全 文 ：黄秀香，苏丹静，赖红芳． 超声波协同复合酶法提取半边莲中黄酮苷的工艺研究［J］． 江苏农业科学，2012，40(5) :234 － 237．
超声波协同复合酶法提取半边莲中黄酮苷的工艺研究
黄秀香，苏丹静，赖红芳
(河池学院化学与生命科学系，广西宜州 546300)
摘要:研究超声波协同复合酶法提取半边莲黄酮苷的最佳工艺条件。以乙醇水溶液为提取剂，通过单因素试验
及 L16(4
5)正交试验，考察纤维素酶用量、果胶酶用量、酶解温度、pH值、酶解时间等 5 个因素对半边莲中黄酮苷提取
的影响。结果显示，最佳提取工艺条件为:纤维素酶 26 mg，果胶酶 31 mg，提取温度 54 ℃，酶解 pH 值 5． 9，酶解时间
35 min，该法提取率高，稳定性好。
关键词:半边莲;黄酮苷;超声波;复合酶;分光光度法;正交试验
中图分类号:R284． 2 文献标志码:A 文章编号:1002 － 1302(2012)05 － 0234 － 03
收稿日期:2011 － 08 － 06
基金项目:广西教育厅科研立项项目(编号:201010LX457)。
作者简介:黄秀香(1969—) ，女，广西都安人，硕士，副教授，主要研究
方向为天然有机化学。E － mail:hxx1372@ 163． com。
通信作者:赖红芳，女，广西柳州人，硕士，副教授，主要从事天然有机
化学及分析化学研究工作。E － mail:laihongfang263@ tom． com。
半边莲(Lobelia chinensis)又名细米草、急解索、蛇舌草
等，为桔梗科植物半边莲(Lobelia chinensis Lour．)的带根全
草，具有利尿、兴奋呼吸、解蛇毒、抗溃疡等作用。半边莲全草
含生物碱，还含有黄酮苷、氨基酸、多糖［1］。黄酮类化合物广
泛存在于自然界，是多种药用植物的有效成分，具有抗菌、抗
病毒、抗氧化、抗肝脏毒性和抗抑郁等诸多活性［2］。目前对
半边莲中黄酮类成分已经有一定的研究，但关于半边莲中黄
酮苷的提取研究仍比较少。
酶法是一种早已被广泛应用于食品、饲料工业以及天然
产物中的提取方法，近年来有研究报道有人将酶法用于中药
的提取制备，并取得了一定的效果。选用适当的酶作用于药
用植物材料，如纤维素酶、果胶酶等，可以破坏细胞壁的致密
构造，从而有利于有效成分的溶出［3］。酶法进行提取的过程
中，在超声波的协同作用下，可以利用超声波产生的强烈震
动、搅拌作用以及强烈的空化效应，加速物质有效成分进入溶
剂，从而提高酶与有效提取物的充分接触，缩短提取时间，提
高提取率［4］。本试验旨在确定半边莲中黄酮苷提取的最佳
工艺参数，为进一步开发半边莲的药用价值提供试验数据。
1 试验部分
1． 1 材料与仪器
半边莲;纤维素酶(1 400 U /mg) ;果胶酶(1 000 U /mg) ;
芸香苷标准品(UV≥98%，上海源叶生物科技有限公司) ;无
水乙醇、氢氧化钠、硝酸铝、亚硝酸钠(均为分析纯)。
FZ102 型微型植物粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公
司) ;UV －2501 紫外分光光度计(日本岛津公司) ;SHB － 3 型
循环水多用真空泵(郑州杜甫仪器厂) ;HH － 6 型恒温水浴锅
(郑州杜甫仪器厂) ;AE240S型电子分析天平(扬州东方集团
有限公司) ;PHS － 3B精密 PH 计(上海精密科学仪器有限公
司) ;SB120D超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公
司) ;DGF30 /14 － 22A电热鼓风干燥箱(南京实验仪器厂)。
1． 2 试验方法
1． 2． 1 黄酮苷成分的提取 将半边莲放入电热鼓风干燥箱
中干燥 24 h，粉碎后过 20 目筛，放入干燥器中备用。准确称
取干燥的半边莲粉末 1． 00 g，放入 100 mL 的碘量瓶中，添加
一定量的纤维素酶和果胶酶，再加入 25 mL乙醇(50%)混合
均匀后，在功率为 120 W 的超声波条件下提取 20min;调节
pH值后置于一定温度的水浴锅中，水浴酶解 30 min，反应后
将提取液煮沸 2 min，使酶灭活;过滤、定容后移取一定量的提
取液，显色，再次定容后待测。
1． 2． 2 标准曲线的绘制［5］ 精确称取 10 mg芸香苷标准品，
用 50%的乙醇溶解，定容至 100 mL，制成 0． 1 mg /mL 的芸香
苷标准溶液。分别吸取标准溶液 0． 0、1． 0、2． 0、3． 0、4． 0、
5． 0 mL 于 25 mL的比色管中，分别加入 1 ～ 2 mL 50%乙醇稀
释，再分别加入 5% NaNO2 0． 3 mL，摇匀后静置 6 min;再分别
加入 10%Al(NO3)3 0． 3 mL，摇匀后静置 6 min;再分别加入
1 mol /L NaOH 2． 0 mL，用 50%乙醇定容至 10 mL，摇匀后静
置 15 min。在 510 nm处测定吸光度，以吸光度 D 为纵坐标、
芸香苷浓度 C(mg /mL)为横坐标绘制标准曲线(图 1) ，得回
归方程:y = 10． 18x + 0． 010 9，r2 = 0． 998 3，r = 0． 999 1。
1． 2． 3 黄酮苷的含量测定 精确吸取半边莲提取液 1 mL于
25 mL的比色管中，按照“1． 2． 2”的方法测其吸光度，然后代
入回归方程计算，可得样品液中黄酮苷的质量浓度，再经计算
就得其含量。半边莲中黄酮苷含量计算公式如下:
—432— 江苏农业科学 2012 年第 40 卷第 5 期
DOI:10.15889/j.issn.1002-1302.2012.05.047
X = C × V1 × V2 /M × V3
式中:X为样品中黄酮苷总含量，mg /g;C 为校准曲线中黄酮
苷的浓度，mg /mL;V1 为稀释体积，mL;V2 为样品溶液的体
积，mL;M为样品质量，g;V3 为取样体积，mL。
1． 2． 4 不同提取方法的选择 采用 4 种不同的提取方法，分
别为:(1)超声波法，提取过程为在 120 W功率的超声波条件
下提取 20 min;(2)超声波 +纤维素酶法，提取过程为在纤维
素酶 20 mg、功率 120 W的超声波条件下提取 20 min，调节 pH
值为 5，55 ℃条件下水浴酶解 20 min; (3)超声波 +果胶酶
法，提取过程为在果胶酶 20 mg、功率 120 W的超声波条件下
提取 20 min，调节 pH 值为 5，55 ℃条件下水浴酶解 20 min;
(4)超声波 +复合酶法，提取过程为在纤维素酶 20 mg、果胶
酶 20 mg、功率 120 W的超声波条件下提取 20 min，调节 pH
值为 5，在 55 ℃条件下水浴酶解 20 min。
1． 3 单因素提取工艺研究
1． 3． 1 纤维素酶用量的选择 准确称取半边莲粉 1． 0 g，纤
维素酶用量分别为 10、15、20、25、30、35 mg，加入 25 mL 乙醇
溶液，在 120 W功率的超声波条件下提取 20 min，加入缓冲剂
调节 pH值为 5，在 55 ℃条件下水浴酶解 20 min，灭酶 2 min，
显色并测其吸光度，代入回归方程求其黄酮苷含量，平行测定
3 次。
1． 3． 2 果胶酶用量的选择 准确称取半边莲粉 1． 0 g、纤维
素酶 20 mg，加入果胶酶量分别为 10、15、20、25、30、35 mg，按
照“1． 3． 1”的方法考察果胶酶用量对黄酮苷含量的影响。
1． 3． 3 酶解最适温度 准确称取半边莲粉 1． 0 g、纤维素酶
20 mg、果胶酶 25 mg，水浴温度分别设为 40、45、50、55、60、
65 ℃，按照“1． 3． 1”的方法，考察温度对黄酮苷含量的影响。
1． 3． 4 酶解最适 pH 值 准确称取半边莲粉 1． 0 g、纤维素
酶 20 mg、果胶酶 25 mg，酶解温度为 60 ℃，加入缓冲剂并分
别调节酶解 pH 值为 4． 0、4． 5、5． 0、5． 5、6． 0、6． 5，按照
“1. 3. 1”方法，考察 pH值对黄酮苷含量的影响。
1． 3． 5 酶解时间选择 准确称取半边莲粉 1． 0 g、纤维素酶
20 mg、果胶酶 25 mg，加入缓冲剂调节酶解 pH值为 5． 0，在温
度为 60 ℃，酶解时间为 10、20、30、40、50、60 min 条件下，按
照“1． 3． 1”方法，考察时间对黄酮苷含量的影响。
1． 4 正交试验与方差分析
为了确定在提取过程中各因素的影响大小，在单因素试
验结果的基础上，采用 L16(4
5)进行正交试验设计，因素水平
的设计见表 1。
表 1 半边莲黄酮苷提取正交试验因素水平
水平
因素
A:纤维素酶
用量(mg)
B:果胶酶
用量(mg)
C:酶解
温度(℃)
D:酶解
pH值
E:酶解时间
(min)
1 17 22 54 5． 0 20
2 20 25 57 5． 3 25
3 23 28 60 5． 6 30
4 26 31 63 5． 9 35
2 结果与讨论
2． 1 提取方法的选择
用“1． 2． 4”中的 4 个方法进行提取试验，所得的黄酮苷
含量分别为 2． 346、3． 639、5． 244、5． 326 mg /g，由此可知，超声
波协同复合酶(纤维素酶、果胶酶)法提取的黄酮苷含量最
高，因而选用超声波协同复合酶法作为本试验的研究方法。
2． 2 单因素试验结果
2． 2． 1 纤维素酶用量 纤维素酶用量对黄酮苷的提取试验
结果见图 2。由图 2 可以看出，纤维素酶用量为 20 mg 时，所
提取的黄酮苷含量最高，因此选择进一步优化的纤维素酶用
量为 20 mg。
2． 2． 2 果胶酶用量 果胶酶用量对黄酮苷含量影响的结果
见图 3。根据试验结果分析可知，选择进一步优化提取条件
的果胶酶用量为 25 mg。
2． 2． 3 酶解温度 酶解温度对黄酮苷含量影响的结果见图
4。根据试验结果分析，选择进一步优化提取条件的酶解温度
为 60 ℃。
2． 2． 4 酶解最适 pH 值 酶解 pH 对黄酮苷含量的影响结果
见图 5。根据试验结果进行分析，选择进一步优化提取条件
的酶解 pH值为 5． 0。
2． 2． 5 酶解时间 酶解时间对黄酮苷影响的结果见图 6，由
图 6 可知，酶解时间为 30 min 时，半边莲中的黄酮苷的提取
量不再增加;且黄酮苷的含量随着温度的上升而有所下降。
—532—黄秀香等:超声波协同复合酶法提取半边莲中黄酮苷的工艺研究
2． 3 正交试验结果
由表 2、表 3 的结果可以看出，温度对半边莲黄酮苷的提
取结果影响最大，达显著水平，pH 值、酶解时间、果胶酶用量
次之，纤维素酶用量的影响最小，即(C ＞ D ＞ E ＞ B ＞ A)。通
过正交试验和方差分析可以得出最佳的提取条件为:纤维素
酶 26 mg，果胶酶 31 mg，提取温度 54 ℃，酶解 pH值 5． 9，酶解
时间 35 min，即 A4B4C1D4E4。
表 2 半边莲黄酮苷提取正交试验结果
试验号
因素
A:纤维素酶
用量(mg)
B:果胶酶
用量(mg)
C:酶解
温度(℃)
D:酶解
pH值
E:酶解时间
(min)
黄酮苷含量
(mg /g)
1 1 1 1 1 1 5． 162
2 1 2 2 2 2 4． 736
3 1 3 3 3 3 4． 966
4 1 4 4 4 4 4． 851
5 2 1 2 3 4 4． 966
6 2 2 1 4 3 5． 342
7 2 3 4 1 2 4． 196
8 2 4 3 2 1 4． 884
9 3 1 3 4 2 5． 047
10 3 2 4 3 1 4． 213
11 3 3 1 2 4 5． 375
12 3 4 2 1 3 4． 884
13 4 1 4 2 3 4． 655
14 4 2 3 1 4 4． 802
15 4 3 2 4 1 5． 129
16 4 4 1 3 2 5． 227
k1 4． 929 4． 958 5． 277 4． 761 4． 847
k2 4． 847 4． 773 4． 929 4． 913 4． 802
k3 4． 880 4． 917 4． 925 4． 843 4． 962
k4 4． 953 4． 962 4． 479 5． 092 4． 999
R 0． 106 0． 189 0． 798 0． 331 0． 197
表 3 方差分析结果
方差来源 离差平方和 自由度 均方 F值 P
纤维素酶 0． 027 5 3 0． 009 2
果胶酶 0． 093 8 3 0． 031 3 3． 402 ＞ 0． 05
酶解温度 1． 282 5 3 0． 427 5 46． 467 ＜ 0． 05
酶解 pH值 0． 241 3 0． 080 3 8． 728 ＞ 0． 05
酶解时间 0． 104 3 0． 034 7 3． 772 ＞ 0． 05
注:F0． 05(3，3)= 9． 28;F0． 01(3，3)= 29． 46。
2． 4 验证试验
准确称取干燥的半边莲粉末 1． 0 g，在最佳条件下提取，
进行重复性试验 5 次，得待测液，分别测定其黄酮苷含量，计
算 RSD。结果如表 5，可以看出，黄酮苷的平均含量为
5． 408 mg /g，RSD为 0． 37%，说明该试验稳定。
表 4 最佳提取工艺的验证试验
样品 黄酮苷含量(mg /g) RSD(%)
1 5． 408
2 5． 440
3 5． 392
4 5． 390
5 5． 410
平均 5． 408 0． 37
2． 5 加样回收率试验
分别精确量取已知黄酮苷含量的半边莲的待测溶液 5
份，分别加入 1 mL 0． 1 mg /mL 的芸香苷标准品溶液，分别测
其吸光度 D510 nm值，计算回收率。结果见表 6，由试验结果可
知，在 A4B4C1D4E4 条件下，样品加样平均回收率为 96． 52%，
RSD为 0． 77%，说明此方法具有良好的加样回收率。
表 5 加样回收率试验结果 (n = 5)
样品
黄酮苷含量
(mg)
芸香苷量
(mg)
测得值
(mg)
回收率
(%)
RSD
(%)
1 0． 1030 0． 1 0． 198 5 95． 5
2 0． 1030 0． 1 0． 199 6 96． 6
3 0． 1030 0． 1 0． 199 8 96． 8
4 0． 1030 0． 1 0． 200 5 97． 5
5 0． 1030 0． 1 0． 199 2 96． 2
平均值 0． 1030 0． 1 0． 199 5 96． 52 0． 77
3 结论
对 4 种不同提取方法进行比较，其中超声波协同复合酶
法所得的黄酮苷含量最高，故而选用超声波协同复合酶法进
行提取有一定的优越性。
通过超声波协同复合酶法对半边莲中的黄酮苷进行提
取，并进行单因素试验和正交试验，确定此法提取半边莲中的
黄酮苷的最佳提取工艺参数为:纤维素酶 26 mg，果胶酶
31 mg，提取温度 54 ℃，酶解 pH值 5． 9，酶解时间 35 min。在
此条件下，提取物中黄酮苷的平均含量为 5． 413 mg /g，加样
回收率为 96． 52%，RSD为 0． 77%。
与常规醇提法相比，复合酶法提取的黄酮苷含量提高了
2． 27倍，而且减少了污染物的排放，而且该提取方法简单有
(下转第 237 页)
—632— 江苏农业科学 2012 年第 40 卷第 5 期
櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄
(上接第 236 页)
效，提取成本较低，为半边莲中的黄酮苷的提取提供了一种可
行的方法，也为开发利用黄酮苷类药物和充分开发利用半边
莲提供了试验数据。
参考文献:
［1］赵 勇，赵 蕾． 半边莲的研究进展［J］． 医学信息 2006，19(5) :
1115 － 1116．
［2］姜艳艳，石任兵，刘 斌，等． 半边莲中黄酮类化学成分研究［J］．
北京中医药大学学报，2009，32(1) :59 － 61．
［3］王芸芸，李 莉，李香玉，等． 复合酶法提取甘草渣中总黄酮［J］．
化学与生物工程，2008，25(8) :49 － 51．
［4］牛 波，邱海霞，田景振，等． 超声强化提取技术［J］． 山东中医
杂志，2000，l9(10) :629 － 630．
［5］黄秀香，赖红芳，刘云英． 正交实验法优选石南藤黄酮苷的提取
工艺［J］． 应用化工，2009，38(7) :1040 － 1042．
栗红生． 冬凌草总黄酮提取工艺的正交设计优化［J］． 江苏农业科学，2012，40(5) :237 － 238．
冬凌草总黄酮提取工艺的正交设计优化
栗红生
(鹤壁职业技术学院，河南鹤壁 458030)
摘要:研究冬凌草总黄酮最佳提取工艺条件。利用计算机建模设计研究不同浓度的乙醇、溶媒体积、提取温度和
提取次数对冬凌草总黄酮回流提取的影响，采用紫外分光光度法测定提取物中总黄酮含量。结果研究，冬凌草总黄酮
最佳提取条件为提取温度 85 ℃，50%乙醇，加 10 倍量溶媒，回流提取 3 次。该方法简便、快速、准确，适用于冬凌草总
黄酮的提取。
关键词:建模;冬凌草;总黄酮;提取工艺
中图分类号:R284． 2;Q946． 91 文献标志码:A 文章编号:1002 － 1302(2012)05 － 0237 － 02
收稿日期:2011 － 08 － 22
基金项目:河南省科技攻关重点项目(编号:102102110196)。
作者简介:栗红生(1965—) ，男，河南鹤壁人，硕士，副教授，研究方向
为计算机应用。E － mail:hbzyjsxy@ 163． com。
冬凌草(Rabdosia rubescens) ，是唇形科香茶菜属植物，主
要成分为萜类化合物［1］。冬凌草野生资源丰富，广泛分布于
鹤壁、林州、济源等太行山区。药理研究结果表明，冬凌草总
黄酮具有抗细胞增殖、抑制癌细胞 DNA和蛋白质的合成和诱
导癌细胞凋亡等活性作用，目前主要用于治疗膀胱癌、贲门
癌、乳腺癌和肝癌等［2］。林州民间采用冬凌草水煎剂治疗食
道癌和贲门癌，效果较好［3］。河南省泌尿外科研究所试将冬
凌草提取物用于膀胱肿瘤的灌注治疗［4］。本研究采用正交
试验模型对冬凌草总黄酮的提取工艺进行了筛选，并采用紫
外可见分光光度法对冬凌草的黄酮类成分的提取工艺进行了
研究和优化，以期提高产率和纯度，为冬凌草的临床应用、工
业生产提供理论参考。
1 材料与方法
1． 1 材料
SP － 752 紫外可见分光光度计及相应工作站(上海沪粤
明科学仪器有限公司) ;超声波清洗仪 (张家港鸿溢超声电气
有限公司) ;R － 201 旋转蒸发器(上海盛玻仪器有限公司) ;
JA2000电子天平(东莞市钰恒衡量器有限公司) ;芸香苷对照
品(南京替斯艾么中药研究所，型号 TCM － 027) ;试剂化学纯
或分析纯为市购;试验用水为蒸馏水。冬凌草采自淇河岸边，
样品经河南中药研究所鉴定。
1． 2 方法
1． 2． 1 对照品储备液 精密称取芸香苷对照品 20． 0 mg，置
于 100 mL容量瓶中，用 60%乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，
得浓度为 200 μg /mL的对照品储备液。
1． 2． 2 标准曲线制备 精密吸取 1、2、3、4、5、6 mL芸香苷对
照品溶液，分别置 20 mL容量瓶中，各加 60%乙醇至 6． 0 mL，
加 1%亚硝酸钠 1 mL，摇匀，放置 10 min，再加 15%硝酸铝溶
液 l mL，摇匀，放置 10 min。加 5% 氢氧化钠 10 mL，再加
60%乙醇至刻度，摇匀，放置 15 min，以相应试剂为空白，在
500 nm 的波长处测定吸光度 D［5 － 6］。计算回归方程为:D =
10． 365C + 0． 003 6，(r = 0． 999 8)线形范围为:9 ～
48 μg /mL［7］。
1． 2． 3 冬凌草中总黄酮平均含量的测定 精密称取本品粗
粉 1． 0 g，按中国药典 2005 年版冬凌草含量测定项下测定总
黄酮的含量，计算式为:黄酮含量 =(样品相当于标准芸香苷
的浓度 × 200 × 25)/［样品重(g)× 1 000］× 100%，重复测定
2 次，总黄酮的含量分别为 1． 65%、1． 73%，平均值为
1． 69%［8 － 9］。
1． 2． 4 冬凌草中总黄酮提取率的测定 精密称取本品粗粉
1． 0 g，按工艺要求加入提取剂，在恒定温度下提取一定时间，
趁热过滤，滤渣再次提取，合并滤液，用提取剂定容于 100 mL
容量瓶中，其余按《中国药典》2005 年版冬凌草含量测定项下
操作，计算总黄酮含量，然后再计算总黄酮提取率，计算式为:
提取率 = 提取黄酮的量 /冬凌草中总黄酮的平均含量
× 100%［10 － 12］。
1． 2． 5 总黄酮提取的方法 准确称取冬凌草样品 1． 0 g，加
入到烧瓶中，加入一定量的乙醇作为提取溶剂，以乙醇浓度、
—732—江苏农业科学 2012 年第 40 卷第 5 期