全 文 ：收稿日期:2011 － 10 － 10 接受日期:2011 － 12 － 05
基金项目:公益性行业(农业)科研专项(201103018)
作者简介:符美英(1982 －) ，女，助理研究员，硕士。研究方向:植物线虫。E-mail:Fumeiyingzi2011@ 163． com
通讯作者(Author for correspondence):陈绵才，E-mail:mcchen@ 263． net
海南岛象耳豆根结线虫的种类鉴定
及其 rDNA-ITS序列分析
符美英，芮 凯，肖彤斌，黄伟明，陈绵才
海南省农业科学院农业环境与植物保护研究所，海南省植物病虫害防控重点实验室，海南 海口 571100
摘要:【背景】植物根结线虫病是世界性分布的土传病害，常造成农作物的重大经济损失。目前分布于热带亚热带区域的
象耳豆根结线虫，由于其致病性和分子特征以及与植物互作关系的独特性，被认为是一种对农作物具有潜在危害性的重要
病原根结线虫，因而引起国内外植物寄生线虫学者的广泛关注。【方法】用形态学、同工酶技术和分子生物学技术相结合的
方法，对从海南岛农作物上采集到的 10 个根结线虫纯化种群进行分类鉴定。【结果】象耳豆根结线虫在海南岛大面积栽培
的 10 种农作物和南药植物，包括黄瓜、南瓜、苦瓜、丝瓜、葫芦瓜、辣椒、番石榴、海巴戟、沈香和丁香上均有寄生，其形态学、
酯酶表型和 mtDNA-PCR扩增产物均有别于常见的根结线虫种类;用引物 18S和 28S扩增象耳豆根结线虫种群的 rDNA-ITS
区序列，并对其进行克隆、测序和比对分析，结果表明，象耳豆根结线虫 4HBJ种群分别与南方根结线虫、爪哇根结线虫和花
生根结线虫的同源性均仅为 88%左右。【结论与意义】本文准确鉴定了象耳豆根结线虫，首次阐述其对海南岛多种农作物
的致害性;阐释了象耳豆根结线虫的形态和分子特征，并明确了其与 3 种常见根结线虫的系统发育关系。本研究对今后进
一步开展象耳豆根结线虫的基础研究和防治工作具有重要参考价值。
关键词:象耳豆根结线虫;鉴定;rDNA-ITS
Identification and analysis of rDNA-ITS of the nematode
Meloidogyne enterolobii on Hainan Island，China
Mei-ying FU，Kai RUI，Tong-bin XIAO，Wei-ming HUANG，Mian-cai CHEN
Hainan Key Laboratory for Control of Plant Diseases and Insect Pests，Institute of Environment ＆ Plant Protection，
Hainan Academy of Agricultural Sciences，Haikou，Hainan 571100，China
Abstract:【Background】The Plant root-knot nematode disease (Meloidogyne spp．)is a soil-borne pest and may cause great eco-
nomic losses． As M． enterolobii is distributed widely in the tropical and subtropical regions，and is a potentially harmful pathogenic
root-knot nematode for several cultivated crops，it is the subject of intensive study around the world，based on its peculiarity of path-
ogenicity，molecular characteristics and interaction with plants． 【Method】Ten purified populations of root-knot nematodes collected
from Hainan Province，Southern China，were identified by using the morphological，isozyme and molecular biological methods．
【Result】The presence of M． enterolobii was confirmed on 10 cultivated crops and herbs，including as cucumber，pumpkin，balsam
pear，loofah，bottle gourd，pepper，guava，clove and the herbs Morinda citrifolia，and Excoecaria agallocha． Its morphology，ester-
ase phenotype and mtDNA-PCR amplification products were different from the common species of root knot nematodes． Primers 18S
and 28S were used to amplify the rDNA-ITS region of M． enterolobii and population 4HBJ were cloned，sequenced and compared．
We found about 88% homology between M． enterolobii and M． incognita，M． javanica and M． arenaria，respectively． 【Conclusion
and significance】M． enterolobii was accurately identified，and its presence on crops in Hainan Island was firstly proven． The mor-
phological and molecular characteristics of M． enterolobii were clarified，and the molecular phylogenetic relationship between M． en-
terolobii and three other common species of Meloidogyne was explained． The research results had important value for the future study
of M． enterolobii and disease control．
Key words:Meloidogyne enterolobii;identification;rDNA-ITS
生物安全学报 2012，21(1) :79 － 84
JOURNAL OF BIOSAFETY http:∥www． jbscn． org
根结线虫 Meloidogyne spp．是一类在经济上极为
重要的植物专性寄生线虫，广泛分布于世界各地，在
35°S与 35°N之间的地区分布最多(汪来发等，2001)。
目前已报道有 90多个种，但 Karssen et al．(1999)认为
仅 81个为有效种。根结线虫可寄生 2000 多种植物，
是普遍且重要的农作物病原线虫，一般造成农作物减
产 10% ～20%，严重的达 75%以上。
海南岛是我国唯一的热带陆海海域省份，气候
条件优越，一年四季均适合农作物的生长。随着热
带现代农业的产业化发展，农作物复种指数不断提
高，根结线虫病发生与危害日趋严重，给农作物的
产量和品质造成较大影响，已成为制约热带特色现
代农业可持续发展的主要障碍因子。
在根结线虫的形态学分类中，会阴花纹一直被
认为最具有应用价值(赵洪海，1999)。但由于一些
种类个体间会阴花纹变异较大，如果仅凭此特征作
为鉴定依据，可能导致鉴定误差(卓侃等，2008)。
基于根结线虫同工酶特别是酯酶和苹果酸脱氢酶
谱型的稳定性，将其应用于根结线虫分类鉴定已越
来越受到植物线虫学者的重视和关注。近年来，分
子生物学技术作为一种辅助手段也广泛应用于根
结线虫的分类鉴定中。Powers et al．(1993)用 PCR
技术研究了南方根结线虫 M． incongnita Kofoid et
White等 8 种根结线虫的线粒体 DNA(mtDNA) ，得
到了不同大小的扩增片段，一些不能区分的片段，
则通过进一步酶切鉴定。ITS(intemal transeribed
spacer region)是一个通用的遗传标记，被广泛应用
于构建系统发育树、预测种群结构、评估种群进化
过程，以及确定分类地位等方面。廖金铃(2001)对
根结线虫核糖体 DNA的 ITS区进行研究，通过分析
荧光 AFLP片段和对 18S DNA、ITS 区、26S DNA 进
行扩增、克隆与测序，成功地鉴定出花生根结线虫
M． arenaria (Neal)Chitwood、南方根结线虫、瓜哇根
结线虫 M． javanica Treub和最近描述的一个新种番
禺根结线虫 M． panyuensis Liao。
象耳豆根结线虫是一种重要的植物病原线虫，
现已广泛分布于世界四大洲的热带亚热带地区，欧
洲及地中海植物保护组织(EPPO)已将其列入检疫
名单。我国当前仅在海南省和广东省发现该虫(卓
侃等，2008) ，且国内关于象耳豆根结线虫的报道也
较少。据此，笔者试图运用形态学、酯酶表型和分
子生物学方法对海南岛象耳豆根结线虫进行全面
而准确的鉴定，并对其分子特征加以分析，旨在为
今后开展进一步研究提供理论依据。
1 材料与方法
1．1 供试虫源
供试病原根结线虫采集于海南岛各主要农作
物主产区，分别将单卵块接种于预先用消毒土培植
的感病品种番茄根上，进行活体保存，待用。
1．2 形态学鉴定
1．2．1 雌虫主要形态特征观察 观察头部、尾部特
征等，每个种群共观测 20 头。主要测计指标为体
长、最大体宽、口针长、DGO(背食道腺开口至口针
基部球的距离)、口针基部球高、口针基部球宽、中
食道球长、中食道球宽。
1．2．2 2 龄幼虫(J2)形态观察及测量 主要观察
头部和尾部特征，每个种群共观测 20 头。测计指
标除了 1．2．1 中涉及的指标外，还包括尾长、透明尾
长和 a值(体长 /最大体宽)。
1．2．3 会阴花纹的制作与观察 用挑针在体视显
微镜下解剖根结，每个种群挑取成熟雌虫 20 头移
入硬塑料板上的清水滴中，修切后剔除杂物，并用
清水清洗 3 次;然后将包含完整会阴花纹的角质膜
转移到载玻片上，加盖玻片;干燥后在显微镜下观
察会阴花纹的形态特征并拍照。
1．3 同工酶分析
运用常规聚丙烯酰胺凝胶电泳技术进行同工
酶分析。电泳分析采用北京六一仪器厂生产的
DYY-6B型电泳仪，7%分离胶和 4%浓缩胶，每孔
加入 20 头纯化培养的年轻雌虫酶提取物。酯酶染
色参照胡凯基(1988)的方法。以已鉴定的爪哇根
结线虫样本作为参照系。酯酶表型的命名按照 Es-
benshade ＆ Triantaphyllou(1985)的方法。
1．4 DNA的提取
参照万新龙等(2007)的方法稍做改进，用挑针
将单头根结线虫雌虫从根结中挑出，放入 200 μL
的 PCR管中，加入 8 μL灭菌水，并用枪头将线虫虫
体戳破，直至内含物溢出;再加入 2 μL 5 × 裂解
buffer(10 × PCR buffer与 1000 μg·mL －1蛋白酶 K，
按等体积比混合) ;将 PCR 管转移到 － 70 ℃冰箱
中，冷冻 30 min;将冷冻后的 PCR管置于 PCR仪中，
65 ℃ 1 h，95 ℃ 10 min;掌上离心机瞬时离心后，取上
清液用于 PCR扩增或置于 －20 ℃冰箱中备用。
·08· 生物安全学报 Journal of Biosafety 第 21 卷
1．5 mtDNA PCR扩增
采用引物#C2F3(5-GGTCAATGTCAGAAATTT-
GTGG-3)和 #1108(5-TACCTTTGACCAATCACGCT-
3)对根结线虫 mtDNA 的 COⅡ和 LRNA 基因间序列
进行扩增(黄伟明等，2011)。反应总体系为 25 μL，
引物各 1．0 μL，Perfectshot Ex Taq 12．5 μL(大连宝
生物) ，模板 DNA 0． 5 μL，ddH2O 10 μL。反应参
数:94 ℃预变性 4 min;94 ℃变性 1 min，55 ℃退火
1 min，72 ℃延伸 1．5 min，共 35 个循环;72 ℃延伸
10 min。
取 10 μL PCR产物在浓度为 1．5%的琼脂糖凝
胶上检测所扩增片段的大小，用凝胶成像系统观
察、拍照。
1．6 rDNA-ITS 序列扩增
采用 Vrain et al． (1992)设计的 18S 和 28S 引
物(由上海生工生物工程技术服务有限公司合成) ，
其序列分别为:5-TTGATTACGTCCCTGCCCTTT-3
和 5-TTTCACTCGCCGTTACTAAGG-3，对根结线虫
的 rDNA-ITS进行扩增。反应总体系为 25 μL，引物
各 1．0 μL，Perfectshot Ex Taq 12．5 μL(大连宝生物
工程有限公司) ，模板 DNA 0．5 μL，ddH2O 10 μL。
反应参数:94 ℃预变性 4 min;94 ℃变性 45 s，55 ℃
退火 45 s，72 ℃延伸 1 min，共 35 个循环;72 ℃延伸
10 min。扩增片段大小的检测方法与 1．5 一致。
1．7 PCR产物的克隆、测序与比对分析
对获得的 mtDNA和 ITS条带进行回收，将纯化
后的 PCR 产物与 pGEM-T Easy Vector 载体(Pro-
mega)于 4 ℃下连接 12 h以上后，采用热击法转化
到 E． coli DH5a感受态细胞中。在含有氨苄 Ampi-
cillin(100 mg·L －1)、IPTG(24 mg·L －1)和 X-gal
(20 mg·L －1)的 LB筛选平板上挑取单个白色菌落
于含有氨苄(100 mg·L －1)的液体 LB中摇菌过夜。
采用质粒提取试剂盒(OMEGA)提取重组质粒
DNA，经 PCR鉴定后，筛选出含有正确插入片段的
重组克隆进行测序(上海生工生物工程技术服务有
限公司)。采用 MEGA软件包中的 Neighbor-Joining
聚类分析法对所测定的序列进行比对分析。
2 结果与分析
2．1 形态学鉴定
2．1．1 观测值 通过显微镜观察，对采自海南岛的
10 个纯化种群进行初步的会阴花纹观察和形态学
测量、比对。雌虫呈梨形或球形，无后端突;头区和
颈区分界不明显，唇盘圆盘状;口针细，略向背面弯
曲;基部球粗大。J2 线形，头区与虫体有明显的分
界线。初步鉴定为象耳豆根结线虫。详细测量数
据见表 1。
2．1．2 会阴花纹特征 10 个根结线虫种群会阴花
纹的主要特征较一致，主要表现在整体呈卵圆形到
椭圆形，背弓较高，线纹较细、由平滑到波浪状，尾
尖区环纹不规则，侧线不明显(图 1)。与刘昊等
(2005)描述的象耳豆根结线虫会阴花纹形态一致。
2．2 同工酶鉴定
对各种群年轻雌虫的酯酶进行电泳分析，并参照
Esbenshade ＆ Triantaphyllou(1985)的方法分类，发现
10个种群(表 2)的酯酶谱型均为 VS1-S1型，其中 1SG
和 4HBJ种群的酯酶图谱见图 2。结合形态学结果，进
一步确认 10个根结线虫种群均为象耳豆根结线虫。
表 1 象耳豆根结线虫的形态学测量数据
Table 1 Measure data for morphology of M． enterolobii
指标 Index 雌虫 Female 2 龄幼虫 J2
体长 Body length /μm 730．0(555 ～ 990) 422．5(397 ～ 433)
最大体宽 Max body width /μm 648．5(405 ～ 716) 15．8(14．5 ～ 16．5)
口针长 Stylet length /μm 15．0(9．3 ～ 13．4) 11．8(10．7 ～ 13．4)
DGO 5．0(4．1 ～ 5．6) 3．7(2．9 ～ 4．8)
基部球高 Basal knob height /μm 2．4(1．6 ～ 2．9) 1．6(1．4 ～ 1．8)
基部球宽 Basal knob width /μm 4．8(3．9 ～ 5．6) 2．8(2．2 ～ 3．5)
中食道球长 Median bulb length /μm 41．7(33．8 ～ 52．3) 13．0(12．2 ～ 13．7)
中食道球宽 Median bulb width /μm 39．3(27．0 ～ 49．5) 8．8(8．4 ～ 9．4)
尾长 Tail length /μm 53．1(43．5 ～ 59．5)
透明尾长 Clear tail length /μm 16．0(13．5 ～ 21．2)
2 龄幼虫 a值 J2 a 26．8(24．6 ～ 29．7)
·18·第 1 期 符美英等:海南岛象耳豆根结线虫的种类鉴定及其 rDNA-ITS序列分析
图 1 象耳豆根结线虫会阴花纹
Fig． 1 Perineal patterns of M． enterolobii
表 2 象耳豆根结线虫 10 个种群的酯酶谱型
Table 2 Phenotypes of esterases for 10 different populations of M． enterolobii
种群编号
Population 寄主 Host 采集地 Collection site
酯酶谱型
Esterase phenotype
1SG 丝瓜 Luffa cylindrica 定安定城 Dingcheng，Dingan VS1-S1
2LJ 辣椒 Capsicum annuum 海口永发 Yongfa，Haikou VS1-S1
3PSL 番石榴 Psidium guajava 琼海塔洋 Tayang，Qionghai VS1-S1
4HBJ 海巴戟 Morinda officinalis 儋州铺仔 Puzai，Danzhou VS1-S1
5CX 沉香 Aquilaria agallocha 文昌冯坡 Fengpo，Wenchang VS1-S1
6DX 丁香 Syzygium aromaticum 陵水南林 Nanlin，Lingshui VS1-S1
7HLG 葫芦瓜 Lagenaria sieeraria 陵水岭门 Lingmen，Lingshui VS1-S1
8KG 苦瓜 Momordica charantia 东方新龙 Xinlong，Dongfang VS1-S1
9NG 南瓜 Cucurbita pepo 文昌龙马 Longma，Wenchang VS1-S1
10HG 黄瓜 Cucumis sativus 保亭新政 Xinzheng，Baoting VS1-S1
图 2 象耳豆根结线虫酯酶电泳图
Fig． 2 Phenotypes of esterases for M． enterolobii
in comparison with M． javanica．
1:1SG;2:4HBJ;3、4:对照、爪哇根结线虫。
1:1SG;2:4HBJ;3，4:Comparison，M． javanica．
2．3 mtDNA-PCR扩增结果
用引物#C2F3 和#1108 对表 1 中 10 个根结线
虫种群 mtDNA的 COⅡ和 LRNA基因间序列进行扩
增，均可获得 700 bp的条带(图 3)。这与有关文献
报道的象耳豆根结线虫一致。
2．4 rDNA-ITS-PCR扩增结果
用引物 18S 和 28S 扩增 rDNA 的 ITS 区序列，
10 个根结线虫种群的 ITS 片段均为 750 bp 左右
(图 4)。
2．5 序列测定与分析
对 4HBJ种群的 mtDNA的 COⅡ和 LRNA基因间
序列和 rDNA-ITS区序列分别进行克隆与测序，得到
大小为 705 和 765 bp 的片段，将测序结果与 Gen-
Bank中已有的 DNA序列进行同源性比较。发现与
4HBJ种群 mtDNA 的 COⅡ和 LRNA 基因间序列同源
性最高的是象耳豆根结线虫(GQ870255． 1) ，达
100%。比对结果进一步证明 4HBJ种群为象耳豆根
结线虫。与 4HBJ种群的 rDNA-ITS区序列同源性最
高的也是象耳豆根结线虫(JF309153．1) ，为 98%;而
与南方根结线虫、爪哇根结线虫、花生根结线虫的同
源性仅为 88%左右(图 5)。
·28· 生物安全学报 Journal of Biosafety 第 21 卷
图 3 10 个根结线虫种群 mtDNA的 COⅡ和 LRNA基因间序列 PCR扩增结果
Fig． 3 PCR amplified mtDNA between COⅡ and LRNA for 10 populations of root-knot nematodes
M:标准 DNA分子质量;1 ～ 10:10 个根结线虫种群。
M:DNA Marker;1 ～ 10:10 populations of root-knot nematodes．
图 4 10 个根结线虫种群 rDNA-ITS区序列 PCR扩增结果
Fig． 4 PCR amplified results of rDNA-ITS for 10 populations of root-knot nematodes
M:标准 DNA分子质量;CK:空白对照;1 ～ 10:10 个根结线虫种群。
M:DNA Marker;CK:Comparison;1 ～ 10:10 populations of root-knot nematodes．
图 5 4HBJ种群 rDNA-ITS区序列的聚类分析
Fig． 5 The clustering analysis of rDNA-ITS of 4HBJ population
3 讨论
本研究运用形态学、同工酶电泳和 mtDNA-
PCR 技术相结合的方法，准确鉴定出海南岛农作物
上的象耳豆根结线虫。杨宝君(1983)于海南省儋
州市野生象耳豆树上发现象耳豆根结线虫并鉴定
为新种。本研究首次于海南岛栽培的葫芦科蔬菜
(苦瓜、丝瓜、南瓜、黄瓜、葫芦瓜)、辣椒和南药植物
(海巴戟、沉香、丁香)上发现该线虫。
·38·第 1 期 符美英等:海南岛象耳豆根结线虫的种类鉴定及其 rDNA-ITS序列分析
4HBJ 种群 mtDNA 的 COⅡ和 LRNA 基因间序
列与 Genbank 上 公 布 的 象 耳 豆 根 结 线 虫
(GQ870255．1)的同源性高达 100%，可以确定该种
群为象耳豆根结线虫。
常见根结线虫种类如南方根结线虫、爪哇根结
线虫和花生根结线虫的 rDNA-ITS 区差异很小，有
报道认为这一分子特征不能用于常见根结线虫的
种类鉴定。本研究发现，4HBJ 种群的 rDNA-ITS 区
序列与象耳豆根结线虫(JF309153． 1)的同源性高
达 98%，而与南方根结线虫、爪哇根结线虫和花生
根结线虫的同源性仅为 88%左右。这表明象耳豆
根结线虫 rDNA-ITS区序列测定比对可作为其鉴定
的 1 种方法，也阐明了象耳豆根结线虫与其他常见
根结线虫种类的遗传距离相对较远，对于进一步开
展象耳豆根结线虫研究具有重要参考价值。
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(责任编辑:彭露)
·48· 生物安全学报 Journal of Biosafety 第 21 卷