全 文 ：梯度反相高效液相色谱法测定
普通针毛蕨地下部分 Protoapigenone含量
熊朝梅 ,蔡亚玲 ,阮金兰 ,方　伟 ,汤　莹 ,祝　勇 ,周道年 ,彭可垄
(华中科技大学同济医学院药学院 ,武汉　430030)
[摘　要 ] 　目的　建立测定普通针毛蕨地下部分中 Protoapigenone的梯度洗脱反相高效液相色谱法。方法　采用
EurospherC18色谱柱(250 mm× 4.0 mm, 5 μm), 甲醇-水(0.1%磷酸 , pH值 =3.0)为流动相 ,梯度洗脱 , 检测波长 250
nm, 柱温 25 ℃。 结果　Protoapigenone在 7.5 ～ 480.0 mg· mL-1范围里线性关系良好 , 普通针毛蕨地下部分中
Protoapigenone含量为 1.14%, RSD为 3.5%。结论　该法稳定 、简便 ,可用于普通针毛蕨药材的质量控制。
[关键词 ] 　Protoapigenone;针毛蕨;色谱法 , 高效液相;梯度洗脱
[中图分类号 ] 　R286;R927.1 　　　[文献标识码 ] 　A　　　[文章编号 ] 　1004-0781(2009)08-1077-02
　　普通针毛蕨是金星蕨科针毛蕨属植物 , 广泛分布于长江以
南各省 , 向西至四川(峨眉山)和云南东北部(绥江)。该药在民
间被用于治疗水肿和外伤出血 , 具有清热解毒 、去瘰散结的功
效 [ 1] 。最新资料还显示 , 普通针毛蕨中所含有的主要成分
Protoapigenone具有良好的抗肿瘤活性 [ 2 , 3] 。笔者在本实验中首
次建立了普通针毛蕨中 Protoapigenone的高效液相色谱测定法 ,
结果表明 Protoapigenone可以作为评价普通针毛蕨药材质量的
指标成分 , 该方法可用于普通针毛蕨药材的质量控制。
1　仪器与试药　
HITACHI高效液相色谱仪(UVdetectorL-2400, PumpL-
2130), T2000P色谱工作站 , UV-756MC紫外可见分光光度计
(上海精密科学仪器有限公司), SG5200HE超声仪(上海冠特
超声仪器有限公司);Protoapigenone由实验室分离提纯得到(纯
度 >99%), 用于对照品 Protoapigenone提取的药材于 2006年 7
月采自江西庐山 , 经华中科技大学同济医学院药学院张长弓教
授鉴定为普通针毛蕨 Macrothelypteristorresiana的根茎 , 标本
(MCT0714)存放于华中科技大学同济医学院药学院生物标本
室。甲醇为色谱纯 , 磷酸为分析纯 , 水为纯化水 , 0.45 μm微孔
滤膜。
2　方法与结果　
2.1　Protoapigenone的提纯分离与结构鉴定　自然干燥的药材
根茎 4 kg(采自江西庐山)适当粉碎 , 用乙醇渗漉提取 , 60 ℃减
压回收溶剂得浸膏 , 所得浸膏加适量水悬浮 ,依次用石油醚 、乙
醚 、乙酸乙酯 、正丁醇进行萃取分得 4个部位。乙酸乙酯部位
经硅胶柱层析 , 三氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到 F1 ～ F5 5个部分 ,
其中 F1经硅胶柱层析 , 三氯甲烷-甲醇洗脱 , 再经过 Sephadex
LH-20纯化得到化合物 Protoapigenone。 Protoapigenone为淡黄
色粉末 , m.p.:180 ～ 181 ℃。 EI-MSm/z:286[ M] +。1 H-NMR
(600 MHz, DMSO):δ7.01 (2H, d, J=9.6 Hz, H-2′, 6′), δ
[收稿日期 ] 　2008-08-21
[作者简介 ] 　熊朝梅 ,女 ,博士后 ,主要研究方向:药物分析与天然
药物化学。电话:027-63270073, E-mail:cmxiong2002@yahoo.com.cn。
[通讯作者 ] 　阮金兰 , 男 , 教授 , 电话:027-83692311, E-mail:
jinlan8152@163.com。
6.35(2H, d, J=9.6 Hz, H-3′, 5′), δ6.50 (1H, s, H-3), δ
6.19(1H, s, H-6), δ6.19 (1H, s, H-8);13C-NMR(150 MHz,
DMSO):δ168.0(C-2), δ107.1 (C-3), δ182.4 (C-4), δ162.1
(C-5), δ99.8(C-6), δ165.2(C-7), δ94.5(C-8), δ158.0(C-
9), δ104.5(C-10), δ69.5(C-1′), δ148.4(C-2′, 6′), δ185.5
(C-4′), δ 129.4 (C-3′, 5′)。 细 胞毒 性 筛 选 结 果表 明
Protoapigenone具有良好的细胞毒性 , 对肿瘤细胞 HepG2, Tca-
8113, MCF-7, M5, K562的 IC50分别为(2.30 ±0.35), (0.58 ±
0.13), (0.83±0.21), (0.27±0.14), (0.88 ±0.38)。上述实
验结果与文献 [ 2]报道一致。
2.2　色谱条件及系统适应性实验　EurospherC18色谱柱(250
mm×4.0 mm, 5 μm);甲醇(A)-水(含 0.1%磷酸 , pH=3.0)
(B)梯度洗脱:0 ～ 40 min, 30% ～ 65% A;40 ～ 55 min, 65% ～
100% A;流速:1.0 mL· min-1;柱温:25 ℃;检测波长:250 nm。
在上述色谱条件下 , 进样 20 μL, 样品中 Protoapigenone分离度
大于 1.5。
2.3　供试品溶液的制备　将碾细的普通针毛蕨地下部分过筛
孔内径 0.850 mm(20目)筛后减压干燥至恒重 , 精确称取 0.20
g,加 95%乙醇 20mL,超声提取 40 min,过滤并收集提取液 ,重
复上述提取步骤 ,合并提取液并减压蒸干 , 加甲醇使溶解 , 并转
移至 10 mL容量瓶中 , 用甲醇稀释至刻度 , 摇匀 , 用孔径 0.45
μm微孔滤膜过滤 ,取滤液作为供试品溶液。
2.4　对照品溶液的制备　用甲醇精确配置 480.0 mg· L-1
Protoapigenone溶液作为对照品溶液 , 进样前用孔径 0.45 μm微
孔滤膜过滤。
2.5　线性关系考察　采用逐级稀释法 , 配置浓度分别为 240.0,
120.0, 60.0, 30.0, 15.0, 7.5 μg· mL-1的对照品溶液 , 以 20 μL
注入高效液相色谱仪 , 记录峰面积 , 以浓度对峰面积积分值进
行回归处理 ,得标准曲线 Y=18 148X+64 316(r=0.999 9),表
明 Protoapigenone在 7.5 ～ 480.0 mg· L-1范围里线性关系良好。
2.6　精密度实验 　分别采用浓度为 15.0, 120.0, 480.0
mg· L-1低 、中 、高 3个对照品浓度来考察仪器的日内和日间精
密度(n=6),记录峰面积 , RSD均小于 2.5%。
2.7　稳定性实验　将处理完毕的供试品溶液置于室温条件
下 ,分别于 0, 3, 6, 9, 12 h进样分析 ,峰面积 RSD为 1.4%, 表明
·1077·医药导报 2009年 8月第 28卷第 8期
处理后的样品室温放置 12 h内稳定。
2.8　重复性实验　取同一批号的普通针毛蕨地下部分样品约
0.20 g,共 5份 , 准确称定 ,按 “ 2.2”项制备样品 , 进样分析 , 其平
均峰面积为 4 358 081, RSD为 2.5%。
2.9　加样回收率 　精密称取同一批 Protoapigenone含量为
10.9 mg· g-1的普通针毛蕨地下部分粉末 100.0 mg, 共取 5份 ,
分别准确加入 480.0 mg· L-1 Protoapigenone对照品溶液
2.5 mL,按 “ 2.2”项分别制备供试品溶液并测定其中的含量 , 计
算回收率 , 结果见表 1。平均回收率 96.2%, RSD=2.3%。
　　表 1　普通针毛蕨地下部分 Protoapigenone加样回收率实验结果　
取样量 /
mg
样品含量 /
mg
加入量 /
mg
测得量 /
mg
回收率 /
%
100.0 1.09 1.20 2.29 100.0
100.0 1.09 1.20 2.24 95.8
100.0 1.09 1.20 2.22 94.2
100.0 1.09 1.20 2.23 95.0
100.0 1.09 1.20 2.24 95.8
2.10　含量测定　分别吸取对照品溶液 、供试品溶液注入高效
液相色谱仪 , 按上述色谱条件测定 , 以外标法计算样品中
Protoapigenone含量 , 结果见表 2。 平均含量 1.14%, RSD=
3.5%。
3　讨论　
3.1　检测波长的选择　在 190 ～ 850 nm光谱扫描对照品溶液 ,
其最大吸收波长为 250 nm,因此选用 250 nm为检测波长。
3.2　洗脱方式的选择　实验发现 , 当采用不同比例的流动相
等度洗脱时 , 均无法实现 Protoapigenone与相邻物质的分离;而
采用梯度洗脱则可以实现各峰的较好分离。
　表 2　普通针毛蕨地下部分样品中 Protoapigenone含量测定结果　
n=3
样品号 产地 采集时间 含量 /%
1 江西庐山 20070725 1.09
2 江西庐山 20070801 1.12
3 江西庐山 20070810 1.16
4 江西庐山 20070820 1.18
3.3　流动相的选择　笔者在实验中对比了甲醇-水体系和甲
醇-水(0.1%磷酸 , pH值 =3.0)体系的峰型 , 发现后者峰型对
称较好 ,这可能与所加入的磷酸能抑制分析对象电离有关。
3.4　提取方法的考察　以 95%乙醇为萃取溶剂 , 采用超声萃
取(20 mL, 40min,室温)和回流萃取(20 mL, 1 h, 80 ℃)平行多
次提取普通针毛蕨的地下部分 , 结果表明 , 在平行萃取两次后 ,
两种萃取模式对 Protoapigenone的提取率差异无显著性 ,其萃取
率均 >90%。 考虑到操作方便和节约时间 , 选择超声萃取
(20 mL, 40min, 80 ℃,平行萃取两次)为提取方法。
[ DOI] 　10.3870/yydb.2009.08.040
[参考文献 ]
[ 1] 　定恒山.中国药用孢子植物 [ M].上海:上海科学技术出版社 ,
1982:256.
[ 2] 　LINAS, CHANGFR, WUCC, etal.Newcytotoxicflavonoidsfrom
thelypteristorresiana[ J].PlantaMedica, 2005, 71:867-870.
[ 3] 　LINAS, NAKAGAwa-GOTOK, CHANGFR, etal.Firsttotal
synthesisofprotoapigenoneanditsanaloguesaspotentcytotoxic
agents[ J] .JMedChem, 2007, 50:3921-3927.
高效液相色谱法测定野菊花绿原酸含量
陈　靖 1 , 庞燕军 2 , 曹春英 1 , 张　悫 1
(1.沈阳广播电视大学 , 110003;2.辽宁省食品药品检验所 ,沈阳　110023)
[摘　要 ] 　目的　建立测定野菊花中绿原酸含量的高效液相色谱法。方法　流动相为乙腈- 0.4%磷酸溶液(10：
90), 检测波长 327nm, 柱温 30 ℃。结果　绿原酸在 2 ～ 60 μg· mL-1范围内质量浓度与峰面积呈良好线性关系 , 线性回
归方程为 A=1.56×105C-71.99, r=0.999 9,平均回收率为 99.9%(RSD=0.36%)。结论　该法准确度高 ,专属性好 ,
可用于野菊花中绿原酸的含量测定。
[关键词 ] 　野菊花;绿原酸;色谱法 , 高效液相;含量测定
[中图分类号 ] 　 R927.2　　　[文献标识码 ] 　A　　　[文章编号 ] 　1004-0781(2009)08-1078-02
　　野菊花(FlosChrysanthemIndici)为常用中药 ,亦可作茶饮 ,
其性微寒 , 味甘 、苦 , 归肺 、肝经 ,有散风清热 、平肝明目之功效。
用于治疗风热感冒 、头痛眩晕 、目赤肿痛 、眼目昏花 [ 1] 。该药含
[收稿日期 ] 　2008-09-04
[作者简介 ] 　陈　靖(1964-),女 ,副教授 ,学士 ,主要从事分析化
学研究和教学管理工作。电话:024-23218384, E-mail:chenj@sytvu.
cn。
[通讯作者 ] 　张　悫(1959-),男 ,教授 ,学士 ,主要从事分析化学
研究和教学管理工作。电话:024-23218409, E-mail:zhangq@sytvu.cn。
绿原酸 、挥发油 、生物碱及黄酮等多种成分。因其产量高 , 价格
便宜 ,饮用方便 , 作为保健饮料已经广为应用 ,而且有望在新兴
的功能性食品 ,特别是抗衰老食品中发挥作用 [ 2] 。国外最新研
究也发现其提取物有抗 HIV作用 [ 3] 。 国内外学者已在野菊花
的化学成分研究方面作了大量工作 , 其中绿原酸是一类重要成
分 ,具有抑菌利胆作用 [ 4] , 而且绿原酸的药理活性与菊花的功
效相符。笔者在参考有关文献 [ 5 ～ 7]的基础上 ,建立了测定样品
中绿原酸含量的高效液相色谱法。该法准确 、快速 , 专属性强 ,
且有一定的实用价值 , 可作为制订野菊花质量标准的参考。
·1078· HeraldofMedicineVol.28No.8 August2009