全 文 ：应 用 生 态 学 报 年 月 第 卷 第 期
〕 , , 一
黄瓜苗根围拮抗细菌 的分子鉴定 ‘
沈爱华 张炳欣“ 李 斌 沈立荣 喻景权
浙江大学植物保护系 , 杭州
【摘要 】 采用生理生化 、 和 分子鉴定 种不同方法 , 对抑制黄瓜苗期碎倒病病原真菌的
细菌菌株 进行了鉴定 生理生化鉴定显示该菌株为 厂恢斑友么, 朋 亡‘ , 、 而 鉴定显示 其为
尸 进一步对该菌株作 基因的测定与分析 , 表明其与已报道的 尸 艺褚”飞之 之,
具 有 的同源性 , 二者在所建系统发育树中处于 同一分枝 , 据此确定该菌株为 尸 ‘“刀刘 之 汉
关键词 黄瓜 碎倒病 生防细菌 鉴定
文章编号 一 一 一 中图分类号 文献标识码
之 ,
, , , 刀 心故 ,烤 , 场 ,明刁 口“
,
以 , , 一以
·
皿刀 , , 一
邓 , , 邓
一
长组农农,瓶。故 进, ’ 之, ,撇
,
,
·
俩 , , 、
,
卜 产别 , 俐
,
眼 , 一
口硬卯 之 口又之
, , , , 一
引 言
黄瓜苗期碎倒病是黄瓜苗期的重要病害之一 ,
主要是 由腐霉菌 了加艺人 侵染引起的 该病菌
适应性强 、 为害重 , 给蔬菜生产造成 了很大损失 , 一
般苗圃发病率为 一 , 严重 的可 达 以
上【‘“ 〕化学防治该病是 目前主要 防治手段 , 生产上
主要采用 甲霜灵 拌种和 土壤处理 , 但 由
于化学农药对环境和农产品的污 染 日益严重 , 加之
病菌易对 甲霜灵产生抗药性 , 并 已有 甲霜灵防治失
败报道〔” 利用生物防治其拮抗细菌主要是从黄瓜
苗根围分离筛选 , 作为一种无公害生防手段倍受关
注仁’“ 〕而对筛选到的有益细菌如何准确鉴定是开展
这方面研究的基础 长期以来 , 对细菌进行分类鉴定
主要依靠培养和生化等表型特征
, 花费时间长 , 准确
性不够 , 而通过对细菌的 全序列测定 , 进
行同源性分析 , 构建系统发育树 , 具有准确 、 快速 、 灵
敏的优点 , 目前正成为菌种鉴定的有效手段 本文 比
较了生理生化 、 和 种方法鉴定生
防细菌菌株 的实验结果
材料与方法
供试材料
菌株 生防细菌 , 由浙江大学植物保护系实验室
提供 , 分离于菜园土壤
试剂 孔 板购 自美国 公司 克隆质粒
一 、 聚合酶 、 、 连接酶 、 限
制性内切酶
、
产物纯化试剂盒购 自上海博亚生物技术
有限公司
一 购 自 公司 琼脂糖购 自 公
司 其他试剂均为进 口或国产分析纯
引 物 合 成 参 照 文 献 , ‘ , 设 计 引物 几
一 ’ , 引物 气
一 ’ , 由上海博亚生物技术有限公
司合成
研究方法
菌株的生理生化特性 参照方中达等【 方法 , 观察和
测定生防细菌 的形状 、 大小 、 鞭毛 、 革兰氏染色 、 糖的代
谢等各项生理生化指标
法鉴定 参照谢关林〔‘ 方法 , 在含 个碳源
的 , ,
,
队 阴性 微孔板中 , 每孔加人 拜 待测细菌
悬浮液 值 一 在 ℃下培养 后 , 观察板
中 孔的颜色变化 , 用 型酶标测读仪 自动记录
结 果 , 将 结 果 输 人 配 套 计 算 机 软 件
, 版
户
, 国家自然科学基金资助项 目 ,
, 通讯联系人
一 一 收稿 , 一 一 接受
应 用 生 态 学 报 卷
表 生防细菌 的生理生化特性
妙 ‘
生理生化特性
形状
大小 拼
革兰氏染色
鞭毛 一
荧光
菌株 菌株 面
山叮袱 , ”侧的 。叮狱罗
杆状
, 极生
杆状 司
一 一
一 , 极生
十
可溶性色素 莎
芽抱
℃生长 ℃
℃生长 ℃
暗绿 蓝绿
生理生化特性
硝酸盐还原
明胶液化 一
精氨酸双水解酶
淀粉水解 己
聚一月
一
经基丁酸盐水解
件
葡萄糖利用
海藻糖利用
脯氨酸
间肌醇
十
反应呈阳性 一 反应呈阴性
菌体培养和基因组 的提取 菌株采用 液体
培养基在 ℃振荡培养至对数生长期 , 以 印
· 一 ‘
离心 , 收集菌体 细菌基因组 的提取参照李德葆等 的
方法
的 扩增及克隆 反应体系为
拜 拌 , 拌 ,
拌 , 拌 产 , ” 川 ,
叮 聚合酶
·
闪一 ‘ 拌 , 拜 , 基 因组
闪 参照 和 等 “
, ‘ , 稍加修改 , 以
反应程序为 ℃预变性 然后 ℃变性 , ℃退
火 , ℃延伸 , 经过 个循环 , 最后 ℃延伸
, 产物 快速回收试剂盒纯化 , 与 一 载体
连接 , 转化感受态细胞 , 然后在含有 一
的 平板上进行蓝白斑筛选 , 挑取白色菌落作 液体培
养 , 碱法小量抽提质粒 , 分别进行 反应和 几忿 工限制性
内切酶双酶切鉴定 , 筛选出重组质粒
的全序列测定和分析 重组质粒由上海博
亚生物技术有限公司测序 , 将测得的 全序列输人
心 , 应用 软件进
行同源性搜索 , 并用 软件 , 将该序列与已报道的假
单抱菌菌株的 全序列进行同源性比较 , 并建立系
统发育树
生防细菌 的 全序列的 扩
增与阳性克隆
以 基因组 为模板 , 经 反应扩增 ,
琼脂糖凝胶电泳检测 , 得到一大小约为
特异性片段 , 与已报道 的 在所有的细菌
中都高度保守且长度恒定 约 的报道 相吻
合 产物经纯化 、 克隆 、 转化 , 筛选得到重组质
粒 以重组质粒为模板作 反应鉴定 , 得到一大
小为 的特异性片段 , 与从基因组 扩增
出的 产物大小一致 利用分别位于重组质粒中
插人片段前后的两个 工位点 , 用 几艺工限制性内
切酶作双酶切鉴定 , 电泳检测结果可见大小 为
的片段 图
生防细菌 的 全序列
测定克隆质粒的 基因全序列 , 全长
为 , 用软件录人 , 转化为 信息库形
式 图
均
结果与分析
生防细菌 的生理生化特性
表 为 细菌的生理生化特性测定结果 , 与伯
杰氏细菌鉴定手册 第 版 对照 , 该菌符合细菌 尸
几呀 特性
细菌鉴定
后 , 板各孔颜色变化已相当明显 , 参
照酶标测读仪的机读结果 , 孔原始数据为 一
值 , 每孔的阴性 、 阳性结果 即可 自动生成 , 输人
。 配套计算机软件 , 结果 与 尸 俩 最相
近 , 相似系数为 , 大于
图 细菌 的 产物及重组质粒 乃忿 酶产物电泳图
日民切甲 万巴 代卫 朋叩 让幻 加 耐 纯脚吨 场
泳道 扩展片段 勺
酶酶切片段 氏
期 沈爱华等 黄瓜苗根围拮抗细菌 的鉴定
泥 八
二 犯
〔石 沁了、
,
石 八 二 丫、
、
汰 ,
〕 八 三 石
〔泥 二 入入
,
〕, 荆 , 一 一
,
玉 〔 八 丁 沪 下
八 八
, ,
〔 二 〔
一
飞
‘气入 〔
户
门户
丁 儿气
〕 〔 〔 丁
门
叫
口二 石
, 只二
, 〔荆二 裕
, 八 八
八 二 〔
儿气 孟气入 丁
,
乙 〔 二 汪裕
,
,
子 蓝、 《只 〕 八 〔
〕
,
汇
、
图 生防菌株 的 全序列
生防细菌 的 全序列相似性 比较
与系统发育树
将 的 全序列递交 , 应用
作同源性搜索后 , 运用软件 , 将所测
定的全序列与 心 中收录的假单抱菌菌株
基因全序列 比较 , 结果 与 尸
基因序列的同源性最高 , 为 , 细菌分类学家
普遍认为当 全序列 同源性低于 时 ,
可以认为是属内不同的种 , 低于 一 则可能
,
啥 摊
, “佗 八
儿
、
冰
图 全序列系统发育树
一
为属外成员 在建立 的系统发育树 中 , 与 尸
乡 处于同一分支 图
讨 论
本研究对 种细菌分类鉴定方法进行 了比较
其特点各异 , 尤其生理生化特性 的测定要求测试项
目甚多 , 花费时间较长 , 工作量较大 , 不宜做大量细
菌的分类鉴定 , 而且对有些细菌不能给出理想的鉴
定结果 法 以纯培养细菌物“ 代谢指纹 ” 图谱
为基 础 , 与计算机 的 数值分类 和 聚类分 析 相 结
合川 , 大大减少 了工作量 , 但受外界人为操作的影
响较大 , 准确性不够 分子鉴定法则具有
准确 、快速的优越性 , 由于国际基因数据库通过因特
网络实现了资源共享 , 该方法正得到愈来愈多学者
的认可
·
川 本研究中 分子鉴定法与生
理生化法鉴定结果均显示相同结论 , 因此可以确定
生防细菌 属铜绿假单抱菌 尸 之 对
法结果所显示 的不同结果 , 笔者认为可能与该
方法所存在的准确性不够的缺陷有关
铜绿假单抱菌 尸 二 对引起黄瓜苗期
应 用 生 态 学 报 卷
碎倒病的致病腐霉 尸皿人 具有非常明显拮
抗抑制作用 , 如 等 ‘ 曾报道 , 从 尸 。‘阳召
一 的分泌物可分离纯化的一种抗真菌复合
物 它对 由 、八 傲训夕刀
‘ ·
引起 的苗期病害有一定的抑制作用 但
由于该菌能侵染人体 , 引起伤口 、 烧伤和尿道感染 ,
因此 目前尚不能直接应用于生物防治 , 对其拮抗机
制将作进一步的研究探索 , 为选育和构建安全有效
的植物病害工程生防菌株提供科学依据
参考文献
一 陈晓斌 ,
一
张炳欣 ,
一
楼兵千 , 以
一
。 眼
·
人坛 , 砧动叔卿 微生
物学通报 , 一
一
方中达
笔 心
, , , 一
一
, 几五‘尹说而么卯产,
一
,
即 ,
以
乙罗 , 故 ‘已 几甄 , 刀占动 , 一
一
傅君芬 ,
一
洪文澜 一
一 凡争爸心刀
人‘农‘ 匀咬左阴 国外医 学流行病学传染学分册
,
一
, , ,
一 趁 一
即 几工证双必之 几壳 人尤劝
, 一
, , ,
目 一
日
·
乃八阿 几五 坛址,
一
李德葆 ,
一
周雪平 ,
一
许建平 ,
】 ·
楼兵干 , 压 张炳欣 ,
一
胡利强
·
乃记 勿
·
八‘匆 月心叭纳 植物保护学报 , 一
一
楼兵千 , 耳 张炳欣
一 以‘ 丹 , 浏砚 植物保护
学报 , , 一
,
几砚已五”飞 犯加‘“ 义沈忿 奴去绷 几肠阮 , 一
, 司
凡沈夕几五 , 动应记, 一
, ,
卯 淤之“勿 刃
召进, 目赵 之 撇
一 卯
芍 ”把 几五‘找沽 了袄六刀。 , 一
, 记 , ,
凡五 沉 , 几介动。试, ,
一
‘
沦之以 秘
,
,
,
一 一
叨 , , , 以
叫 叹声 心
人了应群泊应记, 一
作者简介 沈爱华 , 男 , 年生 , 硕士研究生 主要从事蔬
菜苗 期 病 害 生 物 防 治研 究 , 发 表 论 文 篇
, 一