全 文 ：· 方药研究·
半边莲对 Hela细胞钙信号系统的影响
高永琳 1 ,高　冬 2 ,林德馨 1 ,白　平 2
( 1.福建医科大学生化与分子生物学系 ,福建 福州 350004;
2.福建中医学院现代医学部 ,福建 福州 350003)
摘要: 为探讨半边莲对 Hela细胞内游离钙浓度的影响及其抗癌机理 ,利用荧光染料 Fura-2在细胞内能与
游离钙结合 ,在一定波长光的激发下可发出荧光的特性 ,根据荧光的强度来检测游离钙的变化 ,结果显示半边
莲对 Hela细胞增殖的抑制作用不明显 ,但可通过促进细胞内储藏钙的释放和细胞外钙离子的内流 ,显著提高
细胞内游离钙的浓度。
关键词: 半边莲 ; Hela细胞:游离钙 ;影响
中图分类号: R282. 710. 5　　文献标识码: A　　文章编号: 1004-5627( 2002) 03-0023-04
收稿日期: 2002-03-21
基金项目:福建省卫生厅青年基金资助 ( 3202-198021)
作者简介:高永琳 ( 1968— ) ,女 ,讲师 ,主要从事生物学研究。
　　半边莲属桔梗科的植物 ,性辛、平 ,归心、小
肠、肺经 ,具有利水、消种、解毒的功效。它是临床
上常见的抗癌中药 ,用于治疗肝癌、胃癌、肠癌、乳
腺癌等 ,并可外敷治疗癌症 [1 ]。有关半边莲影响细
胞信号系统的研究尚未见报道 ,本实验以 Hela细
胞为研究对象 ,观察半边莲在发挥抗癌作用时对
细胞内游离钙浓度的影响。
材料和方法
1　材料: Hela细胞引自上海细胞生物研究所 ;
Fura-2 /AM , EG TA, Tri tonX— 100, A TP, iono-
mycin均为美国 Sigma公司产品 ;半边莲购自福
建省中医药研究院。
2　细胞培养与给药处理: 对照组 Hela细胞用含
10%小牛血清的 RPM I1640培养液 ,在 37℃、 5%
CO2条件下培养 ,加药组细胞在培养 24 h后换含
半边莲的培养液连续培养备用 ,其中半边莲的浓
度以每 4 ml的培养液内加入 15μl浓度为 2 g /ml
的母液来计。
3　药物抗癌活性的检测: 依照文献 [2 ]介绍的改良
MT T法。取对数生长的 Hela细胞 1. 0× 1. 03个 /
L加入 96孔板中 ,每孔 0. 2 ml。设阴性对照组 ,阳
性对照组加入半边莲处理 ,每组投 4个平行孔 ,置
37℃培养 5 d,实验终止前 4 h加入 M TT液 ,再
培养 4 h,测试前弃去培养液 ,加 0. 2 m l DM SO,
待结晶溶解后在酶联检测仪上于 570 nm波长测
每孔的 OD值。
4　 Hela 细 胞 胞 浆 游 离 钙 浓 度 的 测 定:
参照文献 [3 ]的测定方法。 收集 Hela细胞悬液 ,用
37℃平衡盐溶液 BSS (每升含 NaCl 135 mmol,
KCl 4. 5 mmo l, CaCl2 1. 5 mmo l, MgCl2 0. 5
mmol ,葡萄糖 5. 6 mmol, Hepes10 mmol, pH 7.
4)洗涤 2遍 ,将 106～ 5× 106细胞悬浮于含 5
μmol /L Fura-2 /AM和 0. 1% BSA的 BSS 1 ml
中 , 37℃温浴 45 min后 ,用冷 BSS洗涤细胞 3次 ,
去除胞外游离的 Fura-2 /AM并将细胞悬浮于冷
BSS 2 ml中 ,放置冰浴 ,待测前 37℃水浴复温。
使用 RF— 5301 PC双波长荧光分光光度计 ,连续
测定 340 nm、 380 nm波长激发光交替激发时 490
nm处的荧光强度 F,同时记录荧光强度比值 R
( R= F340 /F380)。 扫描结果由 Super Ion Probe
So fr tw are软件自动分析 ,依据公式: [ Ca2+ ]i= Kd
× ( R- Rmin) /( Rmax- R)× Ff2 /Fb2 ,计算细胞
内游离钙浓度。其中平衡常数 Kd为 Fura-2与钙
结合反应的解离平衡常数 , 37℃时其值为 224
nmo l / L; R为荧光强度比值 ( R= F340 /380) ;校
正参数 Rmax是采用 0. 05% ～ 0. 1% Triton X—
100破坏细胞膜 ,使细胞外钙内流 ,细胞内 Fura-2
全部被钙饱和时的荧光比值 ; Rmin为向介质中
加入 10 mmol /L过量的 EG TA螯合细胞内外游
离钙 ,使 Fura-2完全未结合钙时的荧光比值。 Ff2
与 Fb2分别为钙游离与饱和时 380 nm荧光强度。
自身荧光以未孵育 Fura-2 /AM的细胞依法同
测 ,计算胞内游离钙浓度时减去。
23
福建 中 医学 院 学报 2002年 8月 第 12卷 第 3期
Journal of Fujian Co llege o f TCM August 2002, 12( 3)
DOI : 10. 13261 /j . cnki . jf utcm. 000779
5　半边莲对 Hela细胞钙通道的影响:对照组和
加药组细胞在培养 3 d后进行细胞内游离钙浓度
的测定时 ,在测定混合液中分别加入 A TP 50μM
(终浓度 )和 Ionomycin 0. 5μM(终浓度 ) ,同时记
录二者对细胞内游离钙浓度的影响。
结 果
1　半边莲对 Hela细胞增殖的影响:通过对培养
0～ 5 d,处于生长周期内的 Hela细胞进行连续的
MT T法测定 ,发现半边莲对癌细胞的抑制在培
养第 3 d时达到高峰 ,杀伤率为 29. 8% ,而后随培
养时间的增长其抑制作用逐渐下降 ,结果见表 1。
若以杀伤率小于 50%判定癌细胞对药物不敏感 ,
则半边莲对 Hela细胞增殖的抑制作用不明显。
表 1　半边莲对 Hela细胞增殖的影响 (吸光度值 )
组别 培　　养　　天　　数
0 1 2 3 4 5
对照组 0. 350 0. 420 0. 535 0. 873 1. 018 1. 15
加药组 0. 350 0. 378 0. 436 0. 613 0. 778 1. 06
杀伤率
(% ) 0 10. 0 18. 5 29. 8 23. 6 7. 8
　　注:杀伤率 = 对照组吸光度值 - 加药组吸光度值对照组吸光度值 × 100%
2　半边莲对 Hela细胞胞内游离钙的影响: 见表
2。
表 2　半边莲对 Hela细胞胞内游离钙的影响 ( x-± s) nM
组　别 n 基础钙离子浓度 ATP作用下钙离子浓度 Ionomycin作用下钙离子浓度
对照组 10 159. 0± 23. 6 736. 4± 96. 7 789. 8± 187. 9
加药组 10 273. 4± 46. 91) 1081. 6± 164. 91) 1231. 6± 137. 71)
　　注:与对照组比较 , 1) P < 0. 01
　　对照组 Hela细胞内游离钙浓度约为 159. 0
± 23. 6 nM ,加药组细胞在半边莲的作用下 ,胞内
游离钙浓度明显上升 ,约为 273. 4± 46. 9 nM ,是
对照组细胞的 1. 24～ 2. 37倍。
3　半边莲对 Hela细胞钙通道的影响
3. 1　半边莲对 ATP升高 Hela细胞胞内游离钙
的影响:见表 2、图 1、图 2。
图 1　 ATP对 Hela细胞胞内游离钙的影响
图 2　半边莲对 ATP升高 Hela细胞胞内游离钙的影响
在 A TP 50μΜ (终浓度 )的刺激下 ,对照组胞
内游离钙从 159. 0± 23. 6 nM迅速上升到 736. 4
± 96. 7 nM,然后在 140 s内回落到 350. 75± 68.
09 nM,其变化趋势与 Martine[4 ]的报道相一致。
加药组细胞胞内游离钙从 273. 4± 46. 9 nM上升
到 1081. 6± 164. 9 nM ,在 160 s内回落到 419. 33
± 113. 2 nM ,升高幅度与对照组相比差异显著。
24 福建中医学院学报 第 12卷
3. 2　半边莲对 Ionomycin升高 Hela细胞内游离
钙的影响:见表 2、图 3、图 4。
图 3　 Ionom ycin对 Hela细胞内游离钙的影响
图 4　半边莲对 Ionomycin升高 Hela细胞内游离钙的影响
在 Ionomycin0. 5μM (终浓度 )的刺激下 ,对
照组细胞内游离钙从 159. 0± 23. 6 nM迅速上升
到 789. 8± 187. 9 nM,然后在 80 s内回落到 337.
6± 41. 7 nM;而加药组细胞内游离钙从 273. 4±
46. 9 nM上升到 1231. 6± 137. 7 nM ,在 130 s内
回落到 443. 2± 30. 6 nM。其升高幅度和维持时间
均比对照组高 , 2组相比差异显著。
讨 论
1　 M TT法是一种日益受到重视的体外抗癌活
性评价方法 ,它具有重复性好 ,灵敏度高 ,简便快
速 ,经济的特点。美国 N CT推荐用于筛选化疗药
物。本研究采用该法进行半边莲抗癌活性的测定 ,
结果显示半边莲对 Hela细胞的杀伤率小于
50% ,表明半边莲对子宫颈癌细胞增殖的抑制作
用不敏感。 这一结果与实际抗癌应用中半边莲少
见单独使用相一致 ,推测半边莲可能在复方制剂
中通过与其它药物的有效成分协作 ,共同发挥抑
制癌细胞生长的作用 ,确切结论需进一步的实验
加以证实。 虽然半边莲不能有效抑制癌细胞的增
殖 ,但在实验中我们发现 ,对照组 Hela细胞内游
离钙浓度为 159. 0± 23. 6 nM ,而经半边莲处理后
Hela细胞内游离钙浓度为 273. 4± 46. 9 nM ,说
明半边莲能显著提高 Hela细胞内基础钙的水平 ,
可能与之诱导癌细胞凋亡有关。 细胞内钙离子信
号系统早在 70年代末就被发现与细胞凋亡的调
控有密切关系 [8 ]。 之后 ,大量实验结果显示 ,钙离
子本身是一种诱导细胞凋亡的信号 ,在大多数细
胞凋亡过程中 ,细胞内游离钙浓度均有所增加。
1993年 , Baf fy和 Lam 2个实验室同时证明 ,内质
网中钙离子储存的耗竭是一种细胞凋亡信号 ,一
方面钙离子储存的减少可引起内质网的 DNase I
和核骨架蛋白酶库等进入近核区或核基质 ;另一
方面钙库的耗竭信号引起生物小分子的释放 ,促
使细胞外钙离子的内流而诱导凋亡 [4 ]。 本实验结
果表明半边莲可促使细胞内储存的钙离子释放 ,
引起钙离子耗竭 ,同时诱导细胞外钙离子的内流 ,
以升高细胞内游离钙离子的浓度。因此 ,笔者推测
半边莲通过提高 Hela细胞内基础钙的水平达到
诱导癌细胞凋亡 ,从而发挥抗癌的药效 ,确切的证
据需进一步的实验说明。
2　细胞内游离钙作为重要的第二信使参与多种
细胞功能的调节 ,钙浓度的改变是细胞生理功能
的重要物质基础 ,也是多种受体激活后信号传递
过程的中心环节。钙浓度与钙来源密切相关 ,要提
高细胞内钙浓度可通过两条途径 ,一是激活细胞
膜上的钙离子通道 ,使细胞外的钙离子内流 ;另一
条途径是将储存在内质网、肌浆网和线粒体等细
胞器内的钙离子释放出来。在本实验中 ,对照组
25第 3期 高永琳等:半边莲对 Hela细胞钙信号系统的影响
Hela细胞内游离钙浓度为 159. 0± 23. 6 nM,比
文献 [ 4]报道的 72. 0± 17. 0 nM高 ,这一结果上的
差异可能与细胞的培养条件不同有关。文献报道
所述的 Hela细胞培养是用含 7. 5%胎牛血清的
RPM I1640在 37℃ , 7. 5% CO2浓度下培养备用 ,
而本实验是将 Hela细胞用含 10%小牛血清的
RPM I1640在 37℃ , 5% CO2浓度下连续培养 3 d
备用。 两种培养条件造成同一种细胞所处的生理
环境不同 ,在信号系统上可表现出钙离子的浓度
差异。 在半边莲的作用下 , Hela细胞内游离钙浓
度上升为 273. 4± 46. 9 nM。为了明确半边莲是通
过哪条途径引起细胞内钙浓度的提高 ,分别采用
可引起细胞外钙离子内流的 Ionomycin [5 ]以及导
致胞内储存钙离子释放的 AT P刺激 Hela细
胞 [4～ 7 ]。结果表明不论哪种刺激剂均可使 Hela细
胞内游离钙离子浓度增大 ,且加药组细胞内钙离
子浓度大于对照组细胞内钙离子浓度 ,说明半边
莲可同时影响上述两条调节钙浓度的途径 ,从而
提高 Hela细胞内钙离子浓度 ,发挥相应的生理作
用。
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Inf luence of Cardinal on Calcium Beaconage of Hela Cells
GAO Yong-l in
1 ,GAO Dong
2 , LIN De-xin
1 , et al
( 1. Dept. of Biochemistry and Molecular Biology, Fujian Medical University, Fuzhou,
Fujian 350004, China; 2. Dept. of ModernMedicine, FCTCM, Fuzhou, Fujian 350003, China)
Abstract: To study the influence of cardinal on cy toplasmatic f ree Ca
2+
densi ty of Hela cells and
i ts mechanism on anti-cancer, the changes o f f ree Ca2+ were tested acco rding to the intensi ty o f f luo-
rescent and the characteristics of fluo ro chrome Fura-2 which could combine wi th f ree Ca
2+
and then
giv e o ff f luorescent under the condition of stimulating by some w aveleng th light. The results showed
that ca rdinal had no obviously inhibi tiv e effects on Hela cel lpro li feration, but could stimulate the cy to-
plasma tic store-calcium outf low and ex t racel lular Ca2+ inf low , and could obviously improve the densi ty
o f cy toplasmatic f ree Ca
2+
.
Key words: ca rdinal; Hela cells; f ree cytoplasma tic calcium; inf luence
26 福建中医学院学报 第 12卷