全 文 ：超声辅助提取荚果蕨总黄酮的响应面优化
施伟梅1* ，夏侯国论2，卢 凯1
(1．赣南医学院药学院，江西 赣州 341000;2． 广州城市职业学院科技中心，广东 广州 510405)
摘 要:利用响应面法优化超声辅助提取荚果蕨总黄酮工艺。在单因素试验的基础上，利
用 Box-Behnken实验设计，考察了超声温度、乙醇浓度、液料比及超声时间 4 个因素及因素间交
互作用对总黄酮提取率的影响，建立了回归模型。结果表明，超声辅助提取荚果蕨总黄酮的最
佳工艺为:超声温度 65℃、乙醇浓度 60%、液料比 21 ∶1、超声时间 35min，在此条件下，总黄酮的
提取率为 1．256%，与预测值相对误差为 0．641%，验证了该模型的有效性，该工艺与传统提取方
法相比，提取率提高了 18．49%，是一种高效快速提取荚果蕨总黄酮的方法。
关键词:荚果蕨;总黄酮;提取;响应面分析
中图分类号:Ｒ284．2 文献标识码:A 文章编号:1674－0408(2016)04－0030－07
收稿日期:2016－09－10
基金项目:江西省教育厅科学技术研究项目(150949);赣南医学院科研课题(YB201429)
作者简介:施伟梅，女，赣南医学院药学院讲师。
荚果蕨(Matteuccia struthiopteris(L．)Todaro)
又名黄瓜香、野鸡膀子，是球子蕨科荚果蕨属多年
生草本植物［1-2］。荚果蕨，具有清热解毒、杀虫、止
血的功效，是常用中药贯众［3］的主流品种之一;其
幼叶清香可口，质地脆嫩，是营养价值极高的山野
菜，更是难得的药、食同源植物。研究表明，荚果
蕨富含蛋白质、多糖及多种微量元素，还有黄酮、
蜕皮甾酮等活性成分［4-6］。黄酮类化合物是一类
拥有多样生物活性的植物次生代谢产物，具有抗
衰老、抗癌、抑菌、保健等功效［7-8］，迄今为止，对荚
果蕨黄酮的研究报道较少，主要集中在对黄酮成
分［9］的研究上，而对荚果蕨黄酮的提取方法还没
有系统深入的研究报道。近年来，超声波辅助提
取技术由于具有能耗低、效率高、不破坏有效成分
的特点，被广泛应用于天然产物活性成分的分离
提取［10-11］。本实验采用超声辅助提取法对荚果蕨
总黄酮的提取工艺进行研究，并以总黄酮提取率
为指标，采用响应面统计法优化其超声提取工艺，
旨在为进一步研究开发荚果蕨提供依据。
一、实验部分
(一)仪器与试剂
Lambda 35紫外可见分光光度，美国珀金埃尔
默公司;KQ3200DB 型数控超声波清洗器，昆山市
超声仪器有限公司;DHG-9070 电热鼓风干燥箱，
上海一恒科学仪器有限公司;TDL-50B 台式离心
机，上海安亭科学仪器厂;Q-250B 高速万能粉碎
机:上海冰都电器有限公司;AB135-S 电子分析天
平，上海树信仪表有限公司。
荚果蕨:采于四川省南充西山，在 50℃烘箱中
烘干至恒重后粉碎，过 60目筛，置于干燥皿中密封
保存备用;芦丁对照品，中国药品生物制品检定
所;乙醇，分析纯，使用时，配制成不同体积浓度的
乙醇溶液;其它试剂均为分析纯。
(二)试验方法
1．总黄酮标准曲线的建立
以芦丁为标准品，采用 NaNO2-AL(NO3)3 比色
法［12］，在波长 510nm处测定吸光度，以吸光度 A 为
纵坐标，芦丁质量浓度 X为横坐标，绘制标准曲线，
03
第 10卷第 4期
2016年1 2月
广 州 城 市 职 业 学 院 学 报
Journal of Guangzhou City Polytechnic
Vol ．10 NO．4
Dec ． 2 0 1 6
并将实验结果进行线性回归，得回归方程为 A =
10．89X－0．0029，相关系数 Ｒ2 = 0．9993。
将从荚果蕨中提取的待测液用上述方法进行
测定，所得的吸光度代入回归方程中得到总黄酮
质量浓度，按下式计算总黄酮的提取率。
总黄酮提取率%=
b·n·V
W
×100%
式中:b为荚果蕨提取液总黄酮的质量浓度，
mg /mL;n 为提取液稀释倍数;V 为提取液体积，
mL;W为荚果蕨粉末的质量，mg。
2．荚果蕨总黄酮的乙醇回流提取
荚果蕨粉末 2．000g→乙醚脱脂 8h→乙醇水浴
提取→趁热抽滤→定容→提取液→测吸光度 A，计
算总黄酮提取率。
3．荚果蕨总黄酮的超声提取
精确称取一定量的荚果蕨粉末，加入一定浓
度乙醇，按照设定的程序进行超声辅助提取荚果
蕨中的总黄酮，抽滤，滤液定容，测吸光度 A，计算
总黄酮提取率。
(三)试验设计
1．单因素试验
采用单因素试验研究了超声温度、乙醇浓度、
液料比和超声时间对荚果蕨中总黄酮提取效果的
影响。
2．响应面试验设计
以单因素试验为基础，采用 Design-Expert
8．0．6软件数据分析，根据 Box-Behnken 建立数学
模型，以超声温度(X1)、乙醇浓度(X2)、液料比
(X3)和超声时间(X4)为自变量，+1、0、-1 代表自
变量的高、中、低水平，荚果蕨总黄酮提取率(Y)为
指标，进行响应曲面分析，因素水平设计见表 1。
表 1 响应曲面因素与水平表
因素
水平
－1 0 +1
超声温度 /℃ X1 60 65 70
乙醇浓度 /% X2 55 60 65
液料比 / mL·g－1 X3 15:1 20:1 25:1
超声时间 /min X4 30 35 40
3．验证与比较试验
通过软件分析获得最佳提取工艺条件后，按
照优化条件进行提取测定，比较实验结果和方程
计算值的差异。并将该实验结果与传统乙醇提取
结果进行对比，探讨 2种方法对荚果蕨总黄酮提取
效果的影响。
二、结果与分析
(一)单因素试验
1．超声温度对总黄酮提取率的影响
图 1 超声温度对总黄酮提取率的影响
固定乙醇浓度为 70%、液料比为 20 ∶1、超声时
间为 30min，考察了不同超声温度对总黄酮提取率
的影响，结果如图 1所示。从图 1可看出，随着温度
升高，总黄酮提取率不断升高，65℃时达到最大，继
续升高温度，提取率反而下降。这是因为随着温度
升高，增加了溶液中总黄酮的溶解性，超出 65℃之
后，由于温度过高，会导致黄酮类物质被氧化而使得
提取率降低，因此，最佳的温度选择为 65℃。
2．乙醇浓度对总黄酮提取率的影响
固定超声温度为 65℃、液料比为 20 ∶1、超声时
间为 30min，考察了不同乙醇浓度对总黄酮提取率
的影响，结果如图 2 所示。从图 2 可看出，荚果蕨
总黄酮提取率随着乙醇浓度的增加，呈先增加后
降低的趋势，乙醇浓度为 60%时，提取率达到最高。
这可能是因为随着乙醇浓度的增加，溶剂的极性减
小，增大了黄酮类物质的溶解性;当乙醇浓度超过
60%后，荚果蕨中一些极性较弱的成分不断溶出，增
加了与黄酮类物质的溶出竞争［13］，导致总黄酮提取
率下降。因此，最佳乙醇浓度选定为 60%。
固定超声温度为 65℃、乙醇浓度为 60%、超声
时间为 30min，考察了不同液料比对总黄酮提取率
的影响，结果如图 3 所示。从图 3 可看出，随着液
料比的增加，荚果蕨总黄酮的提取率逐渐增加，当
13
施伟梅，等:超声辅助提取荚果蕨总黄酮的响应面优化
液料比为 20 ∶1时，总黄酮提取率达到最大，继续增
大液料比，反而导致提取率降低。这是因为随着液
料比的增大，溶剂与荚果蕨的接触面积增加，荚果
蕨颗粒内外的浓度差增大，增加了传质推动力，使
总黄酮更易溶出与扩散;当液料比超过20 ∶1时，溶
剂量过大，增加了浓缩过程中总黄酮的损失［14］，造
成了总黄酮提取率的下降，因此，最佳的液料比选
择为20 ∶1。
图 2 乙醇浓度对总黄酮提取率的影响
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图 3 液料比对总黄酮提取率的影响
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图 4 超声时间对总黄酮提取率的影响
3．超声时间对总黄酮提取率的影响
固定超声温度为 65℃、乙醇浓度为 60%、液料
比为 20:1，考察不同超声时间对总黄酮提取率的
影响，结果如图 4 所示。从图 4 可看出，随着超声
时间的延长，总黄酮的提取率增大，当超声时间为
35min时，总黄酮提取率达到最大值，继续增加超
声时间，总黄酮提取率反而有所下降。这是因为
超声时间过长，容易使黄酮类物质氧化而破坏。
另外，超声时间过长，溶出的杂质增加，将抑制黄
酮类物质的溶出，而最终导致总黄酮提取率的下
降。因此，最佳超声时间选择为 35min。
(二)响应面试验结果
1．响应面试验结果及方差分析
根据 Box-Behnken的中心组合实验设计原理，
选取超声温度(X1)、乙醇浓度(X2)、液料比(X3)
和超声时间(X4)四个因素进行优化实验，实验因
素和水平设计表见表 2，响应面分析方案见表 3。
表 2 响应曲面试验以及响应值
试验号
超声温
度 /℃
乙醇浓
度 /%
液料比 /
mL·g－1
超声时
间 /℃
黄酮提取
率 /%
1 －1 －1 0 0 1．077
2 1 －1 0 0 1．099
3 －1 1 0 0 1．052
4 1 1 0 0 1．119
5 0 0 －1 －1 1．069
6 0 0 1 －1 1．106
7 0 0 －1 1 1．116
8 0 0 1 1 1．139
9 －1 0 0 －1 0．99
10 1 0 0 －1 0．992
11 －1 0 0 1 0．977
12 1 0 0 1 1．072
13 0 －1 －1 0 1．143
14 0 1 －1 0 1．136
15 0 －1 1 0 1．184
16 0 1 1 0 1．18
17 －1 0 －1 0 1．111
18 1 0 －1 0 1．119
19 －1 0 1 0 1．117
20 1 0 1 0 1．136
21 0 －1 0 －1 1．114
22 0 1 0 －1 1．073
23 0 －1 0 1 1．073
24 0 1 0 1 1．136
25 0 0 0 0 1．25
26 0 0 0 0 1．257
27 0 0 0 0 1．255
28 0 0 0 0 1．224
29 0 0 0 0 1．24
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广州城市职业学院学报 2016年第 4期
表 3 响应曲面方差分析表
方差来源 离差平方和 自由度 均方 F值 P值 显著度
模型 0．15 14 0．011 29．50 ＜ 0．000 1 ＊＊＊
X1－X1 3．781×10－3 1 3．781×10－3 10．18 0．006 5 ＊＊
X2－X2 3．000×10－6 1 3．000×10－6 8．078×10－3 0．929 7
X3－X3 2．352×10－3 1 2．352×10－3 6．33 0．024 7 *
X4－X4 2．380×10－3 1 2．380×10－3 6．41 0．024 0 *
X1X2 5．063×10－4 1 5．063×10－4 1．36 0．262 5
X1X3 3．025×10－5 1 3．025×10－5 0．081 0．779 5
X1X4 2．162×10－3 1 2．162×10－3 5．82 0．030 1 *
X2X3 2．250×10－6 1 2．250×10－6 6．058×10－3 0．939 1
X2X4 2．704×10－3 1 2．704×10－3 7．28 0．017 3 *
X3X4 4．900×10－5 1 4．900×10－5 0．13 0．7219
X1
2 0．081 1 0．081 219．31 ＜0．000 1 ＊＊＊
X2
2 0．014 1 0．014 37．66 ＜0．000 1 ＊＊＊
X3
2 4．114×10－3 1 4．114×10－3 11．08 0．005 0 ＊＊
X4
2 0．082 1 0．082 221．27 ＜0．000 1 ＊＊＊
残差 5．200×10－3 14 3．714×10－4
失拟度 4．465×10－3 10 4．465×10－4 2．43 0．203 3
绝对误差 7．348×10－4 4 1．837×10－4
总离差 0．16 28
注:* P＜0．05;＊＊P＜0．01;＊＊＊P＜0．001。
表 4 Box– Behnken 的试验设计和实验结果
响应值 相关系数 调整系数 均方根误差 变异系数
提取率(Y) 0．9672 0．9344 0．019 1．72%
从方差分析表 3可知，由试验数据所得模型失
拟度 F= 29．50，P ＜0．0001，表示该模型显著。由模
型拟合得到的回归方程为:Y = －24．55+0．52X1 +
0．16X2+0．04X3+0．20X4+4．50×10
－4X1X2 +1．10×10
－4
X1X3+9．30×10
－4X1X4 +3．00×10
－5X2X3 +1．04×10
－3
X2X4－1．40×10
－4X3X4－4．48×10
－3X1
2 －1．86×10－3X2
2
－1．01 × 10－3 X3
2 － 4． 50 × 10－3 X4
2，其方程的 Ｒ2为
0．967 2。方程中 P＜0．05 的项代表显著项，包括 X1、
X3、X4 及二次项 X1X4、X2X4、X1
2、X2
2、X3
2、X4
2，表
明各影响因素与响应值的关系并不是简单的线性
关系，各因素之间的交互作用对荚果蕨总黄酮的
提取有影响。方程的失拟度 F = 2．43，P = 0．203 3＞
0．05，表示失拟度不显著，说明该回归方程可以较
好地描述各因素与响应值之间的真实关系。由表
4可知，该模型的调整系数为 0．9344，表明荚果蕨
总黄酮提取率的实际值与预测值之间具有很好的
拟合度，可以用该模型对荚果蕨总黄酮的提取率
进行预测和分析。
2．试验因素交互作用对响应值影响的 3D分析
各试验因素及其交互作用对响应值的影响可
以通过响应面 3D 图直观反映出来，结果见图 5。
由图 5可知，并不是所有因素对荚果蕨总黄酮的提
取都有显著的影响，超声温度的影响最为显著，随
着超声温度的升高，总黄酮提取率随之增大，随后
超声温度继续增大，总黄酮提取率则明显下降，表
现为曲面较陡;超声时间的影响次之，表现为曲面
较平缓，响应值变化较小;乙醇浓度和液料比对总
黄酮提取率的影响不显著，曲面基本表现为平直
线。各具体试验因素对响应值的影响大小是不同
的，主次因素顺序为超声温度＞超声时间＞乙醇浓
度＞液料比。
3．最佳提取工艺的优化及验证
根据回归模型，利用 Design－Expert 8．0．6 软件
对实验数据进行分析，得到最优提取工艺为:超声温
度 65．46℃、乙醇浓度 60．19%、液料比为 21．39 ∶1，超
33
施伟梅，等:超声辅助提取荚果蕨总黄酮的响应面优化
声时间35．36min，荚果蕨总黄酮提取率最大预测值
为1．248%。为检验模型的可靠性，对上述最优提取
条件进行了提取试验。考虑到实际操作的便利，将
最佳工艺条件修正为:超声温度65℃、乙醇浓度
60%、液料比为21 ∶ 1，超声时间 35min。在此条件
下进行 3 次平行试验，实际提取率平均值为
1．256%，略高于 Design Expert 软件的预测值，测定
结果重现性良好，相对于预测值，误差为 0．641%，
验证了该数学模型的有效性。且该超声辅助提取
工艺与传统乙醇提取法相比，提取率提高了
18．49%，详见表 5。可见，采用响应面法优化得到
的提取条件参数可靠，得到的总黄酮提取条件具
有实际应用价值。
图 5 各因素交互作用对总黄酮得率 Y影响的响应曲面(3D)
43
广州城市职业学院学报 2016年第 4期
表 5 两种提取方法结果比较
方法
提取
温度 /℃
乙醇浓
度 /%
液料比 /
mL·g－1
提取时
间 /min
提取
率 /%
超声提取 65 60 21:1 35 1．256
热浸提取 73 74 27:1 158 1．060
三、结论
采用响应面法对超声辅助提取荚果蕨总黄酮
的工艺进行优化，建立数学模型。利用模型方程
优化出荚果蕨总黄酮的最佳提取工艺为:超声温
度 65℃、乙醇浓度 60%、液料比为 21:1，超声时间
35min。经过验证，实际提取率为 1．256%，理论值
为 1．248%，其相对误差为 0．641%，说明实际值与
预测值拟合度良好。模型响应曲面图表明影响荚
果蕨总黄酮提取率的因素依次为:超声温度＞超声
时间＞乙醇浓度＞液料比。该工艺相比于传统提取
工艺，提取率提高了 18．49%。响应面法对荚果蕨
总黄酮的提取条件优化合理可行，为提高荚果蕨
总黄酮的提取率提供了理论依据。
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(责任编辑 潘志和)
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施伟梅，等:超声辅助提取荚果蕨总黄酮的响应面优化
Optimization of Ultrasonic-assisted Extraction of Total Flavonoids from
Matteuccia struthiopteris(L．)Todaro
SHI Wei-mei1，XIAHOU Guo-lun2，LU Kai1
(1．College of Pharmacy，Gannan Medical University，Ganzhou 341000，China;
2． Science ＆ Technology Center，Guangzhou City Polytechnic，Guangzhou 510405，China)
Abstract:Ｒesponse surface methodology was used to determine optimum condition for ultrasonic-assisted extraction of total
flavonoids from Matteuccia struthiopteris(L．)Todaro． The extraction temperature，concentration of ethanol，liquid-solid ratio and
extraction time were chosen to carry out the single factor experiment． The effect of each factor and their interactions on total
flavonoids was studied according to the Box－Behnken response surface methodology，and the regression model was established． The
results showed that the optimum extraction condition was:extraction temperature 65℃，concentration of ethanol 60%，liquid-solid
ratio 21:1 and extraction time 35min，respectively． Under these conditions，the yield of total flavonoids was 1．256%． Compared to
the predictive value the relative error was 0． 641%，indicating that the regression model fitted well with the experimental data．
Moreover，the extraction yield was increased by 18．49% as compared to the traditional extraction method，stated that it could be a
rapid and efficient extraction method for flavonoids from Matteuccia struthiopteris(L．)Todaro．
Key words:Matteuccia struthiopteris(L．)Todaro;flavonoids;extraction;response surface methodology
63
广州城市职业学院学报 2016年第 4期