全 文 ：培养条件对海洋假单胞菌脂肪酸的影响 3
叶芳挺1 　严小军1 3 3 　郑　立2 ,3 　徐继林1 　陈海敏1
(1 宁波大学生命科学与生物工程学院 ,宁波 315211 ;2 中国科学院海洋研究所 ,青岛 266071 ;3 国家海洋局第一海洋研究所 ,
青岛 266061)
【摘要】　研究了不同温度条件下一株海绵附生假单胞菌 ( Pseudomonas sp . )在不同碳源培养基中的生长情
况及脂肪酸变化. 结果表明 ,该海洋菌生长最适温度为 30 ℃,在以淀粉作为外加碳源的培养基中生长最
好 ;实验菌含 13 种脂肪酸 ,主要是 c16 :1 (n27) 、c15 :0、c16 :0、c17 :0、c18 :1 (n26) 、c18 :1 (n29) 、9 ,102cp2c17 :0
和其同分异构体. 在 30 ℃温度条件下 ,不饱和脂肪酸的相对含量急剧减少. 在有外加碳源 (葡萄糖和淀粉)
的培养基中生长的细菌 ,奇数脂肪酸和环丙基脂肪酸含量远比未外加碳源的低. 聚类分析结果表明 ,两种
环境因子中 ,温度比碳源的影响更明显.
关键词 　海洋假单胞菌 　培养条件 　脂肪酸
文章编号 　1001 - 9332 (2005) 05 - 0967 - 04 　中图分类号 　Q936 　文献标识码 　A
Effects of culture condition on fatty acids in Pseudomonas sp. YE Fangting1 , YAN Xiaojun1 ,ZHEN G Li2 ,3 ,XU
Jilin1 ,CHEN Haimin1 (1 Faculty of L if e Science and Biotechnology , N ingbo U niversity , N ingbo 315211 , China ;
2 Institute of Oceanology , Chinese Academy of Sciences , Qingdao 266071 , China ;3 First Institute Oceanography
of S OA , Qingdao 266061 , China) . 2Chin. J . A ppl . Ecol . ,2005 ,16 (5) :967～970.
The investigation on the growth of Pseudomonas sp . and the dynamics of its fatty acids under various culture
conditions indicated that the optimum temperature for its growth was 30 ℃,and the best carbon source was
starch. 13 kinds of fatty acids were detected ,among which ,c16 :1 (n27) ,c15 :0 ,c16 :0 ,c17 :0 ,c18 :1 (n26) ,c18 :1
(n29) ,9 ,102cp2c17 :0 and iso9 ,102cp2c17 :0 were the major ones. When cultured at 30 ℃,the relative content of
unsaturated fatty acids decreased significantly. Carbon source in the media was the crucial factor affecting the
contents of odd2 and cyclopropane fatty acids. Cluster analysis revealed that temperature had a more obvious effect
than carbon source.
Key words 　Marine bacterium ( Pseudomonas sp . ) , Culture condition , Fatty acids.3 3 国家自然科学基金重点项目 (29932030)和国家科技部新药博士
基金资助项目 (2003AA2Z3511) .3 3 通讯联系人. E2mail :xiaojunyan @hotmail. com
2004 - 04 - 14 收稿 ,2004 - 08 - 02 接受.
1 　引 　　言
脂肪酸是脂质双分子层或脂多糖的组成成分之
一 ,在微生物细胞中的一类重要组分. 细菌中已经发
现 300 多种脂肪酸. 它们与细菌的遗传变异、耐药性
等关系极为密切 ,其种类和含量是细胞分类法的重
要信息之一[30 ] . 目前 ,在微生物脂肪酸方面的研究
工作主要集中于利用脂肪酸作为分类依据来鉴定细
菌 ,并利用脂肪酸指纹分析环境中微生物群落的组
成[3 ,4 ,9 ,25 ] ,以脂肪酸作为指标研究寄生微生物与宿
主之间的生态关系[7 ] . 这些方法简化了传统研究中
的繁琐步骤[24 ,27 ,28 ] .
研究表明 ,细胞膜组成与生长阶段、培养基成
分、温度等有关[14 ] ,而脂类又是细胞膜的重要组成.
国外已有培养条件对细菌中脂肪酸变化的研究报
道[11 ,15 ] ,国内相关报道较少. 近几年在海洋微生物
中发现许多有生物活性价值的天然产物[17 ] ,其中相
当一部分在陆源生物中未发现 ,其生长特性、环境影
响因素等尚未做深入细致的研究. 对一株海绵附生
假单胞菌 ( Pseudomonas sp . ) 的研究表明 ,该细菌的
次级产物具有抗菌及细胞毒活性. 为了解该细菌的
其他生物学性质 ,在不同培养温度条件下 ,研究了其
脂肪酸在不同培养基下的变化情况 ,探索培养条件
和该细菌的脂肪酸组成之间的关系 ,为脂肪酸作为
海洋细菌分类依据提供实验支持.
2 　材料与方法
211 　供试材料
实验所用菌株为宁波大学保藏菌株 ,分离于海绵 ( Hy2
meniacidon perleve) ,经鉴定为假单胞菌 [20 ,24 ] . 菌种的基础培
养基为 Zobell 2216E培养基 (marine broth , MB) ,其组成成分
应 用 生 态 学 报 　2005 年 5 月 　第 16 卷 　第 5 期 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
CHIN ESE JOURNAL OF APPL IED ECOLO GY ,May 2005 ,16 (5)∶967～970
为胨 5 g、酵母提取物 1 g、FePO4 011 g、琼脂 15 g、海水 1 L 、
p H为 712～716. 另 2 种培养基分别为在 MB 培养基基础上
加碳源葡萄糖 ( G)和淀粉 (ST)各 1 g. 于 20 ℃、25 ℃和 30 ℃
分别在 3 种培养基中进行培养. 期间定期取样 ,用 Therma
M K3 酶标仪 (美国 LABSYSTEMS 公司) 630 nm 测定吸光
度 ,以表示细菌生长密度. 培养进入平台期结束. 然后 ,将菌
液在 5 000 ×g 离心 30 min , FD5505 冷冻干燥机 (韩国 IL2
SHIN 公司 ) 干燥. 称取 30 mg 菌体干品 ,参考改进后的
Bligh2Dyer 法[2 ]提取总脂. 皂化处理和脂肪酸甲酯化参见徐
继林等[29 ]方法.
212 　研究方法
21211 脂肪酸 ( GC2MS) 分析 　用 QP2010 GC2MS 仪 (日本
SHIMADZU 公司) 、30 m ×0125 mm ×0125μm SPB250 色谱
柱 (美国 SU PELCO 公司)进行分析. 气相色谱 ( GC) 条件 :进
样口温度 250 ℃,载气为高纯氦 ,柱流速 0181 ml·min - 1 ,柱
前压 7310 kPa ,柱起始温度 150 ℃,保持 315 min ,以 20 ℃·
min - 1升至 200 ℃,保持 5 min ,再以 5 ℃·min - 1升至 280 ℃,
保持 15 min. 分流进样 1μl ,分流比 50∶1. 质谱 (MS)条件 :用
电子轰击源 ( EI) 分析 ,电子能量为 70 eV ,离子源温度 200
℃,接口温度 250 ℃,选取全程离子碎片扫描 (SCAN) 模式 ,
质量扫描范围为 40～650 ,溶剂延迟 315 min.
21212 脂肪酸的定性与定量 　在上述分析条件下 ,每个脂肪
酸组分有各自保留时间 ,即为定性依据之一. 从气相色谱2化
学离子源质谱2总离子流图 ( GC2CIMS2TIC) 中各组分的质谱
可以初步确定出各组分的分子量 ;再根据气相色谱2电子轰
击源质谱2总离子流图 ( GC2EIMS2TIC) 中各组分的离子碎片
质量谱图 ,通过 N IST 谱库检索并参考脂肪酸标准谱图定性
出所有的脂肪酸. 用面积归一法 [29 ]求得各脂肪酸相对百分
含量 ,3 个平行实验组取平均值.
21213 数据处理 　应用 SPSS 1115 统计分析软件进行影响
因子聚类分析. 按 9 组不同的培养条件进行聚类 ,各脂肪酸
的相对含量作为变量 ,应用欧几里德距离平方 ( Squared Eu2
clidean distant)作为聚类统计量[18 ] .
3 　结果与讨论
311 　不同培养条件下假单胞菌生长状态
由图 1 可见 ,30 ℃下培养的细菌生长情况明显好
于 20 ℃和25 ℃,而20 ℃和25 ℃下细菌生长无太大差
别.外加葡萄糖和淀粉的培养基中细菌生长情况好于
MA 培养基 ,此差异在 30 ℃下尤为明显.
有关 Pseudomonas 属海洋细菌生长最适温度的报
道较少 ,陈秀兰等[5]曾分离得到一株深海 Pseudomonas
属菌 SM9915 ,为一适冷菌 ,其最佳生长温度为 20 ℃.
本实验菌分离自我国浙江省南麂岛潮间带的海绵 ,由
于环境温度相对较高 ,导致实验细菌最适生长温度偏
高.外加碳源的培养基中细菌生长情况比没外加碳源
的好 ,表明有机碳源能促进该细菌的生长.
图 1 　不同培养条件下假单胞菌的生长比较
Fig. 1 Comparison of bacterium growth under different culture condi2
tions.
1) 20 ℃, MB ; 2) 20 ℃, MB + G; 3) 20 ℃, MB + ST ; 4) 25 ℃, MB ;
5) 25 ℃, MB + G; 6) 25 ℃, MB + ST ; 7) 30 ℃, MB ;8) 30 ℃, MB +
G;9) 30 ℃, MB + ST1
312 　菌体脂肪酸组成
测定了 9 种不同培养条件下菌体脂肪酸组成
(表 2) ,各脂肪酸的保留时间见图 2 (实验组 2) . 13
种脂肪酸中 ,以 c16 :1 ( n27) 、c16 :0、c18 :1 ( n26) 、9 ,
102cp2c17 : 0、iso29 , 102cp2c17 : 0、c15 : 0 和 c17 : 0 为
主 ,其中 c16 :0、c16 :1 (n27) 和 c18 :1 (n26) 所占的比
例较高 , 分别为 18139 % ～ 35109 %、24139 % ～
43126 %和 4167 %～1319 %. c18 :1 ( n29) 、c16 :1 ( n2
9) 的含量较少 ,分别为 0～2134 %和 0～1125 % ,
c16 :1 (n27) 含量高和 c18 :1 ( n29) 、c16 :1 ( n29) 含量
低. 该结果与 Pseudomonas atlantica [12 ] 和 Pseu2
domonas puti da [21 ] 相 同. 偶 数 脂 肪 酸 含 量 占
60177 %～88154 % ,明显高于奇数脂肪酸 11146 %
～39123 % ,符合细菌的脂肪酸组成为偶数脂肪酸
(碳原子从 12 到 18) 的特征[16 ] . 此外 ,从本实验细
菌中还鉴定出 2 种带有环丙基的 17 碳脂肪酸 ,而
Doumenq 等[8 ]和 Rosa[22 ]研究的 Pseudomonas 属细
菌中并没有发现这一现象.
图 2 　第 2 实验组 (20 ℃、MA + G)样品脂肪酸甲酯的 GC2EIMS2TIC
图
Fig. 2 Fatty acids GC2EIMS2TIC of the second sample.
1) c14 :0 ;2) c15 :0 ;3) 7 ,82cp2c15 :0 ;4) c16 :0 ;5) c16 :1 (n29) ;6) c16 :1
(n27) ;7) c17 :0 ;8) 9 ,102cp2c17 :0 ;9) iso29 ,102cp2c17 :0 ;10) c18 :0 ;11)
c18 :1 (n29) ; 12) c18 :1 (n26) .
869 应 　用 　生 　态 　学 　报 　　　　　　　　　　　　　　　　　　16 卷
表 2 　不同培养条件下脂肪酸变化 3
Table 2 Changes of fatty acids under different culture conditions( %)
脂肪酸
Fatty acids
1 2 3 4 5 6 7 8 9
c14 :0 1174 1166 2114 1159 1161 1192 1198 2102 1150
c15 :0 3137 2152 1155 3162 3107 1172 6103 5142 4165
7 ,82cp2c15 :0 1192 1118 0178 1132 1112 0156 1164 0166 -
142m2c16 :0 - - - - - - - 0144 -
c16 :0 18139 22142 23160 22108 24147 28136 24156 35109 32182
c16 :1 (n29) 1125 1117 1134 0178 0195 0198 - - -
c16 :1 (n27) 41186 41132 43126 36193 39124 43127 24139 26117 24174
c17 :0 3121 3115 1183 4108 3185 211 10127 9151 9187
9 ,102cp2c17 :0 8178 7123 4156 8153 8126 4147 21129 6131 9109
iso29 ,102cp2c17 :0 7151 5136 3134 7172 5137 2161 - 6143 5106
c18 :0 1147 1138 2122 2191 1138 1133 2183 1173 2123
c18 :1 (n29) 1137 1104 1145 1165 0183 0192 2134 - 1105
c18 :1 (n26) 9113 11157 13190 8179 9185 11176 4167 6122 8199
饱和 Saturated 46139 44190 40105 51185 49113 43107 6816 67161 65122
不饱和 Unsaturated 53161 55110 59195 48115 50187 56193 3114 32139 34178
环丙基 CFA 18121 13177 8171 17157 14175 7164 22193 13140 14115
奇数 Odd 24179 19144 12109 25127 21167 11146 39123 28133 28167
偶数 Even 75121 80156 87191 74173 78133 88154 60177 71167 71133
1) 20 ℃, MB ; 2) 20 ℃, MB + G; 3) 20 ℃, MB + ST ; 4) 25 ℃, MB ; 5) 25 ℃, MB + G; 6) 25 ℃, MB + ST ; 7) 30 ℃, MB ;8) 30 ℃, MB + G;9)
30 ℃, MB + ST1 - 未检出 Undetected1
313 　温度、碳源对假单胞菌脂肪酸的影响
本实验以实验细菌脂肪酸相对含量为变量 ,应
用样品聚类分析 9 种不同培养条件对脂肪酸含量影
响的差异 (图 3) . 结果表明 ,前 6 组 (1～6 ,20 ℃或
25 ℃)和后 3 组 (7～9 ,30 ℃)之间存在较大差异 ,说
明当温度升高到 30 ℃时脂肪酸相对含量产生很大
变化 ,不饱和脂肪酸含量由 20 ℃和 25 ℃时的
53161 %～ 59195 %和 48115 %～ 56193 %下降到
3114 %～34178 % ,不饱和脂肪酸含量则和细胞膜流
动性有关[19 ,26 ] . 这种趋势在不同培养基中无明显差
异 ,表明温度对细菌脂肪酸含量的影响比培养基的
影响更显著 ,与文献[8 ,14 ]相似. 而 20 ℃和 25 ℃之间
的影响差异则没有 30 ℃明显.
图 3 　不同实验条件聚类分析图
Fig. 3 Clustering statistics of different culture conditions.
　　碳源不同也会造成细菌脂肪酸含量的差异. 从
7～9 组可以看出 ,在 30 ℃下培养 ,有外加碳源的 8、
9 两组的差异很小 ,但第 7 组却与之存在明显不同
(图 3) . 同样 ,在 1～6 组中 ,以淀粉为外加碳源培养
的细菌 (3、6 组)脂肪酸含量与其它两种培养基条件
下生长也存在差异. 表 2 结果表明 ,第 7 组环丙基脂
肪酸和奇数脂肪酸的含量 (22193 %和 39123 %) 比
8、9 两组 (13140 %～14115 %和 28133 %～28167 %)
高 ,3、6 组也比另 4 组低. 据报道 ,不同细菌 ( V ibrio
sp . , Rhodotherm us m ari nus) 在复合培养基中培养
所产生的奇数脂肪酸含量远比在寡营养培养基中的
高[6 ,13 ] . 本实验也得到相似结果. 但是在 20 ℃和 25
℃下 ,以葡萄糖为外加碳源的培养基中 ,细菌奇数脂
肪酸含量无明显减少 ,表明除了碳源会影响奇数脂
肪酸相对含量外 ,温度对其也有影响. 环丙基脂肪酸
(CFA)在大肠杆菌 ( E. coli) 中有较高含量 ,细胞膜
中 CFA 含量与 E. coli 的酸适应有密切关系[1 ] ,而
CFA 在较高温度[10 ]和高氧压[22 ]下含量都较高. 本
实验发现 ,CFA 在 MA 培养基中的含量比另两类培
养基的高 ,尤其在 30 ℃更为明显 ,表明碳源也影响
细胞膜中 CFA 的含量.
4 　结 　　语
　　研究了不同培养条件 (温度、碳源) 下一株海洋
假单胞菌的生长及脂肪酸变化情况 ,利用聚类分析
手段分析两个环境因子对其所含脂肪酸影响的差
异. 结果表明 ,此海洋菌生长最适温度为 30 ℃,在以
淀粉作为外加碳源的培养基中生长最好. 该菌含 13
种脂肪酸 ,主要是 c16 :1 (n27) 、c15 :0、c16 :0、c17 :0、
c18 :1 (n26) 、c18 :1 (n29) 、9 ,102cp2c17 :0 和其同分异
构体. 温度比碳源的影响更明显. 在 25 ℃和 30 ℃之
间存在着一个温度阈值 ,对不饱和脂肪酸的影响最
大. 此外 ,30 ℃下 ,葡萄糖和淀粉两种碳源会降低细
菌中奇数脂肪酸和支链脂肪酸含量 ,但在 20 ℃和
9695 期 　　　　　　　　　　　　　　叶芳挺等 :培养条件对海洋假单胞菌脂肪酸的影响 　　　　　　　　　　　
25 ℃下 ,只有淀粉使这两种脂肪酸含量明显减少.
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作者简介 　叶芳挺 ,女 ,1980 年 6 月生 ,硕士生. 主要从事微
生物活性物质研究. Tel :0574287600458 ; E2mail :yftningbo @
hotmail. com
079 应 　用 　生 　态 　学 　报 　　　　　　　　　　　　　　　　　　16 卷