全 文 ：金粉蕨素体外抗人卵巢癌作用研究
唐华贵 ,谢宛玉 ,曹建国 1 ,刘艳娥
深圳市宝安区福永医院　深圳市　518103
　　摘要　目的　探讨金粉蕨素抗人卵巢癌(COC1)细胞系细胞作用及机制。方法　MTT比色法测定金粉蕨
素对 COC1、顺铂耐药亚株 COC1/DDP及中国仓鼠卵巢(CHO-K1)细胞系细胞增殖的影响;PI染色流式细胞术
(FCM)分析金粉蕨素对 COC1、顺铂耐药亚株 COC1/DDP及中国仓鼠卵巢(CHO-K1)细胞系细胞凋亡和细胞周
期的影响。结果　金粉蕨素对 COC1、COC1/DDP细胞生长具有抑制作用呈剂量 -效应和时间 -效应关系 , PI染
色 FCM分析发现金粉蕨素明显使 COC1细胞周期停滞于 G1期(G1期细胞百分数由 50.3%上升到 70.6%,
P<0.05)。结论　金粉蕨素具有体外抗人卵巢癌(COC1)细胞系细胞作用 , 其机制可能与细胞周期 G1期阻滞
有关。
　　关键词　卵巢癌;金粉蕨素;治疗作用
　　中图分类号:R737.31　　文献标识码:A　　文章编号:1672-3422(2008)15-0004-03
AntitumorEfectofOnychinonOvarianCancerCelinVitro
TANGHuagui, XIEWanyu, CAOJianguo, etal
FuyongHospitalofBaoanDistrict, Shenzhen518103, China
ABSTRACT　Objective　Tostudytheefectsandmechanismoftheonychinonhumanovarian
cancer(COC1)cels.Methods　MTTassaywasusedtodeterminetheefectonproliferationofCOC1、
COC1 /ddpandCHO -K1celbyonychin;PIstainedflowcytometry(FCM)wasusedtoanalysethe
apoptosisandcelcyclechangeofCOC1 treatedbyOnychin.Results　OnychininhibitedCOC1 and
COC1 /DDPcelgrowthsignificantlyinadose-dependentmannerandatime-dependentmanner.A-
nalysisbyflowcytometryshowedthatonychinsuppressedcelcycleprogressionatG1 phase.9(the
percentagesofcelsinG1phaserosefrom50.3%to70.6%).Conclusion　Onychinhasanti-ovarian
carcinomaefectinvitro;themechanismmightbeassociatedwithG1 phasecelcyclearest.
KEY　WORDS　Ovariancancer;Onychin;Therapeuticaction
　　卵巢癌是妇女生殖系三大恶性肿瘤之一 ,因
其生长隐秘 ,发现时多已属晚期 ,手术后辅助化疗
仍为其主要治疗手段 ,然而常见的化疗药物因对
卵巢癌产生化疗耐药和药物毒性导致疗效不太理
想 ,使治疗率仍徘徊在 20-50%之间[ 1] ,因此探索
新的卵巢癌治疗药物很有必要 。金粉蕨素(On-
ychin)是从中国蕨科(Sinopteridace-ae)金粉蕨属
(OnychiumChing)栗柄金粉蕨(Onychiumlucidum)
中提取获得的一种二氢黄酮甙 。经结构鉴定该化
合物是 5 -hydroxy-7 -rhamnosylgluc0sYlfla-
vone[ 1]以往研究证实金粉蕨素对 P388小鼠淋巴细
胞性白血病细胞具有显著细胞毒性 ,其 Ic50值为
1　南华大学肿瘤研究所　衡州市　421001
0.21μg/ml[ 2] 。本实验体外培养人浆液性乳头状
囊腺癌细胞系 COC1及耐药亚株 COC1 /DDP,观察
Onychin对其增殖和凋亡的影响及作用机理 ,为其
应用于卵巢癌的临床治疗提供理论和实验依据 。
1　资料与方法
1.1　资料　金粉蕨素(On)rchin)由华南大学肿瘤
研究所提取 ,为白色晶状粉末 , 用少许二甲亚砜
(DMSO)溶解 , PBS液稀释(DMSO最高终浓度低
于 0.02%, V/V);
1.2　试剂　RPMI-1640为 Gibco公司产品;新生
牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司;
二甲基亚砜(DMSO)为 Amresco公司产品 , MTT、台
盼蓝 、金雀异黄素(Genistein)为 Sigma公司产品;
·4· 　医药论坛杂志　2008年 8月　第 29卷　第 15期　
羟基喜树碱(Hydroxycamptothecin)为湖北美尔雅
集团美升药业有限公司生产 ,产品批号为 030701。
1.3　细胞培养　人卵巢癌细胞株 COC1、耐药亚
株 COC1/DDP、中国仓鼠卵巢细胞株 CHO-K1、均
购自中国典型培养物保藏中心。细胞培养于 RP-
MI1640培养基中 ,含 10%灭活小牛血清 , 100kU/L
青霉素 、100mg/L链霉素 ,置 37℃、5%CO2培养箱
中培养 。
1.4　方法
1.4.1　MTT比色法测定　实验分组:溶媒对照组
加入相同体积含终浓度为 0.1%DMSO的完全培
养基;实验组 COC1 细胞和 COC1/DDP细胞
(1.5.0μmol/L、 3μmol/L、 6μmol/L、 12μmol/L
Onychin);CHO-K1 细胞对照组 (40μmol/L、
60μmol/L、80μmo/L、 100μmo/LOnychin), COC1、
COC1/DDP细胞以 2×105 /L密度 、CHO-K1细胞
以 1×105 /L密度接种于 96孔板 。每组设 4个平
行孔 ,并设空白对照 。悬浮细胞接种后直接加药 、
贴壁细胞培养 6h贴壁后 ,分别加入不同浓度的
Onychin,并设顺铂 6.0μmo/L做阳性药物对照组 ,
分别处理 24h、 48h。在培养结束前 4h每孔加入
5g/L-1的 MTT20μL,继续培养 4h后吸去培养基
每孔加入 DMSO100μL,震荡 10min使沉淀充分溶
解后用酶标仪(EX-800型)在 570nm波长测吸光
度(A值)。按公式 IR(%)=(1-实验组 A均值 /
对照组 A均值)×100%计算相对抑制率(IR),按
寇氏改良孙氏综合计算法计算出半数有效浓度
(IC50),按下列公式计算选择指数(SI)=正常细胞
IC50值 /肿瘤细胞 IC50值 ,按下列公式计算耐药指数
(RI)=耐药细胞 IC50值 /肿瘤细胞 IC50值 ,以上实
验重复 3次 。
1.4.2　细胞周期和凋亡率分析　将对数生长期的
COC1细胞制成单细胞悬液 ,取适量接种于 75ml
的培养瓶中 ,在 37℃、5%CO2饱和湿度条件下培
养至对数生长期 ,按终浓度为 3、6、12μmo/L加入
Onychin,空白组加入等体积的 PBS,作用 24h、48h
后 , 1000rmin×10min离心 ,弃去上清液 , PBS洗涤
2次 , 70%乙醇 4℃固定过夜 , RNA酶消化处理 ,加
入碘化丙啶(PI), 终浓度为 50μg/ml,振荡混匀 ,
300目尼龙网滤过 ,上机检测 。每份样品测定 1×
10
4个细胞 ,进行细胞周期及凋亡分析 ,亚二倍体
细胞为凋亡细胞 ,并计算凋亡率。每个浓度设平
行样品 3个。
1.4.3　统计方法　计量资料结果采用 ANOVA检
验 ,记数资料 χ2检验 ,均用统计软件 SPSS10.0处
理 ,以 P﹤ 0.05为差异有统计学意义 。
2　结果
2.1　Onychin对 COC1细胞 、COC1 /DDP细胞及
CHO-K1细胞生长的抑制作用　MTT比色法测
定结果显示:随着 Onychin浓度的升高 ,作用时间
延长 ,对 COC1细胞及 COC1/DDP细胞抑制率增
加 ,且呈剂量 -效应关系和时间 -效应关系
(Tab1),半数抑制浓度(IC50值)均为 12μmo/L,而
对 CHO-K1细胞的抑制作用较弱 , IC50值为
85μmo/L,说明 Onychin对正常细胞的毒性作用
(IC50 =85μmol/L)小于对卵巢癌细胞的毒性(IC50
=15μmol/L),其对人卵巢癌细胞毒选择指数(SI)
为 7 , 耐药指数 (RI)为 1, 而顺铂耐药指数为
6.5[ 3] 。
2.2　Onychin对 COC1凋亡及细胞周期的影响　
PI染色 FCM分析显示 ,凋亡细胞呈特征性亚二倍
峰(图 1),这是细胞凋亡时 , DNA断裂生成小的
DNA片段 ,从细胞内释放的结果 ,可通过凋亡峰面
积检测凋亡细胞在整个细胞群中的比例。 2、3、4
分别为 Onychin3、6、12μmo/L作用 COC1细胞 24h
凋亡细胞分别占 9.6%、26.2%、38.9%,随着剂量
的增加 ,凋亡率上升 ,说明Onychin诱导COC1细
表 1　金粉蕨素作用 COC1和 COC1/DDP细胞 24h和 48h的 A570mm值( x±s, n=6)
Group Dose(μmol/L)
COCO1
24h 48h
COC1 /DDP
24h 48h
Control(PBS) - 1.13±0.34 1.42±0.33 1.06±0.21 1.12±0.21
顺铂 9DDP0 6.0 0.62±0.16 0.58±0.19 1.05±0.23 1.03±0.20
Onychin 1.5 0.98±0.21 0.92±0.17 0.96±0.20 0.90±0.22
Onychin 3.0 0.92±0.21 0.90±0.20 0.92±0.15 0.91±0.19
Onychin 6.0 0.63±0.15 059±0.17 0.65±0.16 0.68±0.15
Onychin 12.0 0.42±0.16 0.38±0.12 0.45±0.14 0.39±0.16
·5·　JournalofMedicalForum　Vol.29　No.15　August2008　
胞的凋亡作用呈剂量 -效应关系 ,且各组与空白
对照组凋亡率 0.1%比较有显著性差异 (P﹤
0.05),与顺铂 6.0μmo/L阳性药物对照组作用
24h凋亡率分别为 19%接近 。
图 1　Onychin10μmo/L作用 COC1细胞 24h细胞凋亡率(1:PBS空白对照组;2:Onychin3μmo/L;
　　 3:Onychin6μmo/L;4:Onychin12μmo/L)
3　讨论
目前 ,植物来源的抗肿瘤药较多应用于临床 。
如;长春花及长春碱类 、喜树及喜树碱类 、粗榧及
三类杉酯碱类 、青黛及靛玉红 、冬凌草及冬凌草甲
素 ,马蔺子及马蔺子甲素 、鬼臼及鬼臼毒素类 、紫
杉及紫杉醇 ,而这些抗肿瘤药选择性低 ,存在骨髓
抑制 、严重消化道反应 、心脏毒性等不良反应 。因
此 ,寻求来源广泛 ,选择性高 ,不良反应小的治疗
卵巢癌天然植物药具有临床应用的广阔前景。
肿瘤细胞和其他活细胞一样 , 具有增殖 、分
化 、周期阻滞和凋亡的潜能 ,其每阶段都有特异性
的代谢表型 ,对于凋亡来说 ,这是由多基因控制的
一种主动性细胞自杀过程 [ 4] 。金粉蕨素对两株卵
巢癌细胞增殖具有明显抑制作用 ,存在剂量 -效
应关系和时间 -效应关系 ,即提示金粉蕨素可以
通过抑制细胞增殖而发挥抗肿瘤作用。实验中我
们还通过流式细胞术(FCM)分析发现 , 6μmol·
L-1的金粉蕨素作用 COC1细胞 24h后 , G0/G1期
细胞明显增多 ,且 G1期细胞前出现明显的凋亡
峰 , S期细胞明显减少 ,呈现出明显的 G1期细胞周
期阻滞作用 。从而诱导细胞进入 DNA合成前期 ,
使 DNA合成 受阻。 有研究表 明 cyclinD1,
p21WAF1以及 Rb等 [ 5] 。信号传导途径在细胞通
过 G1期检测点 ,在完成细胞的分裂过程中发挥重
要的作用 。金粉蕨素以何种方式发挥作用 ,还有
待下一步的实验研究。
综上所述 , Onychin具有体外抑制人卵巢癌增
殖和诱导凋亡作用 ,其作用分子机制可能与细胞
周期 G1期阻滞有关 。
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2008-04-26收稿
·6· 　医药论坛杂志　2008年 8月　第 29卷　第 15期