全 文 ：丛枝菌根真菌与根瘤菌互作及类黄酮
对互作效果的影响 3
董昌金1 ,2 　赵　斌1 3 3
(1 华中农业大学农业微生物国家重点实验室 ,武汉 430070 ;2 湖北师范学院生物系 ,黄石 435002)
【摘要】　研究了中华根瘤菌与 AM 真菌互作或加入适量的类黄酮 (150 nmol·L - 1和 115μmol·L - 1)对紫云
英的生物量、结瘤数、AM 真菌的侵染率、菌丝 AL P 和 SDH 酶活性的影响. 结果表明 ,与对照组 [ 0、AMF、
Rh ]相比 ,Rh + AMF 组紫云英的生物量、结瘤数、AM 真菌侵染率和菌丝酶活都有显著差异 ;与对照组及
Rh + AMF 组相比 ,类黄酮处理组紫云英的生物量、结瘤数、AM 真菌侵染率和菌丝酶活差异更加显著 ,但
不同类黄酮间 (apigenin 和 hesperitin) ,或同一种类黄酮不同浓度处理间 (150 nmol·L - 1和 115μmol·L - 1)
差异不明显 ,说明 AM 真菌与根瘤菌互作对紫云英的结瘤固氮、AM 真菌的侵染和菌丝的生长都有促进作
用. 当 Rh + AMF 组加入适量的类黄酮时 ,这种促进作用更加显著.
关键词 　生物量 　结瘤数 　侵染率 　AL P 　SDH
文章编号 　1001 - 9332 (2004) 09 - 1585 - 04 　中图分类号 　Q93811 　文献标识码 　A
Interaction between AM fungi and Rhizobium and effects of flavonoids on it. DON G Changjin1 ,2 ,ZHAO Bin1
(1 S tate Key L aboratory of A gricultural Microbiology , Huaz hong A gricultural U niversity , W uhan 430070 ,
China ; 2 Depart ment of Biology , Hubei Norm al U niversity , Huangshi 435002 , China) . 2Chin. J . A ppl .
Ecol . ,2004 ,15 (9) :1585～1588.
Study showed that the biomass and nodule number of Ast ragalus sinicus ,AM fungal infection rate ,and hyphal
enzyme activity of AL P and SDH were significant influenced by Rhizobium ,AM fungi and flavonoids. Rh +
AMF treatments had obvious differences with control in the biomass and nodule numbers of Ast ragalus sinicus ,
AM fungal infection rate and hyphal enzyme activity ;and flavonoid treatments had more obvious differences with
Rh + AMF treatments and control in these aspects ,but no obvious differences were found in different flavonoids
(apigenin and hesperitin) or in different concentrations ( 150 nmol·L - 1 and 115 μmol·L - 1 ) of the same
flavonoid. The results showed that nodule2generation and nitrogen2fixation of Rhizobium and AM fungi infection
were obvious promoted by Rhizobium and AM fungi ,and this promotion effects were more significant when an
appropriate amount of flavonoids was added in the Rh + AMF treatments.
Key words 　Biomass , Nodule number , Infection rate , AL P , SDH.3 欧盟项目 ( ICA4230014 ) 和国家自 然 科 学 基 金 资 助 项 目
(30270051) .3 3 通讯联系人. E2mail :fybzhao @public. wh. hb. cn
2003 - 11 - 24 收稿 ,2004 - 04 - 10 接受.
1 　引 　　言
根瘤菌与相应的豆科植物共生 ,结瘤固氮 ,是微
生物肥料中最稳定的接种剂 ,通过其固氮酶的作用 ,
将空气中的 N2 还原为可被作物吸收利用的 N H3 ,
对作物有明显的增产效果. 丛枝菌根 ( arbuscular
mycorrhiza ,AM)真菌分布广泛 ,存在于约 80 %的陆
生植物中[15 ,17 ] ,大多数农作物、木本植物和野生草
本植物均能与 AM 真菌共生 ,形成丛枝菌根. AM 真
菌一个重要的功能是通过其共生体中大量的根外菌
丝增加植物对土壤中营养元素 P 和水分的吸收 ,从
而提高植物的 P 营养和抗旱能力[1 ,3 ,6 ,11 ] ,对环境污
染和土传病害的抗性也常见报道[5 ,10 ,20 ] . 接种 AM
菌根真菌可增加根瘤菌的结瘤数、鲜瘤重和固氮酶
活性[22 ] . 国外也有文献报道 AM 真菌能促进植物生
长 ,刺激豆科植物结瘤和提高固氮效率[2 ,4 ,12 ] . 利用
AM 真菌与固氮微生物共接种可以减少农作物对磷
肥和氮肥的依赖 ,对农业的可持续性发展和环境保
护起促进作用[22 ] . 本研究旨在通过 AM 真菌和根瘤
菌共接种于同一菌根植物紫云英中 ,探讨 AM 真菌
与根瘤菌互作及类黄酮对其作用效果的促进作用.
2 　材料与方法
211 　供试材料
供试植株为紫云英 ( Ast ragalus sinicus ) , 根瘤菌为
R hizobium 7653 R 快生型 (均来自华中农业大学) ;AM 真菌
为 Glom us int raradices Schenck & Smith 和 Endo 21 (一个商
业化菌剂 ,由 Glom us mosseae Gerdemann & Trappe 和 G.
应 用 生 态 学 报 　2004 年 9 月 　第 15 卷 　第 9 期 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
CHIN ESE JOURNAL OF APPL IED ECOLO GY ,Sep. 2004 ,15 (9)∶1585～1588
intraradices 组成 ,法国农业科学院 Institut National de La
Recherche Agronomique2France , INRA 提供) ;类黄酮为 api2
genin 和 hesperitin (Sigma) . 类黄酮用 50 %乙醇溶解后再用蒸
馏水稀释成 150 nmol·L - 1和 115μmol·L - 1两种浓度[7 ] . 紫
云英种子用 2 % NaClO 溶液表面消毒 5 min 后 ,用蒸馏水冲
洗 ,浸泡过夜后置培养皿中于 25 ℃温箱中萌发. AM 真菌接
种剂为菌根化的植物根段、孢子和根外菌丝等土壤混合物.
212 　研究方法
21211 试验设计 　培养基质为 1∶1 (v/ v)的砂土 (采集低磷含
量约 p H 710 的耕作土壤 ,风干过筛后与 1∶1 的砂混合均匀 ,
经 126 ℃高压蒸汽灭菌 2 h) ,容器为一次性塑料杯 (外面再
套一个涂黑色油漆的一次性塑料杯) ,每杯装土壤 200 g ,在
塑料杯的下层装入灭菌土壤至 70 %的高度 ,除“0”对照和
“Rh”对照外 ,每杯平铺 10 g 的 AM 真菌接种剂 ,再覆盖一层
灭菌土. 对每一种 AM 菌根真菌 (AM fungi ,AMF) ,共设计 8
组试验 ,其中对照有 3 组 : Ⅰ. 0 (紫云英) , Ⅱ. AMF(紫云英 +
AMF) , Ⅲ. Rh (紫云英 + Rhizobium) ;处理有 5 组 : Ⅳ. AMF
+ Rh (紫云英 + AMF + Rh) , Ⅴ. AMF + Rh + A150 (紫云英 +
AMF + Rhizobium + 150 n mol·L - 1的 apigenin) , Ⅵ1AMF +
Rh + A115 (紫云英 + AMF + Rhizobium + 115μmol·L - 1的 api2
genin) , Ⅶ1AMF + Rh + H150 (紫云英 + AMF + Rhizobium +
150 nmol·L - 1的 hesperitin) , Ⅷ1AMF + Rh + H115 (紫云英 +
AMF + Rhizobium + 115μmol·L - 1的 hesperitin) . 每组 10 个
重复. Ⅰ～ Ⅱ组 :每杯接入 3 颗已发芽的紫云英种子 ; Ⅲ～ Ⅷ
组 :先将已发芽的紫云英种子放入根瘤菌 ( Rhizobium
7653R)溶液中浸泡 2 h 后 ,每杯再接入 3 颗已接种根瘤菌的
紫云英种子 ; Ⅴ～ Ⅷ组 :沿紫云英种子周围 ,每杯加入 100 ml
相应浓度的类黄酮 (apigenin 或 hesperitin) 溶液 ;其余各组每
杯加入 100 ml 的蒸馏水. 温度为 20～25 ℃,每天 12 h 的光
照培养 ,并定时浇蒸馏水.
21212 AM 真菌根段感染率测定 　紫云英播种后第 4、7 和
10 周各取 1 次样 ,每处理取 3 个重复. 紫云英清洗干净后对
其茎、根进行称重 (鲜重) ,并统计其根瘤总数. 采用 Philipps
等[14 ]的方法 ,将洗净的紫云英根段切成 1 cm 长 ,10 % KOH
溶液 121 ℃加热透明 30 min ,水洗后加入 2 %(v/ v) HCl 溶液
中和 5 min ,再用蒸馏水冲洗 ,并置于 0105 % (w/ v) Trypan
blue 染色液中于常温下染色过夜. 蒸馏水多次清洗后 ,取样
镜检 ,并计算 AM 真菌的根段感染率.
21213 AL P 和 SDH 酶活染色 　取样时在冰上操作 ,称取 015
g 1 cm 长的根样用根段透明液 (20 ml 0105 mol·L - 1 Tris/ cit2
ric acid p H 912、50 mg·ml - 1 sorbitol、15 units·ml - 1 cellulase
和 15 units·ml - 1 pectinase)室温下透明 2 h ,冰水冲洗后立即
进行组织化学染色 ,SDH 采用 Smith & Gianinazzi2Pearson 方
法[16 ] ,AL P 采用 Tisserant 等[19 ]方法进行酶活染色. SDH 染
色液为 012 mol·L - 1 Tris/ HCl (p H 714) 5 ml、5 mmol·L - 1
MgCl2 2 ml、4 mg·ml - 1 NB T (Nitro2blue Tetrazonium) 5 ml、
215 mol·L - 1 Na2succinate 2 ml 和 H2O 6 ml. AL P 染色液为
0105 mol·L - 1 Tris/ citric acid (p H 912) 18 ml、1 mg·ml - 1 a2
naphthyl acid phosphate 20 ml、1 mg·ml - 1 Fast Blue RR salt
20 ml、015 mg·ml - 1 MgCl2 1 ml 和 018 mg·ml - 1 MnCl2 ·
4H2O 1 ml. 显微镜下镜检 ,SDH 为紫黑色颗粒 ,AL P 为深棕
色颗粒.
所有实验数据均通过 SAS软件在 P ≤0105 水平上进行
差异显著性分析.
3 　结果与分析
311 　紫云英生物量的测定
由表 1 可见 ,3 次取样紫云英的生物量都有显
著差异. 对照组中的 3 个对照 (“0”对照、Rh 对照和
Gi 对照)之间的生物量无显著差异 ; Gi + Rh 组紫云
英的生物量 ,第 4 周取样 ,与 3 个对照相比都有显著
差异 ,第 7 周取样 ,只与“0”对照有显著差异 ,第 10
周取样 ,与“0”对照和“Gi”对照有显著差异 ; Gi + Rh
加类黄酮组 ,与对照和 Gi + Rh 组相比 ,紫云英的生
物量都有显著差异 ,但不同类黄酮 (apigenin 和 hes2
peritin) 之间 ,及同一种类黄酮不同浓度 (150 nmol·
L - 1和 115μmol·L - 1)处理间 ,紫云英生物量无显著
差异. Endo21 处理结果与 G. i nt raradices 相类似.
表 1 　G. int ra radices、Endo21 与 Rhizobium互作对紫云英生物量的
影响 3
Table 1 Influence on the biomass of Astragalus sinicus by G. in2
t ra radices , Endo21 and Rhizobium( g)
处 理
Treatment
第 4 周取样
The 4th weeks
第 7 周取样
The 7th weeks
第 10 周取样
The 10th weeks
G. int r2 O (CK) 017c 414c 913c
aradices Rh (CK) 019c 617bc 1217c
Gi (CK) 018c 516bc 1110c
Gi + Rh 112b 811b 1417b
Gi + Rh + A150 116a 1214a 1713a
Gi + Rh + A115 115ab 1019ab 1817a
Gi + Rh + H150 117a 1315a 1816a
Gi + Rh + H115 117a 1213a 1716a
Endo21 O (CK) 017c 414c 913c
Rh (CK) 019c 617bc 1217bc
En (CK) 018c 518bc 1015c
En + Rh 114b 813b 1519ab
En + Rh + A150 119a 1217a 2012a
En + Rh + A115 117a 1215a 1718a
En + Rh + H150 119a 1211a 1819a
En + Rh + H115 116ab 1115a 1918a3 表中数据为每次取样 3 个重复的平均值 ,同一列数据 ,相同的字母差异性不
显著 The data represent the mean values of replicates ,values in each column fol2
lowed by the same letter do not differ significantly ( P ≤0105 ; SAS’test) . 下同
The same below.
312 　紫云英的结瘤数统计
每次取样时对接种根瘤菌的紫云英根中的根瘤
进行计数 ,并统计每杯中 3 棵紫云英植株的结瘤总
数 (表 2) .
表 2 中 ,与对照相比 , Gi + Rh 组紫云英的结瘤
数只在第 4 周取样时有显著差异 ,而 En + Rh 组紫
云英的结瘤数有显著差异 ;与对照 ( Rh) 和 Gi + Rh ,
6851 应 　用 　生 　态 　学 　报 　　　　　　　　　　　　　　　　　　15 卷
En + Rh 组相比 ,类黄酮处理组紫云英的结瘤数都
有显著差异 ,但不同的类黄酮 (apigenin 和 hesper2
itin)处理间 ,及同一种类黄酮不同浓度 (150 nmol·
L - 1和 115μmol·L - 1)处理间 ,紫云英的结瘤数无显
著差别.
表 2 　G. int ra radices、Endo21 与 Rhizobium互作对紫云英结瘤数的
影响
Table 2 Influence on the nodule numbers of Astragalus sinicus by G.
int ra radices , Endo21 and Rhizobium( ind. )
处 理
Treatment
第 4 周取样
The 4th weeks
第 7 周取样
The 7th weeks
第 10 周取样
The 10th weeks
G. int r2 Rh (CK) 23c 106c 212b
aradices Gi + Rh 39b 166b 285bc
Gi + Rh + A150 53a 306a 385a
Gi + Rh + A115 50ab 260a 358ab
Gi + Rh + H150 61a 263a 392a
Gi + Rh + H115 55a 273a 353ab
Endo21 Rh (CK) 23c 106c 212b
En + Rh 42b 178b 296ab
En + Rh + A150 57a 227ab 394a
En + Rh + A115 49ab 234a 379a
En + Rh + H150 58a 244a 406a
En + Rh + H115 52ab 241a 384a
313 　AM 真菌根段侵染率的测定
AM 真菌对紫云英根段的侵染率可以通过对
Trypan blue 染色后的根段进行镜检而获得 (表 3) .
表 3 　Rhizobium与 G. int ra radices、Endo21 互作对 AM 真菌侵染率
的影响
Table 3 Influence on the infection rates of G. int ra radices , Endo21 by
Rhizobium( %)
处 理
Treatment
第 4 周取样
The 4th weeks
第 7 周取样
The 7th weeks
第 10 周取样
The 10th weeks
G. int r2 Gi (CK) 2313b 4317b 5418c
aradices Gi + Rh 3616a 6613ab 6912b
Gi + Rh + A150 4812a 8519a 9216a
Gi + Rh + A115 4216a 8017a 8913a
Gi + Rh + H150 4710a 8313a 8819a
Gi + Rh + H115 4512a 7118ab 8718a
Endo21 En (CK) 2916b 5313b 6516c
En + Rh 4414ab 7815a 7811b
En + Rh + A150 5515a 9610a 9718a
En + Rh + A115 5317a 9010a 9313a
En + Rh + H150 5718a 9613a 9512a
En + Rh + H115 5411a 9418a 9317a
　　由表 3 可见 ,与对照 ( Gi) 相比 , Gi + Rh 组 G.
i nt raradices 对紫云英根段的侵染率有显著差异 ;与
对照 ( Gi)和 Gi + Rh 组相比 ,类黄酮处理组 G. i n2
t raradices 对紫云英根段的侵染率有显著差异 ,但不
同的类黄酮 (apigenin 和 hesperitin) 处理间 ,及同一
种类黄酮不同浓度 ( 150 nmol·L - 1 和 115 μmol·
L - 1) 处理间 , G. i nt raradices 对紫云英根段的侵染
率无显著差别. 各处理对 Endo21 侵染率的影响与
G. i nt raradices 相类似.
314 　AM 真菌菌丝 AL P 和 SDH 活性观察
琥珀酸脱氢酶 ( succinate dehydrogenase ,SDH) ,
是一个线粒体酶 ,是菌根生活力的标志 ,但不能反映
菌根在促进植物生长的有效性[8 ] . 碱性磷酸酶 (al2
kaline phosphatase ,AL P) 位于 AM 真菌菌丝积累 P
的液泡内 ,是菌根有效性的一个重要生理标记[18 ] .
对菌丝 AL P 和 SDH 染色的紫云英根段 ,每一样品
任取 30 个 1 cm 长的根段分别进行活性观察 ,其统
计分析结果见表 4.
表 4 　Rhizobium 与 G. int ra radices、Endo21 互作对 AM 真菌菌丝
ALP和 SD H活性的影响
Table 4 Influence on the hyphal ALP and SD H activity of G. in2
t ra radices , Endo21 by Rhizobium( %)
处理
Treatment
第 4 周取样
The 4th weeks
AL P SDH
第 7 周取样
The 7th weeks
AL P SDH
第 10 周取样
The 10th weeks
AL P SDH
G. intr2 Gi (CK) 1115c 1813c 2417c 3913d 2416d 4111d
aradices Gi + Rh 1813b 2913b 3919b 5916c 3111c 5119c
Gi + Rh + A150 2411a 3815a 5115a 7713a 4117a 6915a
Gi + Rh + A115 2113ab 3410ab 4812a 7216ab 4010ab 6710ab
Gi + Rh + H150 2315a 3716a 4917a 7416ab 3919ab 6710ab
Gi + Rh + H115 2216a 3610a 4315ab 6219bc 3913b 6515b
Endo21 En(CK) 1418c 2317c 3116c 4813c 2914d 4819d
En + Rh 2211b 3512b 4618b 7012b 3512c 5816c
En + Rh + A150 2718a 4414a 5716a 8613a 4318a 7310a
En + Rh + A115 2618a 4214a 5316ab 8014a 4113b 6818b
En + Rh + H150 2817a 4516a 5712a 8518a 4215ab 7018ab
En + Rh + H115 2711a 4217a 5614a 8415a 4210ab 7010ab
　　由表 4 可见 , G. i nt raradices 菌丝 AL P 的活性
与对照 ( Gi) 相比 , Gi + Rh 组有显著差异 ;与对照
( Gi)及 Gi + Rh 组相比 ,类黄酮处理组菌丝 AL P 活
性也有显著差异 ,但除第 10 周取样 Gi + Rh + H115
组外 ,各类黄酮处理组间 ,菌丝 AL P 活性无显著差
异.对于 G. i nt raradices 菌丝 SDH 的活性 ,与对照
( Gi)相比 , Gi + Rh 组有显著差异 ;与对照 ( Gi) 及 Gi
+ Rh 组相比 ,类黄酮处理组菌丝的 SDH 活性也有
显著差异 ,第 7、10 周取样 ,各类黄酮处理组间 ,菌丝
SDH 活性有一定的差异 (如第 10 周取样 , Gi + Rh +
A150组 SDH 为 6915 % , Gi + Rh + H115 组 SDH 为
6515 %) .
而 Endo21 菌丝 AL P 活性与对照 ( En) 相比 , En
+ Rh 组有显著差异 ;与对照 ( En) 及 En + Rh 组相
比 ,类黄酮处理组菌丝 AL P 活性也有显著性差异 ,
第 10 周取样 ,类黄酮处理组间 En + Rh + A150组与
En + Rh + A115组菌丝 AL P 活性有一定的差异 (分别
为 4318 %和 4113 %) . 对于 Endo21 菌丝 SDH 活性 ,
与对照 ( En) 相比 , En + Rh 组有显著差异 ;与对照
( En)及 En + Rh 组相比 ,类黄酮处理组菌丝 SDH 活
性也有显著性差异 ,第 10 周取样 ,类黄酮处理组间
En + Rh + A150组与 En + Rh + A115组菌丝 SDH 活性
也有一定的差异 (分别为 7310 %和 6818 %) .
78519 期 　　　　　　　　　　董昌金等 :丛枝菌根真菌与根瘤菌互作及类黄酮对互作效果的影响 　　　　　　　　　　　
4 　讨 　　论
N、P 是植物生长所必需的主要营养元素. AM
真菌与根瘤菌双接种于豆科植物 ,根瘤菌通过生物
固氮为豆科植物生长提供有效的氮源 ,AM 真菌为
植物的生长提供有效的 P ,使豆科植物的生物量明
显增加 (表 1) . 同时 ,AM 真菌与根瘤菌互作可增加
根瘤菌的结瘤数、鲜瘤重和固氮酶的活性[12 ,22 ] ,这
可能与 AM 真菌增进植物和根瘤菌的 P 营养有关.
本研究中 ,AM 真菌与根瘤菌互作并添加适量
的类黄酮更能促进根瘤菌的结瘤固氮和 AM 真菌
的侵染 ,但不同类黄酮 (apigenin 和 hesperitin) 间 ,或
同一种类黄酮不同浓度 (150 nmol·L - 1和 115μmol·
L - 1)处理间差异不显著. 这说明在一定范围内 (150
nmol·L - 1～115μmol·L - 1) ,AM 真菌与根瘤菌对不
同种类和浓度的类黄酮敏感性相同.
实验中观察到 ,AM 真菌菌丝极少穿入到豆科
植物的根瘤中 ,避开根瘤 ,从根瘤组织的基部穿过宿
主植物的根 ,其原因可能是根瘤菌中大量的根瘤菌
体或其分泌物阻碍了 AM 真菌菌丝的侵入 ,尚有待
于进一步研究.
类黄酮对根瘤菌的结瘤数、AM 真菌侵染率和
菌丝酶活都有积极的影响 ,即 apigenin 和 hesperitin
对 AM 真菌与根瘤菌互作可能起信号分子作用 ,诱
导根瘤菌“nod”结瘤基因的表达[9 ,13 ]和调节 AM 真
菌共生基因的活性.
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作者简介 　董昌金 ,男 ,1963 年生 ,博士 ,副教授 ,主要从事
AM 菌根真菌生理、生化、生态与分子生物学研究 ,发表论文
30 多篇. Tel :071426573823
8851 应 　用 　生 　态 　学 　报 　　　　　　　　　　　　　　　　　　15 卷