的过程中 ,在 10mg
·L - 1Cu 浓度处理下都略微升高 ,POD 活性也升高 ,
1211 期 　　　　　　　　　　储 　玲等 :重金属铜污染对三叶草幼苗生长及活性氧代谢影响的研究 　　　　　　　　　
活性氧清除系统能保持平衡 ,从而保证植物体自身
正常的生长代谢. 这和前文三叶草植株长势、植株干
重、鲜重、蛋白质含量、叶绿素含量、叶片电导率等指
标随 Cu 浓度升高而总体上降低的过程中于低浓度
( < 10mg·L - 1)时出现的略微升高现象所述一致. 而
随着 Cu 浓度增高 ,三叶草体内活性氧清除系统中
SOD、CA T、POD 3 种酶平衡被破坏 ,不能有效阻止
O2 -. 和 H2O2 的积累 ,从而影响植物体的正常生长代
谢 ,使之出现受毒害症状.
4 　结 　　论
411 　低浓度 Cu 污染 ( < 10mg·L - 1) 对三叶草幼株
生长没有明显伤害现象 ,甚至促进生长 ,其长势良
好 ;而随 Cu 浓度增加 ,可造成幼株生长缓慢、长势
不良 ,生物量下降 ,叶片发黄 ,叶片色素下降.
412 　低浓度 Cu 污染 ( < 10mg·L - 1) 使三叶草植物
细胞内的保护酶 SOD、POD、CA T 活性均略微升高 ,
但仍保持平衡 ,幼株生理代谢正常 ;而随 Cu 浓度的
增加 ,造成植物细胞内保护酶 SOD、POD、CA T 活性
比例失调 ,使植物体内活性氧的产生和清除系统失
衡 ,并利于活性氧产生 ,导致植物生理代谢紊乱 ,从
而加速植物衰老和死亡.
413 　高浓度 Cu 污染 ( > 10mg·L - 1) 对三叶草体内
活性氧清除系统的破坏 ,造成了 MDA 高度积累 ,细
胞膜透性增大 ,致使细胞内酶及原代谢作用区域受
到破坏 ,加速组织、细胞衰老 ,引起三叶草叶片色素
含量下降 ,生长缓慢 ,生物量下降. 三叶草叶片电导
率的迅速升高也证实了这一点.
参考文献
1 　Abuzid MM , et al . 1992. Copper pollution on plants and the uptake
of heavy metals by corn seedlings. Moscow U niv Soil Sci B ull ,47
(3) :37～39
2 　Chen G2Z(陈桂珠) , et al . 1990. Study on the effect of heavy met2
als on the growth of cucumber seedling. Chin Bot B ull (植物学通
报) ,7 (1) :240～243 (in Chinese)
3 　Chen J2X (陈建勋) , et al . 2002. Plant Physiology Experimenta2
tion. Guangzhou : South China Science and Engineering University
Press. (in Chinese)
4 　Chis B , et al . 1992. Superoxide dismutase and stress tolerance. A n2
nu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol ,42 (1) :83～116
5 　Chu L (储　玲) , et al . 2003. Investigation on the vegetation con2
dition of copper tail mining wasteland in Tongling( Wugongli) ,An2
hui. J Biol (生物学杂志) ,19 (1) :15～19 (in Chinese)
6 　Hu Z2Y(胡正义) , et al . 2000. Distribution of Cu in soil2crop sys2
tem polluted by Cu. Envi ron Sci (环境科学) ,21 (2) :62～65 (in
Chinese)
7　Liu D2Y (刘登义) , et al . 2002. Effect of sewage irrigation on
wheat growth and its activate oxygen metabolism. Chin J A ppl
Ecol (应用生态学报) ,13 (10) :1319～1322 (in Chinese)
8 　Ma C2C(马成仓) . 1998. Hg harm on cell membrance of rape leaf
and cell endogenous protection effect . Chin J A ppl Ecol (应用生态
学报) ,9 (3) :323～326 (in Chinese)
9 　Panla KP , Thompson J E. 1984. Evidence for the accumulation of
peroxidized lipids in membranes of senescing cotyledons. Plant
Physiol ,75 :1152～1157
10 Scandalios J G. 1993. Oxygen stress and superoxide dismutase.
Plant Physiol ,101 (1) :7～12
11 　Shandong Agricultural College (山东农学院 ) eds. 1980. Plant
Physiology Experimentation. Jinan :Shandong Science and Technol2
ogy Press. 109～112 (in Chinese)
12 　Wang Y2B (王友保) , et al . 2001. Effect of Cu ,As and their com2
bination pollution on eco2physiological index of wheat . Chin J A ppl
Ecol (应用生态学报) ,12 (5) :773～776 (in Chinese)
13　Wang Y2B (王友保) , et al . 2002. Effect of Cu2 + on growth of
root2pruning crop . J Normal U niv (安徽师范大学学报) ,25 (2) :
172～174 (in Chinese)
14 　Wu Y2Y (吴燕玉) ,et al . 1998. Dynamic migration of Cd ,Pb ,Cu ,
Zn and As in agricultural ecosystem. Acta Sci Ci rcums (环境科学
学报) ,18 (4) :407～414 (in Chinese)
15 　Xu Q2S (徐勤松) , et al . 2001. Effects of Cd2 + on antioxidase sys2
tem and ultrastructure of Ottelia alismoides (L . ) . R ural Eco2Env2
i ron (农村生态环境) ,17 (2) :30～34 (in Chinese)
16 　Yan C2L (严重玲) , et al . 1997. Effect of Cd ,Pb stress on scareng2
ing system of activated oxygen in leaves of tobacco. Acta Ecol S in
(生态学报) ,17 (5) :488～492 (in Chinese)
17 　Yu G2Y (余国营) , et al . 1995. Impact of heavy metal combined
pollution on soybean growth and its integrated assessment . Chin J
A ppl Ecol (应用生态学报) ,6 (3) :433～439 (in Chinese)
18 　Zheng C2R (郑春荣) , et al . 1990. Transfer of heavy metal through
soil2plant system and its influence on the growth of rice. Acta Sci
Ci rcums (环境科学学报) ,10 (2) :145～152 (in Chinese)
19 　Zhu G2L (朱广廉) ,et al . 1990. Plant Physiology Experimentation.
Beijing : Peking University Press. 51～53 , 126～130 (in Chinese)
作者简介 　储 玲 ,女 ,1977 年 6 月生 ,硕士研究生 ,主要从事
污染生态学和恢复生态学研究 ,已发表论文 3 篇. Tel :
055323869193 E2mail : ldy @mail. ahnu. edu. cn
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