全 文 ：中国中西医结合杂志 2 0 0 3 年 6月第 2 3 卷基础理论研究特集
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: l一 15 .
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伤肌酸激酶及丙二醛的影响 . 湖南中医学院院报 20 00 ; 20
( 3 )
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6 2一6 4 .
1 刘金兰 , 张振莉 , 刘俊岭 ,等 电针对急性心肌缺血家兔血浆
单胺类神 经递质的影响 . 中国针灸 19 9 ;7 17 ( 10 ) : 604 一
6 06
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12 文 深 , 刘俊岭 , 陈淑萍 ,等 . 电针对急性心 肌缺血糖元合成
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13 陶 军 , 王舟琪 , 刘桥义 ,等 . 丹参酮防治心 肌再灌注损伤的
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14
15
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19 99 ; 5 1 ( 1 )
: 59一 63 .
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:
139一 14 5 .
(本文编辑 陈冬燕 )
半边莲不同组分对大鼠动脉内皮细胞内皮素合成
及 中膜平滑肌细胞增殖的影响 `
李瑞峰 , 陈 融 ` 李 莉 ` 任冬梅 2 郭成浩 3 闰晓梅 ` 胡维诚 ’
摘要 目的 :探讨 半边 莲抗动脉 粥样硬 化作 用 的有效成分 。 方法 : 提取 半边 莲两 种 不 同 组分 ( A0 0 1 ,
0B 0 1) 用 于高脂血症大鼠 , 观察其对动脉 内皮细胞 内皮素 ( E T )一 1 和 内皮源 型一氧化 氮合酶 ( e N O )S 代谢以 及
主动脉 中层平滑肌细 胞增殖的影响 。 结果 : 高脂 大 鼠应用 半边 莲 B 0 01 组分 60 天后 , 增高的血脂 不 降低 , 而
血浆 E T 一 l 浓度较 高脂对照 组明显降低 (尸 < 0 . 05 ) ; 动脉 内皮 细胞及动脉壁 中层平滑肌细 胞 E r 一 l 阳 性细 胞
率和 中膜厚度显著低 于高脂对照组 ( 尸 < 0 . 05 ) ; 血装 e N O S 浓度则显著高于高脂对照组 (尸 < 0 . 05 ) 。。 应 用 半
边莲 A 001 组分的高脂 大鼠血脂 、 血装 E T 一 1 、 e N O S 浓度 、 动脉 内皮细胞及动脉壁 中层平滑肌细胞 E T 一 1 阳性
细胞率均无明显 变化 。 结论 : 半边莲 B 001 使高脂血症 大鼠 内皮细胞 、 动脉平滑肌 细胞合成及释放 E T 一 1 减
少 , 并使血装 e NOS 含量增加 ,具有缓解高脂血症对血管内皮的持续损伤及抑制动脉平滑肌细胞增殖 的作用
,
关键词 半边莲组分 血管平滑肌细胞 内皮素 一 1 一氧化氮合酶 动脉 粥样硬化
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山东省卫生 厅青年科学研究基金 ( N o . 89 101 01 02 ) 和山东省中医药管理局科研基金资助 ( N o 19 8 一 C A 一 2( 、 A A 2)
山东大学 医学 院病理生理学教研室 (济南 2 50 0 12 ) ; 2 . 山东大学药学院 ; 3 . 山东大学药学 院病理 教研 室
中国中西医结合杂志 2 0 0 3年 6 月第 2 3卷基础理论研究特集
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R o s S 提出 “ 损伤 一 反应假说 ” ( t h e r e s p o n s e 一 t o 一 i n -
j盯 y h y p o t h e s i s )川认为 : 内皮细胞损伤和血管平滑肌细
胞 ( v a s e u la : S m o t h m u s e l e c e l l , V S M C )增 殖在动脉粥
样硬化 ( A )S 发生 中起着关键作用 ,其中内皮细胞损伤
是 A S 病灶形成 的始动环节 , 中膜平滑肌细胞 ( SM C )
迁移 和增生是病灶形成的关键 , 高脂血症是 A S 的最
主要危险因素之一 。
1 9 5 5 年日本学 者 Y a n a g is a w a 〔’ 〕从猪主动脉内皮
中分离出由 21 个氨基酸组成 的活性多肤— 内皮素
( e n d ot h el in
,
E T )
,是 目前所知作用最强 和持续时间最
长的缩血管活性多肤 , 并且具有促血管平滑肌细胞增
殖和调节体内有关活性物质释放的功能 。
E T 与蛇毒有共同的祖基 因 、 同源 染色体结构和
相似的生物学效应闭 。 我们前期工作显示 , 抗蛇毒中
药半边莲和蚤休可抑制高脂血症大鼠动脉内皮细胞合
成 E T 一 1 ,并对血管内皮具有保护作用 〔` 〕 。 本研 究利用
高脂血症实验模型进一步探讨半边莲提取物不同组分
对动脉内皮功能 、 中膜 S M C 增殖 的影响 , 以寻找清热
解毒类 中药抗动脉粥样硬化作用的有效成分 。
材料和方法
1 材料
1
.
1 动物 4 0 只雄性 W ist a : 大 鼠 (山东 大学 医
学院实验动物中心提供 ) ,体重 160 一 2 0 0 9 。
1
.
2 半 边莲提取物 半边莲 A O01 (醇 、 醚提取
物 ,呈酸性反应 ) 、半边莲 B 0O1( 碱性条件下 , 乙 醚提取
物 ,呈碱性反应 ) , 由山东大学药学院天然药物化学教
研室提供 。
1
.
3 主要仪器 T D 2 0 0 0 病理 、 细胞 图像分析系
统 , 由北京天地高科技技术开发公司生产 ; FJ 一 2 0 0 3 15 0
全 自动 7 免疫计数器 ,西安 2 62 厂生产 。
2 方法
2
.
1 分组及 给药 将 大 鼠随机分 为 4 组 , 每组
10 只 。 ( 1) 空 白对照组 : 喂 以 大 鼠基础饲料 , 任意进
食 , 于第 9 0 天处死 ; ( 2) 高脂对照组 : 在基础饲料 中加
入 10 % 猪油 、 2 % 胆固醇 、 0 . 5 % 猪胆盐 ,任 意进食 , 于
第 9 0 天处死 ; ( 3 )高脂 B 0 0 1 组 ( B 0 0 1 ) : 饲料组成 同高
脂对照组 ,喂养 3 0 天后 血脂水平升高 ,在继续予高脂
饮食的同时 ,每天灌胃 5 % 半边莲 0B 01 水溶液 4 m l众g
(相当于生药 2 9人 g , 根 据预实验结 果确定 ) , 持续 60
天 ,于第 9 0 天处死 ; ( 4) 高脂 A 001 组 ( A OO I ) : 饲料组
成同高脂对照组 ,高脂饲料喂养 30 天后 ,在继续予高
脂饮食的 同 时 , 每天灌 胃 5 % 半边 莲 A 0 01 水 溶液
4m l人g (相当于生药 2 9人g ) , 持续 6 0 天 ,并于第 9 0 天
处死 。
2
.
2 观察项 目及检测方法
2
.
2
.
1 血脂 分别在实验前 、 实验第 30 天和 9 0
天时取血测定血清总胆固醇 ( T C )及甘油三醋 ( T G ) 。
2
.
2
.
2 血 浆 E T 及 内皮 源 型一 氧化 氮合酶
( e N O S ) 乙 醚麻醉大 鼠 , 断尾取血 , E D T A 和抑肤酶
抗凝 , 3 7℃水浴静置 1 5m i n , 3 000 r m/ i n 离心 10 m i n , 分
离血 浆 , 一 2 0℃ 保存待测 。 用放射免疫法测 定 血浆
E T 含量 , 化学 比色法测定血浆 e N O S 活性 。 分别在实
验前 、 实验第 30 天和 90 天测定 。 内皮素放免药盒 由
中国人 民解 放军 总医 院科 技 开发 中心 放免所提供 ;
e N O S 检测试剂盒由南京建成生物工程研究所提供 。
2
.
2
.
3 动脉内皮细胞 E T 一 l 表达 戊 巴 比妥钠
麻醉大鼠 ,左颈 总动脉插管 ,恒 压 ( 1 3 . 3 k P a )灌注 4 %
多聚 甲醛 ( p l l 7 . 2 ) ,持续 10 m i n ,剥离胸 、 腹主动脉 , 置
4 % 多聚甲醛 固定 l h 。 沿纵轴剖开血管 , 制备动脉 内
皮铺片〔`〕 ,用免疫组化技术检测动脉内皮细胞 内皮素
阳性细胞率 、 显微镜下计数每例主动脉内皮全部视野
内皮细胞总数和 内皮素阳性细胞 数 , 计算 E T 一 1 阳性
细胞率 。 小 鼠抗 E T 一 1 血清由 S ig m a 公 司提供 ; 即用
型 S A B C 免疫组化染色试剂盒由武汉博士德生物工程
有限公司提供 。
2
.
2
.
4 动脉壁 M vo at 染 色及平 滑肌 E T 一 1 阳性
细胞率检测 按上述方法取动脉标本 , 于胸 主动脉起
始进行病理切片 , 用 M vo at 染色技术 , 将内 、 外弹力板
染成黑色 ,可明确 区分主动脉的内膜 与中膜 。 然后应
用细胞图像分析系统测量动脉管壁厚度 ,分析整体动
脉管壁及主 动脉 中膜 S M C 增殖情况 , 并对各组 间数
据进行统计学处理 。 M vo at 染色技术引自美国华盛顿
大学病理学和病理生物学实验室 ,最终染色结果为 : 细
胞核及弹力纤维为黑色 ;基质和粘蛋 白为蓝色 ; 纤维蛋
白为深红色 ;胶原和网状纤维为黄色 ; 肌细胞为红色 。
用免疫组化法检测动脉平滑肌 E T 一 1 阳性细胞率 , 方
法同内皮细胞免疫组化实验 。
2
.
2
.
5 动脉管壁厚度测定 于 r正 染色条件下 ,
用 T E泛0 0 0 病理 、 细胞图像分析系统测量全层动脉管壁
厚度 , 以确认 动脉管壁细胞整体增殖情况 ; 于 M 6v a t 染
色条件下测量主动脉中膜 S M C 层厚度 ,分析 SM C增殖
水平 。 测量时 , 围绕动脉管壁一周随机选取 5 处位置作
为测量点 ,取算术平均值作为该标本的测量结果 。
3 统讨一学方法 所有数据 均用均数 士标准差表
示 ,采用两组均数 t 检验和多组均数间的方差分析 。
中国中西医结合杂志 ( 2) 3 0年 6 月第 23 卷基础理论研究特集
结 果
1各组 血清 T C 及 T G 含量比较 高脂饮食 3 0
天后 , 高脂对照组 、 A O01 和 B 001 3 组大鼠血 清 T C 和
T G 含量均明显增高 ( 尸 < 0 . 0 5 ) ; B 0 0 1 组 、 A 001 组灌
服中药 6 0 天后 , T C 、 T G 含量仍明显增高 ,与高脂对照
组 比较差异无显著性 ,见表 1 。
2 各组血浆 E T 及 e N O S 含量 比较 给予高脂
饮食 3 0 天后大鼠血浆 E T 含量显著增高 (尸 < 0 . 0 5 ) ,
血浆 e N O S 活性显著降低 (尸 < 0 . 0 5 ) 。 用药 60 天后 ,
B OO I 组 E T 值仍高 ,但低于高脂对照组 (尸 < 0 . 05 ) ,血
浆 e N O S 活性明显 高于高脂对照组 ( 尸 < 0 . 05 ) ; A 001
组血浆 E T 含量及 e N O S 活性 与高脂对照组 比较差异
无显著性 , 见表 2 。
3 各组 动脉 内皮细胞 E T 一 l 阳性细胞率比较
空 白对照组 多数铺 片无 E T 一 1 阳性细胞 , 高脂对 照组
E T
一
l 阳性细胞数明显增多 , B 0 01 组 较高脂对 照组减
少 ; A OOI 组与高脂对照组阳性细胞数比较差异无显著
性 ,见表 3 , 图略 。
4 主动脉 中膜平 滑肌细胞增殖水平及平滑肌细
胞 E T 一 1 阳性细胞率比较 M vo at 染色条件下 ( L SA B
x 4OO )
,空 白对照组主动脉内 、外弹力板清晰 、连贯 ,染
成红色的 SM C 排列整齐 。 高脂对照组较空 白对照组
主动脉中膜平滑肌层厚度明显增加 , 内 、 外弹力板分离
断裂 ,个别部位缺失 。 0B 01 组主动脉中膜平滑肌层厚
度小于高脂对照组 , 内 、 外弹力板相对完整 (图略 ) 。
高脂 对照组 、 B 001 和 A 0 01 3 组 主动脉壁 平滑肌
细胞 E T 一 1 阳性细胞率均高于空 白对照组 ( 尸 < 0 . (巧 ) ,
B 0 0 1 组低于高脂对照组 (尸 < 0 . 0 5 ) , 见表 3 , 图略 。
5 主动脉管壁厚度
5
.
1 动脉壁全 层厚 度 高脂 对 照组 、 l(I 川 1 和
A 0 0 1 3 组 动脉壁 全层 厚度均 大于 空 白对 照组 ( 尸 <
0
.
0 5 )
,其中 B O01 组略小 于高脂对照组 , 但两者之 间
差异无显著性 (尸 > 0 . 0 5 ) ,提示 1(I )0 1 组分有一定减轻
动脉壁增厚的趋势 ,见表 3 。
5
.
2 主动脉中膜平 滑肌层 厚度 高脂对照组 、
B OO I 组 、 A 0 01 组 主动脉中膜平滑肌层厚度均 大于空
白对照组 ( P ( 0 . 0 5 ) 。 B 0 0 1 组 厚度小 于高脂对照组
(尸 < 0 . 0 5 ) , 但 内膜 与 外膜 无 明 显变 化 , 见表 3 ( 图
略 ) 。
讨 论
本实验表明 ,高脂饮食可明显增加大 鼠动脉内皮
及平滑 肌 细胞 E T 一 1 的 合成 , 并 叮明 显地 降低 血浆
e N 0 s 浓度 。 R ue f 等〔’ 〕认为 , 血管平滑肌细胞 l{r r 一 l 的
生成和 自分泌的激活是 A S 内皮功能损伤的屯要发病
机制 。 N O 一 N O S 系统功能紊乱也与 A S 的发病 有密切
关系〔6 〕 。
表 1 半边莲不同组分对大鼠血清 T C 及 T G 含量的影响 m m 0 1/ L , r 士 、
组别 T C I
、
( 二
3 0 天 9 0 天 3( ) 天 9 () 大
空 白对照
高脂对照
BO0 1
A ( )0 1
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.
7 6 士 0 . 19
.
7 9 士 0 . 17
.
7 9 士 0 . 15
.
8 5 士 ( ) . 18
1
.
7 8 士 0 . 16
5
.
7 9 士 0 . 16 肠
6
.
0 2 土 0 . 17 苍
5
.
9 3 士 0 . 1 8 长
1
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8 0 士 0 . 1 6
6
.
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6
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3 6 士0 . 17 .
6
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3 4 士 0 . 14 “
1
.
0 7 士 0 . 12
0
.
9 9 士 0 . 1 1
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.
0 1 士 0 . 13
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.
9 6 士 0 . 12
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6 8 十 《)
注 : 与空 自对照组 比较 , ` P < 0 . 0 ;5 与高脂对照组 比较 , △ 尸 < 0 . 05 ; 下表同
表 2 半边莲不 同组分对大鼠血浆 E T 含量及 e N O S 活性的影响 ( r 士
组别 E T (拼g L/ )
e N ( ) S ( t J /
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3 0 天 9 0 天
2 4 2
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6 5 士3 1 . 0 8
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6 5 士 2 8 . 0 4△
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空白对照
高脂对照
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5 2 士 2 6 . 3 6
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3 2 士 3 0 . 4 5
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0 3 士 3 0 . 4 2
3 1 3
.
2 3 士 3 6 . 5 2
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衰 3 半边莲不同组分对大鼠动脉内皮细胞及动脉壁平滑肌细胞 E T 一 1 阳性细胞率和动脉管壁厚度的影响 ( 、 士
组别 E T
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高脂对照
日〕0 1
A 0 0 1
10
l 0
l 0
l 0
动脉内皮细胞
2
.
7 8 士 0 . 2 3
7
.
2 3 士 0 . 2 8 铃
3
.
8 2 士 0 . 1 6 △
6
.
1 1 士 0 . 2 9
动脉壁平滑肌细胞 主动脉壁全层
1
.
2 6 士 0 . 14
6 8 8 士 0 , 2 7 铃
3
.
5 2 士 0 . 17 份 △
6
.
3 5 士 0 . 2 8 并
1 5
.
3 9 士 1 . 8 6
2 2 8 5 士 3 . 4 6 甘
18
.
4 7 士 2 . 5 2 .
2 1
.
7 5 士 2 , 5 3 赞
主动脉中膜平滑肌层
10
.
9 4 牛 1
.
7 2
16
.
4 7 + 2
.
5 4
.
12
.
8 4 4 2
.
6 2
· 八
16
.
6 5 卞 2 7 9
.
中国中西 医结合杂志 2 0 0 3 年 6月第 2 3 卷基础理论研究特集
血管 SM C增殖是 S A斑块形成的重要环节 , E T 一 l
可激活培养的血管 S M C 的丝裂原 激活蛋 白 ( M A P ) ,
促进血管 s M c 从 0G 期进入 G ; 期川 。 E T 一 1也能加强
血小板源性生长 因子 ( P D G F )引起的人类平滑肌细胞
的生长闭 。 因此 , 内皮素在细胞分裂的启动和促进 中
发挥重要作用 。
本研究观察到高脂对照组大 鼠主动脉中膜 SM C
层厚度较正常对照组明显增 加 , 表明高脂饮食促使主
动脉中膜 S M C 显 著增殖 , 而动脉内膜仅显示 内皮细
胞的 E T 一 1 表达增加 , 而未见明显增厚 。 提示高脂饮
食造成内皮损伤和 E T 一 l 合成增多 , 可促进中膜 SM C
增殖 、 数 目增多 、 胞体肥大 ,进 而又使血 管 S M C 合成
E T
一
l 的功能增强 。 中膜 SM C 通 过 自分泌或旁分泌
E T
一
l 的方式 ,作用于自体及周围 S M C , 形成正反馈效
应 , 可能在推动中膜 S M C 不断增厚 中起重要作用 。
清热解毒中药半边莲是中医学治疗毒蛇咬伤的常
用药物 。 本室在前期工作中曾对高脂血症大鼠灌服含
有该药的水煎剂 ,发现动物的血脂并不降低 ,但动脉内
皮细胞的 E T 一 1 合成减少 , 并使内皮损伤减轻〔`了。 说明
半边莲通过拮抗 E T 一 1 而具有抗动脉粥样硬化作用 。
为了探讨半边莲抗 A S 的有效成分并进一 步观察
其不同组分对动脉平滑 肌细胞增殖的影响 , 本实验提
取了半边莲的两种组分分别进行实验 ,结果显示 0A 01
组分对 E T 一 l 的合成及释放无 明显作用 , 也 无明显抑
制中膜 SM C 增殖作用 ; B0 1 组分能明显地降低血浆
E T
一
1浓度 、 促进 e N O S 表达 , 并能抑制动脉中膜血管
S M C 的增殖 。 许多研究 已表 明无论是 A S 病灶 的发生
发展 ,还是高血压病时的血管重塑都与血管 SM C 的
增殖有密切关系 。 本实验明确了半边莲调整 E T 一 1 和
e N O S 表达及抑制动脉平滑肌细胞增殖 的有效组 分 ,
为今后临床 卜进行 A S 、 高血压病等心脑血管疾病的防
治研究提供 r 一条新的思路 。
参 考 文 献
1 Ros
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R
. 〔` e ll b io lo g y o f a t h e r o s e le r o s is . A n n u R e v
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4 杜艳芝 , 阎晓梅 , 胡维诚 , 等 . 清热解毒液对高脂血症大鼠内
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1 13 7
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,
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P r e s i
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E n d o t h e li ll
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la t io n 1 99 9 ; 10 0 ( l )
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5一 8 .
(本文编辑 王 卫 霞 )
粉防己碱对猪冠状动脉平滑肌细胞钙激活钾通道的作用 `
杨 艳 , 税青林 , 曾晓荣 ` 刘智飞 ` 贺 军` 周 文 ` 李妙龄 ` 井上 勋 2
摘要 目的 : 研 究粉 防 己碱 ( T et )对猪冠状动脉平滑肌细胞 ( SM C )钙激活钾通道 ( (K , a )的作用 。 方法 : 用
膜片钳单通道技术确 定通道的变化 。 结果 : T et 浓度依赖性地可逆性 阻 断 s M c 上的 K c 。 。 细胞膜 内侧 面加
入 T e t 2 0 、 3 0 又 10 一 6 m o l · L ’ 可 分别使通道开放概率降低 ( 5 8 . 2 士 2 0 . 3 )% 、 ( 6 4 . 6 士 1 6 . 6 ) % , 平均开放时间从
( 2
.
3 士 0 . 7 )m s 减少到 ( 2 . 0 士 0 . 8 ) m s 和 ( 1 . 6 士 0 . 6 ) m s , 平均关 J泪时间从 ( 6 8 . 1 士 3 9 . 3 ) m s 减 少到 ( 6 4 . 0 士
62
.
4) m s 和 ( 3 7 . 0 士 16 . 6 ) m s 。 随 T e : 浓度 的 增加 , 通道 活动逐步 完全抑制 。 结论 : T et 是 一种 天 然有效 的
SM C 上 K 。 抑制剂 。
关键词 粉 防 己碱 膜片钳技术 钙激活钾通道 猪冠状动脉平滑肌
朴 四川省教 委资助课题 ( N o9 7一 1 2)
1
. 沪州医学院 ( 四川 6 4 6 0 00 ) ; 2 日本德 岛大学酵素研究所