全 文 ：散尾葵又名黄椰子， 属于棕榈科(Palmae)、 散
尾葵属(Chrysalidocarpus)。 原产于马达加斯加， 树
形高大， 丛生常绿， 适合于多种场合摆放， 作为热
带植物， 散尾葵因其具有株形优美、 水分蒸发量
大、 对室内有害气体净化效果好等优点， 近年来被
作为一种室内常绿观叶植物和室内有害气体净化植
物， 广泛应用于宾馆、 酒店、 会议室、 客厅等室内
场所， 装饰、 美化、 净化着人们的生活环境[1]。 散
尾葵植株上主要发生的病害有： 叶斑病[Pestalo-
tiopsis palmarum(Cooke)Steyaert][2]、 茎点霉叶斑病
(Phomo heteronema Sacc.)[3]、 炭疽病(Colletotrichum
gloeosporioides (Penz.)Sacc.)[3]、 拟茎点霉褐斑病
(Phomopsis rhapidis Gonzalez Fragoso.)[3]， 这些病害
严重影响了散尾葵的生长以及作为观赏植株的美观
性。 其中， 散尾葵叶斑病是从叶缘、 叶尖侵入， 病
斑初期呈黄褐色小点， 逐渐扩展成椭圆形或不规则
形， 病斑中部暗色或灰白色， 边缘有深色线条围
绕， 后期在病部出现散生的椭圆形小点， 受害严重
的叶片干枯卷缩。
笔者在海口市琼山区周边地区散尾葵植株上发
现一种为害散尾葵叶部的病害， 经初步调查其发病
率和危害性非常高， 严重影响了散尾葵的生长以及
散尾葵拟盘多毛孢叶斑病菌的鉴定①
李建宏② 谢昌平③ 王延丽 文衍堂
(海南大学环境与植物保护学院 海南海口 570228)
摘 要 采集田间自然发病典型的散尾葵叶部， 按照柯赫氏法则获得致病菌株， 通过病原菌形态观察以及核糖
体 DNA-ITS序列分析 ， 结果表明 ， 散尾葵叶斑病的病原菌为小孢拟盘多毛孢[Pestalotiopsis microspora (Speg.)
Satista&Peresapud Batista]。
关键词 散尾葵 ； 叶斑病 ； 培养性状和形态学 ； rDNA-ITS； 序列分析
分类号 S682.36
Identification of Pathogen Causing Leaf Spot of Chrysaliclocarpus lutescens
Li Jianhong Xie Changping Wang Yanli Wen Yantang
(College of Environmental and Plant Protection, Hainan University, Haikou, Hainan 570228, China)
Abstract Chrysaliclocarpus lutescens leaf spot is a Chrysaliclocarpus lutescenss disease which pathogenic
fungi infected the leaf margin or tip. In the early days, the spots are brown dots, gradually expanding into
oval or irregularly-shaped, dark or grey in the middle of lesion, dark lines around the edge. Late dispersed
oval dots. This disease can cause the whole plant leaf wilted and crispated. This disease seriously affects
the normal growth of Chrysaliclocarpus lutescens. The pathogenic isolate was obtained according to the
Kochs postulate. Through observing the pathogenicity, the hyphal form, the sequence of ribosomal
DNA-ITS, and the morphological characteristics such as size, colour and so on. The pathogen was
identified as Pestalotiopsis microspora (Speg.) Satista & Peresapud Batista.
Keywords Chrysaliclocarpus lutescens ; leaf-spot disease ; cultivating traits and morphology ; rDNA-ITS
; sequence analysis
① 基金项目： 海南省科技基金项目(No.Rnd0524)。
收稿日期： 2012-11-21； 责任编辑/赵军明； 编辑部 E-mail： rdnk@163.com。
② 李建宏(1989～)， 男， 本科， 主要研究方向为植物病理学。
③ 通讯作者： 谢昌平(1967～)， 男， 硕士， 副教授。 主要研究方向为植物病理学； E-mail： xiechangping002@sina.com。
Vol．33, No．2
2013年2月 热 带 农 业 科 学
CHINESE JOURNAL OF TROPICAL AGRICULTURE
第33卷第2期
Feb． 2013
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李建宏 等 散尾葵拟盘多毛孢叶斑病菌的鉴定
美观， 严重时造成大量植株枯死， 给散尾葵造成极
大的影响。 为了做好该病害的防治工作， 有必要对
散尾葵叶斑病的病原菌做进一步的鉴定。
1 材料与方法
1. 1 材料
散尾葵拟盘多毛孢叶斑病病原菌采自海口市琼
山区周边地区发病典型的散尾葵植株上。
1. 2 方法
1. 2. 1 菌种的分离与纯化
采用常规组织分离法分离[4]。 采集田间自然发
病典型的散尾葵叶部， 剪取病健交界处的叶片组织
约为 5 mm×5 mm， 用 70%乙醇(V/V)消毒 5 s， 用
0.1%HgCl2(g/V)表面消毒30s； 灭菌水冲洗3次，
无菌操作接种 PDA培养基上， 培养 4d。 采用琼脂
平板稀释纯化法进行纯化[5]。
1. 2. 2 菌种的致病性测定
用大头针将叶部刺伤后， 将分离纯化的菌种用
打孔器打成直径约为 5.0mm的菌饼， 并将有菌丝
的一面贴在伤口上， 重复 3次， 每个重复 10个处
理。 同时， 设有伤和无伤接种作对照(有伤和无伤各10
个处理)， 用与菌饼同样大小的琼脂块贴于伤口和无
伤口处， 表面覆盖已灭菌的吸水纸， 保湿培养7d，
观察并记录发病情况。
1. 2. 3 病原菌菌落及形态观察
将纯化的菌种接种在 PDA培养基上培养 5 d
后， 观察菌落的培养性状， 包括菌落的颜色、 表面
形状、 产孢类型以及气生菌丝是否丰盛等。
1. 2. 4 病原菌 rDNA-ITS序列的分子鉴定
(1)病原菌基因组总DNA的提取
采用CTAB法提取DNA[6]
(2)病原菌rDNA–ITS序列扩增
设计通用引物[7]： ITS1： 5′-TCCGTAGGTGAAC-
CTGCGC-3′， ITS4： 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′，
进行 PCR扩增 。 反应体系(25μL)： ddH2O 18μL、
10×Buffer2.5μL、 dNTP(2.5mmol/L)1μL、 ITS1
(10 pmol/L)1μL、 ITS4(10pmol/L)1μL、 Taq 酶
(2.5U/μL)0.5μL、 模板 DNA 1μL。 反应程序 ：
94℃ 5 min； 94℃ 30 s， 60℃ 1 min， 72℃ 1 min，
35个循环； 72℃ 10min。 4℃保存。 PCR仪盖温：
99℃。 反应完成后进行琼脂糖凝胶电泳检测。
(3)目的片段的测序与序列分析
克隆菌液封口寄至北京六合华大基因科技股份
有限公司进行序列测定 。 并将已测定的序列在
NCBI上进行BLAST比对， 并进行同源性分析。
2 结果与分析
2. 1 田间症状
该病主要危害植株叶片。 发病初期叶片上出现
褪绿色小点， 病斑逐渐扩大为椭圆形或不规则形， 中
央为细小的黑褐色斑， 周缘为褪绿色水渍状。 随后中
央黑褐色部分逐步扩大直至占据周缘褪绿色水渍状
斑， 最终形成中央黑褐色， 周缘有或无明显黄色晕圈
的病斑， 病斑散生椭圆形的小黑点(图1-a， 1-b)。
2. 2 致病性测定
接种 7d后观察， 针刺法接种的叶片可见明显
的发病症状， 发病率为100%(30/30)， 所产生病斑
的症状与田间症状相似。 再从叶片的发病部位分离
到与接种菌种菌落生长性状和分生孢子形态相似的
病原菌 ， 而对照采用有伤和无伤接种均不发病
(0/10， 0/10)。 符合柯赫氏法则。
2. 3 菌落形态特征
PDA培养基上， 菌落白色絮状。 分生孢子堆墨
汁状， 排列松散。 菌落背面颜色浅黄色， 有明显的
轮纹(图1-c)。 分生孢子长梭形， 有的稍微弯曲， 4
隔 5细胞 ， 分生孢子大小 18.77～22.77 (20.80)
μm×5.44～6.85(6.10)μm， 中间3个细胞异色， 上
二色胞茶褐色， 第三色胞颜色略浅， 淡褐色， 色胞
长12.07～14.95(13.66)μm。 顶胞和尾胞均为圆锥
形， 无色透明。 顶胞上着生无色附属丝， 2～3根，
顶端附属丝长 14.56～22.82(18.80)μm， 尾胞上
着生一根基部附属丝 ， 中生 ， 长 3.25～ .53
(4.50)μm(图1-d)。
2. 4 分子学鉴定
该病原菌经 PCR扩增出1条500～750bp的清
晰条带(图 2)。 通过克隆测序 ， 再用 NCBI进行
Blastn比对 ， 结果显示 ， rDNA-ITS序列长度为
550bp。 病原菌目的片段序列与数据库中小孢拟盘
多毛孢菌的 rDNA-ITS核苷酸序列具有极大的相似
性， 同源性高达 99%。 根据病原菌 rDNA-ITS序列
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2013年2月 第33卷第2期热带农业科学
的测定结果， 再结合病原菌的形态学[8-12]， 最终确
定散尾葵叶斑病的病原为小孢拟盘多毛孢菌
[Pestalotiopsis microspora (Speg.)Satista &Peresapud
Batista]。
3 讨论
拟盘多毛孢是一类广泛存在的真菌， 在已报道
的220多种中， 大多数都是植物病原拟盘多毛孢[13]。
拟盘多毛孢属所致的病害在棕榈科植物上的寄主：
椰子、 散尾葵、 酒瓶椰子、 棍棒椰子、 加拿利海枣、
假槟榔、 桄榔和大王棕等[10,13-17]。
对拟盘多毛孢种的确定， 传统的分种主要根据
培养性状、 分生孢子的形态、 大小、 有色胞的长度
和颜色、 顶端附属丝和尾端附属丝的长度来确定新
种。 郭桢等报道[2]散尾葵叶斑病的病原为掌状拟盘
多毛孢菌(Pestalotiopsis palmarum Cooke.)， 与笔者
所鉴定的种不相同， 笔者认为可能采集病害的标本
不同或仅采用形态学等鉴定所致。 由于根据形态学
鉴定种间的形态尺度差别微小， 许多种的形态尺度
相互重叠， 不同的人可能将同一个菌株鉴定成不同
种。 因此， 笔者采用形态学鉴定结合 rDNA-ITS序
列测定， 提高了鉴定的准确性。 由于真菌DNA的碱
基组成具有遗传稳定,不易受环境影响， 而且在生
活史任何阶段均可获得[18]， 其中 rDNA上的 ITS序
列应用最为广泛， 不仅rDNA-ITS序列进化速度快，
表现出广泛的序列多态性， 其在不同的分类水平上
都具有各自的特异分子标记， 不仅能够正确定义生
物在种水平上的概念， 而且能够鉴定近缘物种间的
亲缘关系， 已成为菌物在种和亚种水平上分类鉴定
的有效手段[19-26]。 由于拟盘多毛孢的许多种极为相
似， 因此建立拟盘多毛孢菌的ITS序列数据库是十
分必要的。 根据形态特征和分子系统学特征结合界
定拟盘多毛孢菌的种是比较科学的， 也是当今真菌
分类发展的趋势。
致 谢 在试验过程中， 广西大学韦继光教授， 中国热带
农业科学院环境与植物保护研究所黄贵修研究员， 谨表衷
心感谢！
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(下转第70页)
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普勒雷达和多个物理量的计算等综合分析了 2010
年 10月海南岛一次秋季特大暴雨过程， 得出如下
结论：
(1)海南岛东半部地区长时间的强降水过程，
是由于充裕的水汽输送， 水汽通量在东半部地区一
直存在大的辐合中心， 持续的水汽输送， 低层强烈
的辐合以及降水回波在原地发展及消亡， 导致长时
间的 “列车效应” 使得降水持续。
(2)秋季冷空气入侵到热带低压外围， 冷暖气
流交汇， 有利于对流运动的发展及潜能的积累， 为
暴雨的产生提供有力的动力条件。
(3)假相当位温， 垂直上升速度等物理量对暴
雨的预报有较好的指示意义。
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