全 文 ：收稿日期:2011 － 10 － 10;修回日期:2011 － 10 － 17
基金项目:浙江省自然基金(Y307063)
作者简介:邹 秀(1986 －) ，女，汉族，硕士研究生，主要从事水生动物学研究，E-mail:zouxiu99@ 163． com ;
通讯作者:王丹丽，女，博士，教授，主要从事水生动物学和水产动物资源保护生物学研究，E-mail:wangdanli@ nbu． edu． cn。
doi∶10． 3969 / j. issn. 2095 － 1736． 2012. 03. 006
浙江 4 地桃花水母的 rDNA-ITS序列分析
邹 秀1，王丹丽1，2，徐善良1，2，薛良义1，2，许明娟1
(1． 宁波大学海洋学院，浙江 宁波 315211;
2． 宁波大学应用海洋生物技术教育部重点实验室，浙江 宁波 315211)
摘 要:采用 PCR和 DNA测序技术，对浙江省 4 个地点桃花水母(Craspedacusta)的核糖体 RNA基因内转录间隔区
(rDNA-ITS)进行了扩增与测序，并与 GenBank中已有的桃花水母 ITS区基因序列进行比对分析，计算了它们的遗传
距离，利用 MEGA 4. 1 构建了系统发育树。结果显示:这 4 个地点的桃花水母与索氏桃花水母(Craspedacusta sower-
byi)的 ITS区基因相似度极高，同源性都在 97%以上，遗传距离保持在 0 ～ 0. 008 之间，在进化树中与索氏桃花水母
聚为同一支。研究结果表明，这 4 地的桃花水母都属于索氏桃花水母(C． sowerbyi)。
关键词:桃花水母;rDNA-ITS;序列分析
中图分类号:Q959． 131 + ． 2 文献标识码:A 文章编号:2095 － 1736(2012)03 － 006 － 05
Sequences analysis of ribosomal DNA internal transcribed spacer
of Craspedacusta from four regions in Zhejiang
ZOU Xiu1，WANG Dan-li1，2，XU Shan-liang1，2，XUE Liang-Yi1，2，XU Ming-Juan1
(1． Marine College of Ningbo University，Ningbo 315211;2． Key Laboratory
of Applied Marine Biotechnology，Ministry of Education，Ningbo University，Ningbo 315211，China)
Abstract:The internal transcribed spacer of ribosomal DNA (rDNA-ITS)of Craspedacusta sp． collected from 4 locations of Zhejiang
Province was amplified with Polymerase Chain Reaction(PCR)and then sequenced． Aligning with other kinds of Craspedacusta re-
trieved from GenBank，the genetic distance was calculated and phylogenetic tree was constructed using the software MEGA 4． The re-
sult showed that the ITS of Craspedacusta sp． from the 4 regions was highly similar to those of Craspedacusta sowerbyi (similarity be-
tween 97% and 100%)． The genetic distances between the samples ranged from 0 to 0. 008，and Craspedacusta sp． from the 4 regions
were belong to the C． sowerbyi in the phylogenetic tree． Summarily，Craspedacusta sp． from the 4 regions are Craspedacusta sowerbyi．
Keywords:Craspedacusta;rDNA-ITS;taxonomy
桃花水母俗称桃花鱼，属于刺胞动物门(Cnidaria)
水螅纲(Hydrozoa)淡水水母目(Limnomedusae)笠水母
科(Olindiidae)桃花水母属(Craspedacusta) ，是腔肠动
物中水母类仅有的淡水种类［1］。100 多年来全世界只
发现 11 种桃花水母，除英国的索氏桃花水母(Crasped-
acusta sowerbyi Lankester 1880)和日本的伊氏桃花水母
(Craspedacusta iseanum 1922)外，其余 9 种［2］均产在中
国。但是，世界上公认的桃花水母只有 3 种即索氏桃
花水母、伊氏桃花水母和中华桃花水母(Craspedacusta
sinensis )。目前国内主要依据形态特征对桃花水母进
行分类，但其局限性［3］给分类工作带来了一定的困难。
随着分子生物学技术的发展，出现了一些新的生物分
类方法，其中利用 DNA分子标记技术对生物进行分类
具有多态性强、准确率高，不受环境及基因表达与否的
限制等特点［4］，已被广泛运用于动物的分类学研究领
域［5 － 7］。因此，利用分子生物技术开展桃花水母分类
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的研究是非常必要的。
真核生物的核糖体 DNA 由 18S、5. 8S 和 28S 组
成。其中位于 5. 8S 和 28S rDNA 之间的片段，称之为
核糖体 DNA 内转录间隔区即 ITS (internal transcribed
spacer)。ITS区域的进化速率比核糖体大小亚基(18S
rDNA /28S rDNA)快，是核苷酸替换率较高的区域，可
以提供比较丰富的变异信息，其碱基序列和长度在不
同的物种当中有着较大的差异，而且在同一个体的不
同操纵子上也可能存在差异［8］。ITS 区碱基序列同源
性的程度决定了生物之间亲源关系的远近，并以此划
分物种，已被成功地应用于刺胞动物门物种的鉴定和
分类上［9 － 13］。本研究对浙江省 4 个地点的桃花水母
ITS区基因进行了克隆和测序，并与已知的桃花水母的
ITS序列进行比对，旨在确定浙江省 4 个地点桃花水母
的分类地位。
1 材料和方法
1. 1 材料
实验所用标本采自 2005 年至 2008 年间，从浙江
省 3 个地区 4 个地点采集得到桃花水母，保存于 80%
乙醇中 (见表 1)。
表 1 桃花水母样品采集表
Table 1 Collection date and locations of Craspedacusta sample
编号 采集时间 采集地点
XS 07. 10. 26 宁波市象山郊区小水泥池内
JB 05. 9. 29 宁波市江北区消防池
PY 08. 5. 13 温州平阳水亭水库
YK 08. 8. 02 金华永康上黄水库
1. 2 实验方法
1. 2. 1 桃花水母总 DNA的提取
每个地点取 7 个桃花水母，将桃花水母标本从
80%的酒精中取出，经酒精梯度过渡，双蒸水清洗数遍
后，置于 1. 5 mL灭菌的离心管中。加入 100 μL TE 缓
冲液后破碎，再加入 1 /10 体积的 10% SDS 和 2 μL 的
蛋白酶 K，置于 55℃水浴锅中消化完全。再经酚-氯仿
抽提两次、无水乙醇沉淀、70%乙醇漂洗 2 次后，晾干，
无菌 ddH2O充分溶解，－ 20℃保存备用。
1. 2. 2 引物的设计、合成和 PCR扩增
根据 GenBank中已有的中国其它地区的桃花水母
ITS序列，运用 Vector NTI Suite 7 和 Primer primer 5 软
件设计 1 对引物(ITSC1:5-GTCGTAACAAGGTTTCCG-
TAGG-3; ITSC2: 5-GGTAGTCTTGCCTGATCTGAGG-
3) ，并由上海英骏生物技术有限公司合成。PCR 扩增
体系总体积为 50 μL(10 × PCR buffer 5 μL，引物 20
μmoL /L 各 0. 5 μL，25 mmoL /L MgCl 22. 5 μL，10
mmoL /L d NTP 2 μL，Taq DNA 聚合酶 0. 5 μL，模板
DNA 2 μL) ;扩增条件为:94℃变性 3min，然后进行 33
个循环(94℃ 40 s，66℃ 60 s，72℃ 60 s) ，最后于 72℃
再延伸 10 min。
1. 2. 3 PCR产物的回收、目的基因的克隆与鉴定
按照 GenClean 琼脂糖凝胶脱氧核糖核酸回收试
剂盒的说明进行 PCR 产物的回收。纯化后的 DNA 与
pMD18-T连接、转化及重组子检测按常规方法进行。
1. 2. 4 测序及序列分析
将菌液送上海英骏生物技术公司进行 DNA 双向
测序，同时利用 DNAMAN和 MEGA 4. 1 分析软件将测
序所得的 ITS基因序列与 GenBank上收录的桃花水母
的 ITS基因序列进行相似性比对，计算序列同源性，用
“Pairwise distance”计算各序列间的相对遗传距离，采
用邻接法(Neighbore-Joining，NJ)构建分子系统进化
树，系统树各分支的置信度由 Bootstrap1 000 循环检
验。
2 结果与分析
2. 1 浙江省 4 个地点桃花水母 ITS 区基因的 PCR 扩
增结果
对宁波市江北区、宁波市象山郊区、温州市平阳、
金华市永康 4 个地方提取得到的桃花水母 DNA 进行
PCR扩增，PCR扩增后，经 1. 2%琼脂糖凝胶电泳，均
得到 800 bp左右的目的产物(图 1)。
图 1 浙江 4 地点桃花水母 ITS区 PCR扩增结果
Fig 1 PCR amplified results of ITS of Craspedacusta sp．
in four locations of Zhejiang province
M—DL2000 DNA Marker;1—2007 年采集于宁波象山郊区;2—2005
年采集于宁波江北;3—2008 年采集于温州平阳;4—2008 年采集于
金华永康。
2. 2 浙江省 4 个地点桃花水母 ITS 区基因的测序结
果
将测序结果(图 2 ～ 5)输入 NCBI 网站用 Blast 与
GenBank中的已知序列进行比对，确认为索氏桃花水
母(C． sowerbyi)物种的 ITS区基因序列无误。而且，浙
江省 4 个地点采集得到的桃花水母与 NCBI 中已有的
索氏桃花水母的 ITS 区同源性都在 97%以上，而与其
它桃花水母的同源性在 50%至 80%之间。该 4 条序
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列已登陆 GenBank，序列号为 JN874927-JN874930。
2． 3 浙江 4 地桃花水母 ITS区基因序列特征及分析
结合 GenBank 中已有的桃花水母 ITS 区基因序
列，利用 Vector软件进行比对分析，发现本实验扩增所
得到的 ITS 区基因包含了 44 bp 的 18SrDNA、长度在
235 ～ 251 bp之间的 ITS1、161 bp的 5. 8SrDNA、长度在
271 ～ 304 bp之间的 ITS2 以及 30 bp左右的 28S rDNA。
表 2 ITS区基因序列长度和核苷酸数量
Table 2 Nucleotide composition percentage and length of ITS
样品编号 T% C% A% G% A + T% C + G% 总长(bp)
XS 24. 8 21. 2 26. 4 27. 6 51. 2 48. 8 773
JB 24. 9 20. 6 27. 1 27． 4 52 48 787
PY 25． 9 20． 5 26． 6 27． 0 52． 5 47． 5 745
YK 25． 2 20． 6 26． 8 27． 4 52 48 787
Avg． 25． 2 20． 7 26． 7 27． 4 51． 9 48． 1 773
2． 3． 1 碱基含量分析
利用 MEGA4. 1 软件中的 Statistics 选项的 Nucleo-
tide Composition分别对 4 个地点桃花水母的 ITS 区基
因进行碱基含量分析(表 2) ，发现与 GenBank 中已有
索氏桃花水母 ITS区的各碱基数量和含量极为接近。
2． 3． 2 与中国 28 地桃花水母 ITS区基因比对及分析
利用 MEGA 4． 1 软件将 4 个地点桃花水母的 ITS
区基因序列与中国其它 28 个地方桃花水母的 ITS 区
基因序列进行多序列比对，用“Pairwise distance”计算
出各序列间的相对遗传距离(表 3) ，并用 NJ法构建了
系统发育树(图 2) ，Bootstrap1 000 给出各分支的置信
度(仅显示 50%以上的置信度)。从遗传距离上看，本
实验所研究的 4 地桃花水母与索氏桃花水母的遗传距
离保持在 0 ～ 0． 008 之间，而与其它桃花水母的遗传距
离在 0 ～ 0． 350 之间。从亲缘关系来看，进化树大体上
分为 3 支，浙江 4 地桃花水母与索氏桃花水母聚为一
支。
表 3 基于 ITS区基因建立的 32 地桃花水母相对遗传距离图
Table 3 Genetic distances between 32 species of Craspedacusta based on ITS
序号 种名 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32
1 XS
2 JB 0. 005
3 PY 0. 009 0. 005
4 YK 0. 008 0. 003 0. 008
5 so，YK 0. 006 0. 002 0. 006 0. 005
6 so，YTZ 0. 008 0. 003 0. 005 0. 006 0. 002
7 so，YTZ 0. 008 0. 003 0. 005 0. 006 0. 002 0. 005
8 so，NY 0. 008 0. 003 0. 005 0. 006 0. 002 0. 005 0. 000
9 so，PY 0. 008 0. 003 0. 005 0. 006 0. 002 0. 005 0. 000 0. 000
10 so，XS 0. 006 0. 002 0. 003 0. 005 0. 003 0. 003 0. 002 0. 002 0. 002
11 so，XA 0. 008 0. 003 0. 008 0. 003 0. 008 0. 005 0. 006 0. 006 0. 006 0. 005
12 so，YK 0. 008 0. 003 0. 005 0. 006 0. 002 0. 005 0. 000 0. 000 0. 000 0. 002 0. 006
13 so，ZL 0. 008 0. 003 0. 005 0. 006 0. 005 0. 005 0. 003 0. 003 0. 003 0. 002 0. 006 0. 003
14 so，ZJ 0. 006 0. 002 0. 003 0. 005 0. 003 0. 003 0. 002 0. 002 0. 002 0. 000 0. 005 0. 002 0. 002
15 so，ZZ 0. 006 0. 002 0. 003 0. 005 0. 003 0. 003 0. 002 0. 002 0. 002 0. 000 0. 005 0. 002 0. 002 0. 000
16 br，ZG 0. 338 0. 338 0. 343 0. 338 0. 343 0. 340 0. 340 0. 340 0. 340 0. 338 0. 340 0. 340 0. 338 0. 338 0. 338
17 ki，DY 0. 164 0. 158 0. 160 0. 160 0. 160 0. 160 0. 159 0. 159 0. 159 0. 157 0. 160 0. 159 0. 158 0. 157 0. 157 0. 328
18 ki，HY 0. 164 0. 159 0. 161 0. 160 0. 161 0. 161 0. 159 0. 159 0. 159 0. 157 0. 160 0. 159 0. 159 0. 157 0. 157 0. 325 0. 003
19 ki，PX 0. 164 0. 159 0. 161 0. 160 0. 161 0. 161 0. 159 0. 159 0. 159 0. 157 0. 160 0. 159 0. 159 0. 157 0. 157 0. 325 0. 003 0. 000
20 ki，WZ 0. 164 0. 159 0. 161 0. 160 0. 161 0. 161 0. 159 0. 159 0. 159 0. 157 0. 160 0. 159 0. 159 0. 157 0. 157 0. 325 0. 003 0. 000 0. 000
21 ki，YT 0. 164 0. 159 0. 161 0. 160 0. 161 0. 161 0. 159 0. 159 0. 159 0. 157 0. 160 0. 159 0. 159 0. 157 0. 157 0. 325 0. 003 0. 000 0. 000 0. 000
22 sic，QC 0. 164 0. 159 0. 161 0. 160 0. 161 0. 161 0. 159 0. 159 0. 159 0. 157 0. 160 0. 159 0. 159 0. 157 0. 157 0. 325 0. 003 0. 000 0. 000 0. 000 0. 000
23 sin，JA 0. 346 0. 346 0. 353 0. 346 0. 351 0. 348 0. 348 0. 348 0. 348 0. 348 0. 348 0. 348 0. 348 0. 348 0. 348 0. 011 0. 341 0. 338 0. 338 0. 338 0. 338 0. 338
24 sin，LZ 0. 345 0. 345 0. 350 0. 345 0. 348 0. 348 0. 346 0. 346 0. 346 0. 345 0. 348 0. 346 0. 345 0. 345 0. 345 0. 006 0. 336 0. 333 0. 333 0. 333 0. 333 0. 333 0. 008
25 sin，WY 0. 340 0. 340 0. 345 0. 340 0. 345 0. 343 0. 343 0. 343 0. 343 0. 340 0. 342 0. 343 0. 340 0. 340 0. 340 0. 002 0. 330 0. 328 0. 328 0. 328 0. 328 0. 328 0. 013 0. 008
26 xi，AJ 0. 009 0. 005 0. 006 0. 008 0. 006 0. 006 0. 005 0. 005 0. 005 0. 003 0. 008 0. 005 0. 005 0. 003 0. 003 0. 342 0. 157 0. 157 0. 157 0. 157 0. 157 0. 157 0. 353 0. 350 0. 345
27 xi，YT 0. 008 0. 003 0. 005 0. 006 0. 002 0. 005 0. 000 0. 000 0. 000 0. 002 0. 006 0. 000 0. 003 0. 002 0. 002 0. 340 0. 159 0. 159 0. 159 0. 159 0. 159 0. 159 0. 348 0. 346 0. 343 0. 005
28 zi，ZG 0. 169 0. 163 0. 165 0. 165 0. 165 0. 165 0. 163 0. 163 0. 163 0. 161 0. 165 0. 163 0. 163 0. 161 0. 161 0. 344 0. 032 0. 029 0. 029 0. 029 0. 029 0. 029 0. 357 0. 352 0. 346 0. 161 0. 163
29 sin，JW 0. 340 0. 340 0. 345 0. 340 0. 343 0. 343 0. 340 0. 340 0. 340 0. 340 0. 342 0. 340 0. 340 0. 340 0. 340 0. 002 0. 330 0. 328 0. 328 0. 328 0. 328 0. 328 0. 009 0. 005 0. 003 0. 345 0. 340 0. 346
30 sin，MP 0. 338 0. 338 0. 343 0. 338 0. 343 0. 340 0. 340 0. 340 0. 340 0. 338 0. 340 0. 340 0. 338 0. 338 0. 338 0. 000 0. 328 0. 325 0. 325 0. 325 0. 325 0. 325 0. 011 0. 006 0. 002 0. 342 0. 340 0. 344 0. 002
31 sin，XX 0. 338 0. 338 0. 343 0. 338 0. 343 0. 340 0. 340 0. 340 0. 340 0. 338 0. 340 0. 340 0. 338 0. 338 0. 338 0. 000 0. 328 0. 325 0. 325 0. 325 0. 325 0. 325 0. 011 0. 006 0. 002 0. 342 0. 340 0. 344 0. 002 0. 000
32 sin，BB 0． 342 0. 342 0. 347 0. 342 0. 347 0. 345 0. 345 0. 345 0. 345 0. 342 0. 345 0. 345 0. 342 0. 342 0. 342 0. 003 0. 330 0. 328 0. 328 0. 328 0. 328 0. 328 0. 014 0. 009 0. 005 0. 347 0. 345 0. 346 0. 005 0. 003 0. 003
注:br、ki、sic、sin、so、xi和 zi分别表示短手桃花水母、嘉定桃花水母、四川桃花水母、中华桃花水母、索氏桃花水母、信阳桃花水母和秭归桃花水母。
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图 2 32 地桃花水母的 ITS区系统发育树
Fig 2 Phylogenetic tree of Craspedacusta ITS in 32 regions based
on neighbor-joining method
3 讨论
目前国内外对桃花水母的研究主要集中在形态
学、地理分布、生活史及其生态学方面［14 － 19］，近年也
见于可量化形态参数的统计分析［20 － 21］。其中对桃
花水母的分类研究主要是依据形态特征来判断:比
如说触手的数目、平衡囊的形状和数目、刺丝囊疣的
形状和排列、生殖腺的形状和颜色等［1 － 3］。在长期
的分类研究中发现，由于桃花水母在发育不同时期，
其形态特征会有相应的改变［3，22］，因而给分类工作
带来了一定的难度。DNA 序列是遗传效应的承载
者，能直观的体现遗传信息，不受时空的限制，可以
较好地弥补形态分类学的不足。最早利用 DNA 分
析技术对桃花水母属进行研究的是张立强和高
谦［13］、胡义波等对杭州和绍兴两个地区桃花水母
18S rRNA基因序列的分析［5］和徐善良等对浙江省
7 个地点桃花水母 18S rRNA 基因序列分析及物种
鉴定［23］。
核糖体 rRNA 基因是高度保守的，其突变积累
在线形重复排列的 rRNA 基因两侧的非编码区，从
而使核糖体基因间隔区序列具有种内和种间的特异
性，这种变化有助于种下分型和变异研究［4，24］。同
时在 ITS区基因两侧保守性很高的 18S rRNA和 28S
rRNA基因使引物设计也比较容易操作。大量的研
究表明核糖体 rDNA 转录内间隔区(ITS)可以应用
于属种之间以及亚种水平的鉴别研究［8 － 13，23 － 24］。
本文研究的浙江 4 地桃花水母，分别是 2007 年采自
宁波象山市郊、2005 年采自宁波江北消防池、2008
年采自温州平阳以及 2008 年采集自金华永康上黄
水库的桃花水母。通过对 ITS 区基因序列进行分
析，并与 GenBank中已有的桃花水母 ITS 区基因进
行比对，发现与索氏桃花水母(C． sowerbyi)的同源
性都在 97%以上，而与其它桃花水母的同源性在
50%到 80%之间。进一步对遗传距离和进化树分
析，发现 4 地桃花水母与索氏桃花水母的遗传距离
保持在 0 ～ 0． 008 之间，而与其它桃花水母的遗传距
离较远，在 0 ～ 0． 350 之间，在进化树中也与索氏桃
花水母聚为同一支，从而从分子水平上得出浙江省
4 个地点桃花水母均属于索氏桃花水母的结论。该
结论与我们对这 4 个地点桃花水母的形态学分
类［16］及 18S rRNA基因序列分析［23］结果一致。
本实验所研究的 4 地桃花水母彼此之间的遗传
距离都在 0． 009 范围之内，说明在 ITS 区基因范围
内，4 个水母的序列变化不大，有很高的遗传相似
度。与中国各地的桃花水母相比较，这 4 地桃花水
母与青城山、郫县、云台山、德阳以及温州另一个地
点采集到的桃花水母遗传距离稍近一些，在 0． 200
左右;与重庆、茅坪、九畹溪、湘西、舞阳河、泸州以及
江安的遗传距离相对来说较远一些，达到了 0． 350
左右。在 ITS区基因序列基础上建立的进化树，大
体上分为 3 支，最庞大的一支为索氏桃花水母。这
一支主要分布在浙江、湖南、河南等中东部地区;而
后两支大多来自于四川、重庆、贵州等华南地区。由
此，我们可以推测，桃花水母种群的分布与地理位置
有着明显关系。本实验中采自 2005 年宁波江北、
2007 年宁波市象山郊区以及 2008 年金华永康的桃
花水母 ITS区序列与张立强等［13］采自 2003 年宁波
横溪、2003 年宁波象山另一采集地以及 2003 年金
华永康另一采集地的桃花水母同源性都达到 97%
以上，序列变化不大。而 2008 年采自温州平阳的桃
花水母的 ITS序列，与张立强等［13］2002 年采自温州
桃花水母标本的序列同源性只有 91%。这两个桃
花水母虽然都来自温州地区，但是取自温州不同的
地点，可能是因为两者长期生长在不同的生态环境，
变异逐渐累积，所以导致同源性降低，这也有待于以
后进一步的研究。
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第 29 卷第 3 期
2012 年 6 月
生 物 学 杂 志
JOURNAL OF BIOLOGY
Vol． 29 No． 3
Jun，2012
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