全 文 ：·药物研究·
针毛蕨乙醇提取物体外抗氧化活性研究
吴光华1，孙明辉1，魏涵2，阮金兰2
(1．华中科技大学同济医学院附属同济医院药学部，武汉 430030;2． 华中科技大学同济医学院药学院，武汉
430030)
摘 要 目的 研究针毛蕨乙醇提取物总黄酮含量及体外抗氧化活性。方法 体外抗氧化活性采用 ABTS 自由
基、超氧阴离子(O-2·)自由基、H2O2 自由基和羟基自由基(·OH)清除实验;总黄酮含量测定采用芦丁显色法。结果
针毛蕨乙醇提取物表现出较强的自由基清除能力，且在一定范围内呈剂量依赖性。每克针毛蕨乙醇提取物中总黄酮含
量(28． 23 ± 0． 18)mg。结论 针毛蕨乙醇提取物具有一定的体外抗氧化活性。
关键词 针毛蕨提取物;总黄酮;抗氧化活性，体外
中图分类号 R286;R965 文献标识码 A 文章编号 1004－0781(2013)05－0558－04
In vitro Antioxidant Activity of Ethanol Extracts from Macrothelypteris oligophlebia
WU Guang-hua1，SUN Ming-hui1，WEI Han2，RUAN Jin-lan2(1． Department of Pharmacy，Tongji Hospital
Affiliated to Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430030，China;
2． School of Pharmacy，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan
430030，China)
ABSTRACT Objective To investigate the total flavonoid content and in vitro antioxidant ability of the ethanol extract
from Macrothelypteris oligophlebia． Methods The content of total flavonoids was tested by using rutin as atandard product;
antioxidant activity was measured by various established in vitro systems，including 2，2 ＇-azinobis-3-ethylbenzothiazoline-6-
sulphonic acid (ABTS) ，superoxide anion，hydrogen peroxide and hydroxyl radicals． Results The extract exhibited potent
free radical scavenging activity in a dose-dependent manner． The total flavonoid content was (28． 23±0． 18)mg． Conclusion
The ethanol extract posses apparent antioxidant property．
KEY WORDS Ethanol extracts from Macrothelypteris oligophlebia;Total flavonoids;Antioxidant activity，in vitro
针毛蕨(Macrothelypteris oligophlebia)是金星蕨科
(Thelypteridaceae)针毛蕨属植物，分布于长江中下游
及福建、贵州、云南等地。根茎入药，具有利水消肿、清
热解毒、止血、杀虫作用。民间常用于清热、解毒、止
血、消肿、杀虫等症［1］。机体自由基过量时，会产生一
系列损伤，包括脂质过氧化、蛋白质变性、DNA 裂解
等。氧自由基损伤能引起多种疾病，如急性肾衰竭、老
年痴呆、急性肝损伤、心血管疾病等［2-3］。前期研究发
现，针毛蕨乙醇提取物(ethanol extract，EE)主要成分
为黄酮类化合物［4］。黄酮是一类普遍存在于植物中
的多酚类化合物，文献报道黄酮类化合物具有较强的
收稿日期 2012－10－06 修回日期 2012－11－05
基金项目 * 国家自然科学基金资助项目(30973864，
81173065)
作者简介 吴光华(1988－) ，女，河南洛阳人，药师，硕士，
主要研究方向:天然药物活性物质及其作用机制。电话:027－
83663232，E-mail:wgh1988@ 126． com。
通讯作者 阮金兰，男，博士生导师，从事生药资源与品质
评价研究。电话:027－83692611，E-mail:Jinlan8152@ 163． com。
抗氧化能力［5］。目前未见 EE体外抗氧化活性的文献
报道。笔者采用 ABTS 自由基清除、超氧阴离子(O-2
·)自由基清除、过氧化氢(H2O2)自由基清除和羟基
自由基(·OH)清除方法，以维生素 E 为对照品，评价
EE体外自由基清除能力。
1 材料与方法
1． 1 仪器 KQ-100B 超声波清洗器(昆山市超声仪
器 有 限 公 司 ) ，Mellter AE160 型 电 子 天 平
(Switzerland) ，UV-756 Spectrophotometer 紫外可见分
光光度计(上海精密科学仪器厂)。
1． 2 试剂 氮蓝四唑(nitroblue tetrazolium，NBT) ，β-
还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(β-nicotinamide-adenine
dinucleotid，β-NADH) ，辣根过氧化物酶，酚红，D-2-脱
氧核糖，三氯乙酸，硫代巴比妥酸，H2O2，Trolox 购自于
Fluka 化学试剂公司;芦丁标准品购自中国食品药品
检定研究院(批号:100080-200707) ;吩嗪 N-甲硫酸盐
(PMS) ，2，2 ＇- azinobis - 3 - ethylbenzothiazoline-6-
sulphonic acid(ABTS) ，乙二胺四乙酸(ethylene diamine
tetraacetic acid，EDTA)购自 Sigma 化学试剂公司。针
·855· Herald of Medicine Vol. 32 No. 5 May 2013
毛蕨药材采自江西九江，经九江森林植物标本馆馆长
谭策铭鉴定为针毛蕨(Macrothelypteris oligophlebia)根
茎，标本保存于华中科技大学同济医学院药学院标本
室，编号 EC007。
1． 3 EE 的制备 称取干燥粉碎的针毛蕨根茎部分
100 g，加入 75% 乙醇 700 mL，95 ℃回流提取 2 h，合
并滤液，减压回收溶剂，蒸干得 EE。
1． 4 EE中总黄酮的含量测定 以芦丁为标准品绘制
标准曲线，采用亚硝酸钠-三氧化铝-氢氧化钠(NaNO2-
AlCl3-NaOH)方法测定提取物中总黄酮的含量。提取
物稀释一定倍数后，以制定标准曲线相同的方法测定
吸光度值［6］。
1． 5 EE体外抗氧化实验
1． 5． 1 ABTS 自由基清除实验 准确称取 ABTS 粉
末，以无水乙醇配制成 7 mmol·L－1 溶液。同法称取
过硫酸钾，用无水乙醇配制成 2． 45 mmol·L－1 溶液。
两溶液等体积混合，室温下暗室放置 15 h，形成 ABTS+
·储备液。使用时用甲醇按 1∶12 稀释，使其在 734
nm 处吸光度为(0． 70±0． 05)。分别称取适量 EE 和
Trolox，无水乙醇配制成 0． 0，0． 13，0． 25，0． 50，1． 00 和
2． 00 mg·mL－1 溶液。ABTS 工作液 3． 9 mL加入样品
液 0． 1 mL于试管中，混匀，25 ℃反应 10 min，在 734
nm波长处测定吸光度值。以无水乙醇为空白对照，无
水乙醇代替样品溶液为阴性对照，Trolox 为阳性对照。
按照以下公式计算清除率:清除率(%)= ［(A对照品－
A样品)/A对照品］×100%，A样品为样品吸光度值，A对照品为
阴性对照吸光度值［7］。
1． 5． 2 O-2·清除实验 分别称取适量 EE和 Trolox，以
无水乙醇配制成 0． 08，0． 16，0． 33，0． 65，1． 30，2． 60 mg·
mL－1。称取适量磷酸氢二钠和磷酸二氢钠，用纯化水配
制成 100 mmol·L－1pH7． 4 磷酸盐缓冲液(phosphate
buffered solution，PBS)，用配制好的 PBS 配制以下溶
液:156 μmol·L－1NBT，468 μmol·L－1NADH，60 μmol·L－1PMS。
取NADH和NBT各1 mL，样品溶液0．1 mL，加入5 mL 具塞试
管，混匀，加入 PMS0． 1 mL引发反应，室温下反应 5 min，
紫外分光光度计于 560 nm 波长处测定吸光度。以等体
积 PBS代替 PMS，作为空白对照，等体积 PBS 代替样品
溶液，作为阴性对照，Trolox 为标准对照。清除率计算
同“1． 5． 1”项［7］。
1．5．3 H2O2 清除实验 精密称取样品溶液和 Trolox，以
无水乙醇为溶剂，配制样品，浓度分别为 0． 02，0． 04，0． 08，
0． 15，0． 30 和 0． 60 mg·mL－1。用 100 mmol·L－1pH7． 4
PBS为溶剂，配置辣根过氧化物酶-酚红反应溶液(辣根过
氧化物酶 24 U·mL－1，酚红0． 2 mg·mL－1)。精密吸取样
品溶液 0． 1 mL和 4 mmol·L－1 H2O2溶液 0． 4 mL置于 5
mL 试管，加入 PBS 1 mL，混匀，37 °C水浴保温 20 min，加
入辣根过氧化物酶-酚红反应液 1 mL，37 ℃水浴保
温 10 min，加入 1 mol·L－1氢氧化钠溶液 50 μL 终止反
应，在 610 nm 波长处测定吸光度值。以 PBS 为空白对
照，等体积无水乙醇代替样品为阴性对照。Trolox 为对照
物。清除率计算同“1． 5． 1”项［8］。
1． 5． 4 ·OH 清除实验 分别称取适量乙醇总提物
和 Trolox，用无水乙醇配制成 0． 04，0． 08，0． 15，0． 30，
0． 60 和 1． 20 mg·mL－1。分别取不同浓度样品溶液
0． 5 mL 和 Trolox 于 5 mL 试 管 中，依 次 加
入 2 mmol·L－1 邻二氮菲液 0． 5 mL，10 mmol·L－1硫
酸亚铁(FeSO4)0． 1 mL和 0． 012% H2O2溶液 0． 5 mL，
混匀，以 pH7． 4 PBS 定容至 5 mL，37 ℃水浴反应 90
min 后于紫外分光光度计 530 nm 波长处测定吸光
度。以等体积纯化水代替 H2O2溶液作为阴性对照，其
余操作同样品，Trolox 为阳性对照。清除率计算
同“1． 5． 1”项［9］。
2 结果
2． 1 EE中总黄酮含量测定结果 以芦丁为标准品，
吸光度值为纵坐标，不同浓度提取物为横坐标，标准曲
线为 A=0． 050 42X + 0． 007 58，R2 = 0． 996 4。根据标
准曲线，测得每克提取物中总黄酮的含量为(28． 23
±0． 18)mg。
2． 2 EE体外抗氧化作用
2． 2． 1 ABTS 自由基的清除作用 详见图 1。EE 在
0． 06 ～ 2． 00 mg·mL－1 对 ABTS 自由基有较强清除作
用，且呈剂量依赖性。说明 EE 可以作为清除 ABTS
自由基的药物。
图 1 EE与 Trolox清除 ABTS自由基活性曲线图
Fig． 1 Inhibitory curve of EE and Trolox versus the
clearance of ABTS radicals
2． 2． 2 O-2·清除作用 见图 2。0． 08 ～2．60 mg·mL
－1EE
·955·医药导报 2013 年 5 月第 32 卷第 5 期
对O-2·有较强清除作用，且呈剂量依赖性，2．60 mg·mL
－1
时清除率84．2%。说明 EE可以作为清除O-2·的药物。
图 2 EE与 Trolox清除 O-2·活性曲线图
Fig． 2 Inhibitory curve of EE and Trolox versus the
clearance of superoxide anion radicals
2． 2． 3 H2O2 清 除 作 用 见 图 3。 0． 02
～0． 60 mg·mL－1EE对 H2O2 有较强清除作用，且浓度越
高对H2O2 自由基清除作用越强。0． 60 mg·mL
－1时清除
率达 97． 3%，为相同浓度 Trolox 的 1． 06 倍。表明 EE对
H2O2 自由基的清除作用与 Trolox 相当。
图 3 EE与 Trolox清除 H2O2 自由基活性曲线图
Fig． 3 Inhibitory curve of EE and Trolox versus the
clearance of hydrogen peroxide radicals
2． 2． 4 · OH 清 除 作 用 见 图 4。 0． 04
～1． 20 mg·mL－1EE对·OH有较强清除作用，且浓度越
高对·OH 清除作用越强。1． 2 mg·mL－1 时清除
率 78． 3%，相同浓度 Trolox 清除率 73． 0%。表明 EE 对
·OH的清除作用与 Trolox相当。
图 4 EE与 Trolox清除·OH活性曲线图
Fig． 4 Inhibitory curve of EE and Trolox versus the
clearance of hydroxyl radical radicals
3 讨论
自由基由机体在正常代谢过程中产生，一定浓度
时可维持机体正常生理活动，但过多自由基会对机体
细胞和组织造成损伤，加速机体衰老进程并诱发各种
疾病。因此，从自然界寻找可清除氧自由基的天然药
物成为研究热点之一。
ABTS 自由基清除法被广泛用于评估生物活性物
质总抗氧化能力［7］。O-2·在正常生物代谢过程中产
生，可以被体内酶催化代谢，其本身氧化能力很弱，但
可以产生活性极强的·OH 和单电键氢，后两者均可
引起组织损伤［10］。H2O2 自由基本身无活性，但可以
产生活性很强的·OH［10］。·OH 可从不饱和脂肪酸
中夺取氢原子，引起脂质过氧化［11］。
笔者采用 4 种不同的体外抗氧化方法测定 EE 自
由基清除能力。结果表明 EE 具有较强的氧清除自由
基活性，可以作为氧自由基抑制药。
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DOI 10． 3870 /yydb． 2013． 05． 002
姜黄素调控乳腺癌细胞增殖与转移机制研究*
蔡少鑫，陈成，杨熹，李小兰，李兆明，胡俊波
(华中科技大学同济医学院附属同济医院胃肠外科，武汉 430030)
摘 要 目的 研究姜黄素对人乳腺癌细胞 MDA-MB-453 中缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)的影响及其对肿瘤细胞增
殖和转移的作用。方法 采用噻唑蓝(MTT)法和细胞计数观察姜黄素抑制 MDA-MB-453 细胞增生作用;采用 transwell
侵袭小室测定姜黄素对 MDA-MB-453 转移的影响;采用 Real-time PCR和 Western blot 印迹法检测常氧和乏氧状态下姜
黄素对 MDA-MB-453 细胞系中 HIF-1α的 mRNA和蛋白表达水平的影响，同时采用 Real-time PCR和 ELISA法检测姜黄
素对 HIF-1α下游靶基因血管内皮生长因子(VEGF)mRNA水平和蛋白表达水平的影响。结果 姜黄素对 MDA-MB-453
细胞体外生长和转移具有抑制作用;常氧、乏氧状态下加入姜黄素后，MDA-MB-453 细胞系中 HIF-1α的 mRNA水平无变
化，但蛋白水平明显降低，VEGF mRNA水平和蛋白水平均明显降低。结论 姜黄素通过 HIF-1α调控MDA-MB-453 细胞
系增殖和转移。
关键词 姜黄素;乳腺癌;缺氧诱导因子-1α;细胞增殖;细胞转移
中图分类号 R286;R965 文献标识码 A 文章编号 1004－0781(2013)05－0561－04
The Mechanism of Curcumin Inhibitting Breast Cell Proliferation and Migration
CAI Shao-xin， CHEN Cheng， YANG Xi， LI Xiao-lan， LI Zhao-ming， HU Jun-bo (Department of
Gastroenterologic Surgery，Tongji Hospital Affiliated with Tongji Medical College，Huazhong University of
Science and Technology，Wuhan 430030，China)
ABSTRACT Objective To investigate the influence of curcumin on hypoxia-inducible factor R1，α subunit (HIF-1α)
and cell proliferation and migration of the MDA-MB-453 cell line． Methods The effects of curcumin on MDA-MB-453 cell
growth was studied by means of MTT and cell count assay，cell migration analysis was determined by a transwell assay． After cells
were treated with curcumin under normoxia and hypoxia，the mRNA and protein levels of HIF-1α were measured by Real-time
PCR and Western blot，while the mRNA and protein levels of vascular endothelial growth factor (VEGF)were measured by Real-
time PCR and ELISA，respectively． Results Curcumin inhibited cell growth and migration of the MDA-MB-453 cell line．
Being treated with curcumin，either normoxia or hypoxia，the mRNA level of HIF-1α was unchange，while the protein level of
HIF-1α was significantly decreased． Both the mRNA and protein levels of VEGF were obviously down-regulated． Conclusion
Curcumin regulates the proliferation and migration of MDA-MB-453 cells through HIF-1α．
KEY WORDS Curcumin;Breast carcinoma;HIF-1α;Proliferation;Migration
乳腺癌是最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死
亡率占城市女性常见恶性肿瘤第二位，仅次于子宫
癌［1］。乳腺癌主要以手术治疗和术后放化疗为主，但
收稿日期 2012－10－22 修回日期 2012－11－20
基金项目 * 国家 973 计划资助项目(2009CB521802) ;国
家自然科学基金资助项目(30872472，30973496，30800569)
作者简介 蔡少鑫(1986－) ，男，福建泉州人，住院医师，在
读博士，主要研究方向:分子生物学与肿瘤。电话:027 －
83660381，E-mail:csx522@ 163． com。
不断升高的致死率仍使其成为棘手问题。姜黄素是从
中药姜黄根茎中提取的天然化合物，毒理研究认为，姜
黄素无明显毒副作用［2］，且具有抗炎、抗氧化、清除自
由基及抗癌等药理作用［3-4］。已有研究发现，姜黄素能
抑制多种体外培养的肿瘤细胞如食管癌、乳腺癌、肝细
胞癌和肾癌等的生长及增殖，并能诱导细胞凋亡，但姜
黄素对乳腺癌细胞的作用，笔者所见报道较少。故拟
在本研究中观察姜黄素对乳腺癌细胞 MDA-MB-453
增殖、体外侵袭性及其中缺氧诱导因子-1α(hypoxia-
·165·医药导报 2013 年 5 月第 32 卷第 5 期