全 文 ：土壤氧化还原酶催化动力学研究进展*
张丽莉1, 2 陈利军1* * 张玉兰1, 2 武志杰1
( 1 中国科学院沈阳应用生态研究所,沈阳 110016; 2 中国科学院研究生院,北京 100039)
=摘要> 土壤氧化还原酶是存在于土壤中的一种重要酶类,参与土壤中为数众多的重要生物化学反应 ,与
土壤中有机物质的转化、腐殖质的形成以及土壤肥力变化密切相关. 其催化反应的动力学研究常用来阐明
其催化过程的特性、酶的本质属性及其对环境变化的响应等. 研究土壤氧化还原酶动力学特征对探讨其来
源、性质及影响因素,对进一步调控多种营养元素参与的反应过程有重要意义.文中概述了土壤氧化还原
酶动力学研究的理论基础, 综述了土壤氧化还原酶催化动力学研究的进展和影响因素, 并对今后的研究提
出了几点建议.
关键词 土壤氧化还原酶 动力学 特征
文章编号 1001- 9332(2005) 02- 0371- 04 中图分类号 S1541 2 文献标识码 A
Research advances in catalytic kinetics of soil oxidoreductase. ZHANG Lili1, 2 , CHEN Lijun1 , ZHANG Yulan1, 2 ,
WU Zhijie1 ( 1 I nstitute of Applied Ecology, Chinese Academy of Sciences, Shenyang 110016, China ; 2 Graduate
School of Chinese Academy of Sciences, Beij ing 100039, China ) . 2Chin . J . Appl . Ecol . , 2005, 16( 2) : 371~
374.
Soil oxidoreductase is a group of enzymes catalyzing many important soil biochemical r eactions and concerning
with the transformation of soil organic matter, formation of humic substance, and dynamics of soil fertilit y. The
catalytic kinetics of oxidoreductase can illuminate its catalytic character istics, substantial propert ies, and response
to environmental changes. T his paper summarized the research advance of its kinetics, and proposed some com2
ments in understanding its action mechanism and in regulating its catalyt ic processes.
Key words Soil oxidoreductase, Kinetics, Properties.
* 中国科学院沈阳应用生态研究所知识创新领域前沿资助项目
( SLYQY0401) .
* * 通讯联系人.
2004- 03- 26收稿, 2004- 06- 16接受.
1 引 言
氧化还原酶是一类能够催化土壤中氧化还原反应的酶
类[ 11] .土壤中的氧化还原酶在腐殖质的形成过程中起到非
常重要的作用[ 25] , 例如多酚氧化酶可将土壤中的有机和无
机物质转化的中间产物 ) 酚类物质氧化为醌,而后形成类腐
殖质的大分子化合物;氧化还原酶对营养物质的转化以及矿
质营养元素的循环有重要意义, 例如:反硝化作用在很大程
度上是由胞内还原酶参与进行的[ 7, 16] ;有些氧化还原酶可以
作为土壤肥力以及土壤微生物代谢活性的指标等[ 9, 23] . 早期
对土壤氧化还原酶的研究主要是对其活性的研究[ 4, 8] , 随着
科学的发展 ,人们由片面强调土壤中反应结果的研究, 转向
既偏重结果、又重视产生该结果的过程[ 24] . 酶动力学研究对
了解酶催化反应的具体进程、对探讨酶的来源及其在土壤中
的存在状态都具有重要作用[ 28, 32, 34] , 土壤酶催化动力学常
数 Km和 Vmax的变化与土壤肥力水平、土壤营养元素供应能
力有密切关系[ 20] . 戴伟和白红英[ 11]指出陕西土娄土过氧化氢
酶 Vmax值与土壤全氮量极显著相关, 而 Vmax/ Km 与有机质
含量显著相关;另有研究指出, 红黄壤过氧化氢酶 Km 值与
土壤 pH 值呈正相关关系[ 12] .土壤中几乎所有的生物化学反
应都是在土壤酶的作用下进行的,用动力学方法对酶促催化
反应进行研究可在系统理解土壤反应速度、酶2底物亲和力
及其影响因素的基础上,提供调节反应的可能性[ 41] . 本文拟
通过综述土壤氧化还原酶催化动力学研究进展, 深入认识土
壤氧化还原酶的作用机理, 为土壤酶催化作用合理调节提供
理论依据.
2 土壤氧化还原酶的动力学研究
21 1 方法论基础:经典稳态动力学
Skujins[ 30]指出 Velasco 最早对黑土过氧化氢酶的动力
学特性进行研究, 用 Lineweaver2Burk 作图法求出了两个动
力学常数 Km和 Vmax,证明以米氏方程为基础的经典稳态动
力学方法可用于土壤系统中氧化还原酶催化动力学研究, 20
世纪 60 年代 Galstyan 对土壤过氧化氢酶和脱氢酶进行了动
力学常数测定, 同样证明经典稳态动力学理论可以用来进行
土壤中酶动力学特性研究. 到目前为止, 许多学者[ 1, 10, 25, 28]
对不同土壤中来源不同的漆酶、氢化酶、多酚氧化酶、硝酸还
原酶等的催化反应开展动力学特性的研究, 并分别用不同的
米氏方程的转化形式求出了动力学常数值. McLaren 等[ 23]
对土壤酶动力学理论的综述指出, 虽然土壤酶以非均质状态
存在,但是其动力学特性遵循经典稳态动力学理论. 我国学
者周礼恺[ 35]综述相关文章指出, 米氏方程可用于供试土壤
应 用 生 态 学 报 2005 年 2 月 第 16 卷 第 2 期
CHINESE JOURNAL OF APPLIED ECOLOGY, Feb. 2005, 16( 2)B371~ 374
氧化还原酶的催化反应动力学研究.
212 土壤吸附氧化还原酶动力学
土壤中的氧化还原酶多以酶2粘粒复合体或酶2有机质
复合体形式存在于土壤中[ 4, 14, 17 , 26~ 28] . 因此上世纪 70 年代
以后,土壤吸附酶的动力学研究是土壤酶动力学研究中的主
流.吸附通常使酶活性部位构型发生变化, 活性受到某种程
度的降低[ 5, 6, 29] .众多研究表明, 与土壤有机或无机颗粒结
合在一起的酶的 Km 值大于自由酶, 而 Vmax值则小于自由
酶.多数研究认为粘粒、腐殖物质和土壤对氧化还原酶的吸
附使酶的稳定性、抗变性和抗水解性等增强[ 5, 14, 17, 28] . 但
Ruggiero[ 28]得到相反的实验结果, 认为腐殖酸与酪氨酸酶的
复合体抗蛋白酶水解的能力较自由酶差.
土壤矿物对酶的吸附, 通常是一种不可逆的强吸附, 很
难从土壤中提取纯活性酶[ 28] . 这种吸附不仅影响吸附酶的
移动, 也影响酶的动力学特征. 土壤酶主要以物理或化学的
结合形式吸附在土壤有机和无机颗粒上, 或与腐殖质络合.
虽然酶附着在颗粒表面影响了酶与底物的亲和,但众多研究
表明, 土壤中吸附的酶的动力学同样遵循米氏动力学理
论[ 28] .粘粒和粉砂对于氧化还原酶的吸附能力,取决于其矿
物学组成, 漆酶和过氧化物酶与不同类型的粘土矿物吸附
后, Vmax值减小,但二者 Vmax降低的幅度不同, 降低幅度由高
至低为高岭石2酶复合体> 土壤2酶复合体> 蒙托石2酶复合
体,不论与何种矿物结合, 酶的 Km 值均略有升高.土壤中的
阿马多里酶是一种微生物来源的酶,在土壤中它嵌入菌株细
胞质膜中,位阻现象使其难与底物结合, 其 Km值大于从微
生物体内提纯的自由酶, 而 Vmax则小于自由酶[ 2] . 固定化漆
酶对 4种底物的 Km值有所不同,但是均高于提纯漆酶[ 28] .
另外,腐殖质2酪氨酸酶复合体以及土壤中存在的腐殖质2硝
酸还原酶复合体的 Km 值均高于相应纯酶制剂[ 1] .
213 不同来源土壤氧化还原酶的动力学
根据酶动力学参数可以推断酶的来源.米氏常数是酶的
特征常数, 土壤中不同来源的同一种酶有不同的米氏常数.
Ruggiero等[ 28]比较氧化还原酶与相应纯酶制剂的 Km 值,
发现土壤漆酶与植物来源的漆酶 Km 值相差较大,而只略高
于微生物体内提纯的漆酶. Amit等[ 2]发现阿马多里酶与植
物材料源酶相差较大, 而与微生物源酶相近. 通过修正土壤
对底物的吸附量获得的土壤阿马多里酶的 Km值与微生物
相应酶的 Km值更为接近,证明了酶与微生物体内酶的同质
性. Conrad等[ 10]测定黑钙土和风成沙的氢化酶的动力学常
数,发现两种土壤氢化酶的 Km 值相差较大, 并且随土壤湿
度条件的变化其动力学常数的变化亦不相同,当黑钙土的湿
度条件大于最适土壤湿度时, 其氢化酶亲合力下降;当风成
沙的湿度条件大于最适土壤湿度时,其氢化酶的最大反应速
度下降,二者动力学特性的不同说明两种土壤中存在两种类
型的氢化酶,这可能是由于酶的来源不同造成的.另外, 对风
成沙氢化酶的动力学测定表明,在此类土壤上也存在两种类
型的氢化酶 ,一种在有氧条件下具有较高活性,对氢气具有
高亲合力, 另一种在厌氧条件下具有较高活性,对氢气的亲
合力较低, 也可能是由于酶的来源不同造成的[ 10] .
21 4 土壤氧化还原酶最适底物确定的动力学
通常土壤氧化还原酶都具有催化专一性, 有的酶能催化
结构相近的几种不同底物, Km 值是酶的特征常数, 表征此
种酶与底物间的结合能力, 如果同一个酶能作用于几种底物
时, Km值往往可以给出酶对各种底物亲合力的有价值的比
较[ 19] ,并通过动力学研究获得酶的最适底物. Ruggiero等[ 27]
从土壤中提取出一种能够氧化酚类物质的酶, 它可以催化多
种酚类物质的反应, 将此种酶与醌醇、p2苯二胺、邻苯二酚和
42甲烷基邻苯二酚四种底物反应得到米氏常数和最大反应
速度, p2苯二胺的米氏常数明显小于其它三种底物而最大反
应速度则大于三种底物, 那么 p2苯二胺就是此种酶的最适底
物. Ruggiero 等[ 2 7]对腐殖酸吸附酪氨酸酶和自由态酪氨酸
酶与几种底物亲合力的研究指出, 二者对底物的亲合能力都
是邻苯二酚最高, 与血凝酸、42甲烷基邻苯二酚、( - )表儿茶
精、儿茶酚等亲合力较低,即邻苯二酚是这种酶的最适底物.
21 5 污染土壤的氧化还原酶修复的动力学
近年来, 污染土壤修复得到越来越多学者的关注, 污染
土壤的酶学修复更是一个新兴的课题,氧化还原酶如漆酶、
过氧化物酶等对土壤中苯酚类等污染物的去除具有重要作
用[ 17, 33] .在污染土壤酶学修复研究中, 最重要的技术就是获
得具有活性的、稳定性高并可重复使用的酶修复剂, 固定化
酶通常具有上述优点[ 18] . 固定化酶的动力学特性研究是了
解固定化酶反应特点的重要手段, 但目前对固定化酶的动力
学研究很少.漆酶和过氧化物酶与蒙托石、高岭石固定后保
持了较高的催化活性, 并可抗水解、高温等不利环境因素的
影响, 漆酶和过氧化物酶与蒙托石、高岭石固定后,漆酶 Km
值基本不变, 即酶与底物的亲合力基本不变, 蒙托石2漆酶复
合体 Vmax上升,高岭石2漆酶复合体 Vmax下降;过氧化物酶固
定在各种基质上均表现为 Km值增大, Vmax值减小[ 17] .
21 6 土壤氧化还原酶抑制作用动力学
通过动力学研究可系统了解酶抑制作用机理 .腐殖质等
对氧化还原酶存在不同类型的抑制作用. 腐殖物质对植物和
动物来源的过氧化物酶产生竞争性抑制[ 29] , 不同浓度的胡
敏酸和富里酸对漆酶、酪氨酸酶的抑制作用属于竞争性抑
制;腐殖酸对酪氨酸酶的抑制使酪氨酸酶对底物邻苯二酚的
Km值升高, 产生竞争性抑制[ 27] ,腐殖物质对过氧化物酶的
抑制程度取决于电子供体的类型, 愈创木酚作电子供体时其
抑制程度低于邻联(二)茴香胺作电子供体. 提高黑钙土和风
成沙两种土壤的湿度以及用过量氢气对土壤进行培养时, 氢
化酶的活性受到抑制. 提高土壤湿度, 黑钙土中氢化酶的
Km值上升,属于竞争性抑制;而风成沙氢化酶 Vmax下降, 属
于非竞争性抑制;用过量氢气预培养土壤时, 对黑钙土氢化
酶产生非竞争性抑制, 对风成沙氢化酶产生竞争性抑制[ 10] .
此外, 重金属形态不同, 对自由酶及固定化酶的抑制作
用也不同, FU 和 T abatabai[ 15]、杨志新等[ 32]等都开展了有
关土壤酶与重金属之间的关系研究, 研究表明, 各种酶受重
金属抑制与否及抑制程度因酶种类而异. 但关于重金属形态
372 应 用 生 态 学 报 16卷
对土壤酶抑制作用的动力学研究多未涉及,有待深入.
217 土壤肥力评价的氧化还原酶动力学
土壤酶学的研究, 从一开始就与土壤肥力研究紧密联
系.土壤氧化还原酶活性、催化动力学特性是土壤质量表征
的重要量度,也是土壤营养供应能力的重要指标[ 3, 22] , 酶动
力学特性变化对评价土壤施肥后的代谢响应具有重要意义.
Masciandaro等[ 22]研究表明土壤在分施有机肥、有机2无机复
混肥、矿物肥料一年后, 脱氢酶动力学常数有不同的变化, 施
用有机物料和有机2无机复混肥脱氢酶的 Vmax值增大, 而施
矿质肥料的土壤脱氢酶 Vmax值无显著变化 ;施用有机肥料的
土壤脱氢酶 Km 值不变, 而施用有机2无机复混肥和无机肥
料的土壤 Km值显著上升,说明脱氢酶动力学常数可以作为
恒量土壤中微生物活性变化的有效指标.
218 影响土壤氧化还原酶动力学特性的因素
氧化还原酶在土壤这个异质体系里主要以结合状态存
在: 1)土壤氧化还原酶以物理或化学结合形式吸附在土壤有
机和无机颗粒上,或与腐殖质络合; 2)土壤溶液中的氧化还
原酶比吸附在土壤固相上的少得多; 3)土壤氧化还原酶在土
壤动、植物细胞和细胞碎片里也是吸附态, 或者存在于悬液
里[ 23, 35] .因此, 土壤氧化还原酶动力学研究比均质体系中酶
催化反应动力学研究复杂得多,因为土壤氧化还原酶的局部
浓度不同、底物在土壤固相和液相中分配不同、土壤组分对
土壤氧化还原酶的抑制或激活、酶分子在结合过程中发生构
象变化、土壤氧化还原酶的来源不同、土壤氧化还原酶的作
用条件不同以及土壤的发生学特征,土壤的湿度条件等等都
会影响土壤氧化还原酶的催化反应进程[ 10] .
周礼恺[ 35]引述相关文章指出, 在不同土壤 pH 值、腐殖
质含量、机械组成、养分状况等条件下,酶和底物的吸附程度
不同导致不同土壤酶类的 Km 值虽处在同一数量级, 但有一
定差别.
21811 土壤水分状况 酶催化反应总是在含介质的水溶液
里进行的. 土壤酶并不总是处于最适的水分环境里, 因为土
壤水分状况会经常发生变化,水分含量变化影响微生物和高
等植物根系的生命活动, 对它们来说, 最适水分含量是最大
持水量的 60% ~ 80% , 这一水分含量也大致是土壤酶活性
的最适值[ 35] .有研究表明,黑钙土和风成沙的水分含量超过
最适水分含量时,两种土壤的氢化酶催化性能减弱, 但二者
的动力学特性却有不同的变化:风成沙氢化酶因土壤湿度的
提高 Vmax减小, Km 值不变;黑钙土氢化酶则 Vmax不变, Km
增大[ 10] .两种土壤的氢化酶都因土壤湿度增加而催化能力
减弱, 但从动力学的角度可知, 湿度变化对两种土壤氢化酶
的具体进程影响不同. 本文作者1)对黑土、白浆土、棕壤、褐
土过氧化氢酶、脱氢酶、多酚氧化酶在不同湿度条件下催化
特性的研究发现,在一定的土壤湿度范围内, 土壤湿度增大,
3 种氧化还原酶的催化动力学特性对湿度变化响应不如对
温度变化响应敏感,其催化活性在不同土壤中亦表现出不同
的变化趋势[ 34] .
21812 土壤温度 温度是影响酶催化反应的一个重要因素.
酶催化反应所需条件温和, 一般在室温常压下就能进行, 尽
管酶的温度适应范围较宽, 但有其特定的最适温度. 过高和
过低的土壤温度都会导致土壤氧化还原酶活性的钝化和失
活.周礼恺[ 35]引述相关资料表明, 温度变化对氧化还原酶活
性有重要作用, 在一定温度范围内, 土壤温度升高对酶2底物
复合体的形成( Km值)及其分解( Vmax值)都有正的影响. 这
是因为,它一方面活化了参与反应的酶, 另一方面使酶产生
适宜的变形, 从而改变了酶的动力学性质- 既增强了酶对底
物的亲合力,又加速了酶2底物复合体的分解和反应产物的
解离. 油松林土壤及落叶松林的 0~ 20 cm土层土壤在 50 e
时的 Vmax/ Km 比 40 e 时有较明显的增加[ 13] , 说明脱氢酶
的催化能力增强. 与游离态酶相比, 固定化酶在较大温度范
围内( 60~ 80 e )能保持最高反应速度. 本文作者1)对黑土、
白浆土、棕壤和褐土过氧化氢酶、脱氢酶、多酚氧化酶在不同
温度条件下的催化动力学特性研究发现, 在一定温度范围内
三种氧化还原酶的催化活性随温度上升而增强[ 34] . 关于温
度对土壤氧化还原酶动力学特征的影响, 国内外涉及较少,
尚需系统深入研究.
21 81 3 土壤的气体组成 土壤的气体状况,对土壤微生物活
动有着重要影响, 土壤空气的主要组成是 CO2、O2、和 N2 . 其
中, O2和 CO2 的数量变化最大. 它们在土壤空气中的比例,
在很大程度上决定土壤酶活性.当土壤中氧气含量提高时,
过氧化氢酶催化能力提高, 而脱氢酶则正好相反[ 35] ,因为过
氧化氢酶在进行催化反应时要以氧作为供体, 而脱氢酶的催
化过程则是厌氧过程. 另外, Conrad 等[ 10]指出黑钙土和风成
沙在外界环境为厌氧条件时, 与有氧条件相比, 氢化酶的
Km值上升, Vmax值下降,当使用高浓度的底物(氢气)预培养
一天后, 黑钙土氢化酶的 Vmax下降, Km值不变;而风成沙的
Km值上升, Vmax值不变.
1) 张丽莉. 2004.东北主要土壤氧化还原酶催化动力学特性(硕士学
位论文) .沈阳:中国科学院沈阳应用生态研究所.
21 81 4 土壤质地 酶活性及动力学特性因土壤质地的不同
而有所不同, 同一土类的粘质土壤比轻质土具有较高的最大
反应速度,这是因为,在土壤固相里酶主要分布在含有大量
腐殖物质和微生物的较小粒级上, 而较小粒级具有较大的吸
附酶的能力. 在淋溶黑钙土中,随着粘粒含量的增多,土壤过
氧化氢酶及脱氢酶最大反应速度均有所增强[ 35] . 另外,土壤
结构在很大程度上决定了土壤酶的催化特性, 脱氢酶最大反
应速度随粒径的增大而增强[ 22] .
21 81 5 土壤 pH 土壤酸碱度对酶动力学特性的影响已被研
究者们所认识, 因为土壤酶本身是一种蛋白质, 反应体系中
的氢离子浓度影响酶蛋白解离基团的解离, 或影响底物的解
离状态. 土壤酸碱度对氧化还原酶动力学特性的影响比较复
杂,因为 pH 的变化可以影响酶的空间构象, 影响酶活性部
位催化基团的功能特性,也可以影响底物的解离,这些都可
以影响酶对底物的亲和力, 改变酶的动力学性质[ 21] .有学者
对一些种类的氧化还原酶进行了最适底物浓度研究,证明土
壤酶促反应受底物浓度影响[ 31] , 但对于最适底物浓度的确
3732 期 张丽莉等:土壤氧化还原酶催化动力学研究进展
定则必须考虑土壤 pH 值变化的影响. 关于土壤 pH 值对氧
化还原酶动力学特性的影响研究国内外所见较少,需进一步
扩展和深入探索.
3 结 语
目前, 国内外土壤氧化还原酶动力学研究比较少, 尤其
国内仅见零星报道[ 11~ 13] , 在已有的土壤氧化还原酶动力学
研究基础上 ,以下方面有待加强: 1)本源土壤氧化还原酶动
力学研究; 2)不同土地利用方式(耕地、草地、森林等)土壤氧
化还原酶动力学研究; 3)环境因素(温度、水份等)对不同土
壤氧化还原酶动力学特性的影响; 4)土壤酶催化特性调节,
如土壤氧化还原酶的抑制或激活作用动力学研究; 5)氧化还
原酶对污染土壤的生物修复在应用上前景广阔,理论上的动
力学研究可对其作用机理有更深入的认识,该项研究是未来
土壤酶动力学研究的方向之一.
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( in Chinese)
作者简介 张丽莉, 女, 1977年 6月生, 硕士,主要从事土壤
酶学研究. E2mail: zhanglilisy@yahoo. com. cn
374 应 用 生 态 学 报 16卷