全 文 ：第 32 卷 第 2 期 暨南大学学报(医学版) Vol． 32 No． 2
2011 年 4 月 Journal of Jinan University(Medicine Edition) Apr． 2011
［收稿日期］ 2011 － 01 － 20
［基金项目］ 广东省自然科学基金项目(10152800001000014)
［作者简介］ 詹海涛(1959 －) ，男，副教授，副主任医师，医学硕士，研究方向:脑血管病的基础与临床
香港远志提取物对大鼠脑缺血再灌注后神经功能、
细胞凋亡及 NOS表达的影响
詹海涛， 李海燕， 孟红旗， 曾煦欣
(佛山科学技术学院 医学院，广东 佛山 528000)
［摘 要］ 目的:探讨香港远志提取物预处理，对大鼠脑缺血再灌注(IR)后神经功能、细胞凋亡及 NOS 表达影
响。方法:SD大鼠随机分 5 组:假手术组、IR 2 h组、IR 24 h组、IR 2 h 治疗组、IR 24 h 治疗组。治疗组 IR 前用香
港远志提取物灌胃 1 周，100 (mg·kg －1)/d，每天 1 次，假手术组、IR组给质量分数为 1%吐温溶液。线栓法致大脑
中动脉闭塞(MCAO)制备大鼠局灶性 IR模型，分别观察 IR 2、24 h神经行为评分(NBS)、神经元凋亡及 nNOS、iNOS
表达。结果:与假手术组比较，IR 组、治疗组在 IR 2、24 h 的 NBS、神经元凋亡及 nNOS、iNOS 表达显著增高(P ＜
0. 01) ;与 IR组比较，治疗组在 IR 2、24 h的 NBS、神经元凋亡及 nNOS、iNOS表达显著降低(P ＜ 0. 05)。结论:香港
远志提取物对大鼠脑缺血再灌注损伤有保护作用，机制可能是下调 nNOS、iNOS的表达，抑制细胞凋亡，改善神经功
能。
［关键词］ 香港远志提取物; 再灌注损伤; 神经功能; 凋亡; 一氧化氮合酶
［中图分类号］ R743;R364． 1 ［文献标志码］ A ［文章编号］ 1000 － 9965(2011)02 － 0205 － 04
Effect of Polygala Hongkongensis Hemsl extracts on the neurological behavior，
neuronal apoptosis and NOS in rats with cerebral ischemia reperfusion
ZHAN Hai-tao， LI Hai-yan， MEN Hong-qi， ZENG Xi-xin
(Medical College，Foshan University，Guangdong Foshan 528000，China)
［Abstract］ Aim:To investigate the effect of Polygala Hongkongensis Hemsl (P H H )extracts on the
neurological behavior、neuronal apoptosis and NOS in rats with cerebral ischemia reperfusion (IR)．
Methods:SD rats were randomly divided into 5 groups，i． e． sham operated group、IR 2 h group、IR 24 h
group、and IR 2 h treated group、IR 24 h treated group． Treated groups received drug respectively accord-
ing to grouping protocol，the sham operated group、IR groups received 1% tween-80 solution． The method
of middle cerebral artery occlusion(MCAO)by thread approach was used to establish the model of focal
brain IR． At the IR 2 h and 24 h，the neurological behavior scores(NBS)、neuronal apoptosis and the ex-
pressions of neuronal nitric oxide synthase(nNOS)、inducibl nitric oxide synthase (iNOS)were ob-
served． Results:At the IR 2 h and 24 h，compared with those of the sham operated group，the NBS、neu-
ronal apoptosis and expressions of nNOS、iNOS were significantly increased in both the IR and treatment
groups(P ＜ 0. 01) ;compared with those of the IR group，the NBS、neuronal apoptosis and expressions of
nNOS、iNOS were significantly decreased in the treated groups (P ＜ 0. 05)． Conclusion:The P H H giv-
en prior to the rats with cerebral IR injury plays a neuroprotective role which may be achieved by decrea-
sing the expression of nNOS、iNOS and inhibiting neuronal apoptosis、improving NBS．
［Key words］ Polygala Hongkongensis Hemsl extracts; reperfusion injury; neurological behavior;
apoptosis; nitric-oxide synthase
急性缺血性脑血管病危害严重，缺血再灌注
(IR)损伤引起的复杂的继发改变，导致脑组织损伤
进一步恶化。如何在发作前给予预适应药物，使脑
组织处于预适应状态，从而产生保护作用，对于防治
缺血性卒中具有重要意义。本研究应用线栓法，建
立大鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)局灶性脑缺血 －再
灌注损伤模型，探讨香港远志提取物预处理，对大鼠
脑 IR后神经功能、细胞凋亡及 NOS 表达的影响，为
临床应用提供研究依据。
1 材料与方法
1． 1 香港远志提取物分离
香港远志全草，粉碎后用质量分数为 70%的甲
醇 65 L回流提取 1. 5 h，共 3 次。合并提取液，减压
回收溶剂，得浸膏悬浮水中，用乙酸乙酯萃取得提取
物(100 g全草萃取 1 g提取物)。
1． 2 动物分组、给药及 IR模型制备
雄性 SD大鼠 60 只，体质量 280 ～ 300g(广东省
医学实验动物中心提供) ，随机分为 5 组，假手术
组、IR 2 h组、IR 24 h 组、IR 2 h 治疗组、IR 24 h 治
疗组，每组 12 只。治疗组 IR 前用香港远志提取物
灌胃 1 周，100 (mg·kg －1)/d，每天 1 次(用时将提
取物以质量分数为 1%吐温溶液配成所需浓度) ，假
手术组、IR组给等量质量分数为 1%吐温溶液灌胃。
各组大鼠室温(23 ～ 25℃)下自由进食、进水。采用
线栓法［1］建立右侧大脑中动脉闭塞(MCAO)模型，
IR及 IR给药组脑缺血 1 h 后拔出线栓，分别行再灌
注 2 h 或 24 h，动物苏醒后对侧肢体运动障碍为造
模成功，假手术组仅分离血管。
1． 3 相关指标测定
(1)神经行为评分(neurological behavior scores，
NBS)测定 采用 Longa 等［1］评分法，评估假手术组
及 IR、IR治疗组 IR 2 h和 IR 24 h NBS。0 分 正常;
1 分 左侧前肢内旋、内收;2 分 左侧抗力下降，行走
向左侧转圈;3 分 行走向左侧倾倒;4 分 无自主活
动。
(2)TUNEL阳性细胞计数 各组大鼠在规定时
间用水合氯醛麻醉，生理盐水、质量分数为 4%多聚
甲醛心脏灌注固定，断头取脑，常规酒精脱水，石蜡
包埋，制 5 μm切片。原位末端标记法(TUNEL 法)
染色标记神经细胞凋亡，按试剂盒说明书要求操作
(购自北京中山生物技术有限公司) ，TUNEL阳性物
质位于胞核中。在 10 × 40 倍光镜下，随机分别取缺
血区周边 5 个视野，计数每个视野阳性细胞数，算出
均数即为每张切片 TUNEL阳性细胞均数。
(3)神经元型一氧化氮合酶、诱导型一氧化氮
合酶阳性细胞计数 标本切片常规脱蜡、水化，按试
剂盒说明书要求操作(兔抗大鼠 NOS单克隆抗体购
自武汉博士德生物工程有限公司，SP法免疫组化试
剂盒购自北京中山生物技术有限公司) ，DAB 呈色
(棕色颗粒位于胞质中为阳性细胞) ，在 10 × 40 倍
光镜下，随机分别取缺血区周边 5 个视野，计数每个
视野阳性细胞数，算出均数即为每张切片 nNOS、iN-
OS阳性细胞均数。
1． 4 统计学分析
采用 SPSS 13. 0 软件进行分析，数据以均数 ±
标准差(珋x ± s)表示，两样本间比较用 t检验，多组间
比较采用方差分析，P ＜ 0. 05 为差异有统计学意义。
2 结果
(1)神经行为评分及 TUNE 阳性细胞测定 假
手术组无神经行为缺损症状，仅有少量 TUNEL 细
胞，IR组与治疗组在 IR 2h及 24 h均出现不同程度
神经行为缺损症状，TUNEL细胞较假手术组显著增
多(P ＜ 0. 01)。治疗组 IR 2h 及 24 h 的 NBS、
TUNEL细胞数，分别显著低于 IR 组相应值(P ＜
0. 05)。
(2)神经元型一氧化氮合酶、诱导型一氧化氮
合酶阳性细胞计数 IR组与治疗组在 IR 2h及 24 h
的 nNOS、iNOS 细胞数较假手术组显著增多(P ＜
0. 01) ，治疗组 IR 2 h 及 24 h 的 nNOS、iNOS 细胞
数，分别显著低于 IR组相应值(P ＜ 0. 01) ，见表 1。
3 讨论
临床采用超早期溶栓治疗缺血性卒中，可快速
恢复局部血供，达到理想治疗效果，但随之出现的
IR损伤将导致脑组织进一步损害。FISHER等［2］认
为通过预防性使用某些药物可减轻 IR损伤程度，达
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表 1 香港远志提取物对大鼠脑缺血 －再灌注 2 h及
24 h NBS、TUNEL、nNOS、iNOS阳性细胞影响(珔x ± s)
组别 n NBS TUNEL细胞计数 nNOS细胞计数 iNOS细胞计数
假手术组 12 0 2． 19 ± 0． 36 2． 37 ± 0． 51 2． 25 ± 0． 47
IR2 h组 12 2． 47 ± 0． 64 18． 63 ± 1． 381) 15． 81 ± 1． 631) 12． 93 ± 1． 351)
IR24 h组 12 2． 85 ± 0． 73 25． 71 ± 1． 831) 17． 25 ± 2． 051) 46． 18 ± 2． 931)
IR2 h治疗组 12 1． 86 ± 0． 452)17． 31 ± 1． 251)2)13． 68 ± 1． 311)3)11． 34 ± 0． 951)3)
IR24 h治疗组 12 2． 16 ± 0． 614)23． 92 ± 1． 471)4)15． 07 ± 1． 591)5)42． 84 ± 2． 471)5)
1)与假手术组比较 P ＜ 0． 01;2)与 IR2 h 组比较 P ＜ 0. 05;3)
与 IR2 h组比较 P ＜ 0. 01;与 IR24 h组比较 4)P ＜ 0. 05;5)P ＜ 0. 01．
到预防性脑保护(prophylactic neuroprotection)作用。
但开发疗效确切、不良反应小、应用方便的预防药
物，仍需大量深入的药物筛选、药效和作用机制研
究。在此领域，中药具有独特的开发应用前景。远
志属的多种植物在文献古籍中具有安神益智作用，
现代药理学研究表明其具有提高学习记忆力、脑保
护和抗痴呆作用。香港远志(Polygala Hongkongen-
sis Hemsl)系远志科(Polygalaceae)远志属植物，在
民间以全草入药，具有活血、化瘀、解毒之功效［3］，
新近的研究证实其具有抗氧化作用［4 － 5］。本研究首
次选用香港远志，观察其乙酸乙酯提取物，对大鼠脑
IR后 2 h 及 24 h 的 NBS、TUNEL、nNOS、iNOS 阳性
细胞数影响，探究其药理性预适应的脑保护作用与
作用机制，为新药开发提供研究资料。
脑缺血急性期的神经元死亡，主要是坏死和凋
亡两种形式，病灶中心区以坏死为主，缺血半暗带主
要出现凋亡，从而导致神经系统功能异常。作为参
与脑组织损伤和发展的重要机制，神经元凋亡倍受
关注。如何调整机体损伤与抗损伤机制，抑制细胞
凋亡进程，减轻脑组织损伤，是临床防治干预的关
键。本研究显示假手术组大鼠无神经行为缺损症
状，仅出现少量神经细胞凋亡。IR 组与治疗组均出
现不同程度神经行为缺损及显著细胞凋亡。提示由
于 IR损伤导致的神经元凋亡，表现出显著的神经功
能障碍。IR 2 h和 IR 24 h的 NBS、神经元凋亡比较
显示，治疗组分别较 IR 组有显著性改善，表明香港
远志提取物预处理，在大鼠脑缺血超早期和急性期，
通过抑制细胞凋亡，改善神经行为缺损，对 IR 损伤
有显著的保护作用。
一氧化氮(NO)作为一种活性很强的自由基，在
中枢神经系统发挥广泛的生理及病理作用［6］，包括
影响能量代谢、DNA 合成、神经突触可塑及信息传
导。过量的 NO抑制呼吸链，导致能量衰竭，引发神
经元死亡，此外，过量的 NO 尚可破坏线粒体膜，促
使凋亡蛋白漏出，诱导神经元凋亡。Bredt等［7］1990
年在大鼠脑组织分离出一氧化氮合酶(NOS) ，目前
认为 NOS 是 NO 生物合成的关键酶，其活性可间接
反映 NO 的生成量。NOS 的神经元型(neuronal
NOS，nNOS)、内皮细胞型(endothelial NOS，eNOS)
和诱导型(inducibl NOS，iNOS) ，在脑缺血损伤的不
同时段，通过各自催化生成的 NO 发挥相应的生理
及病理作用。由 nNOS 和 iNOS 催化生成的大量
NO，参与脑缺血后延迟性细胞死亡和炎症［8 － 9］。有
研究表明，nNOS 被激活后催化生成的 NO，在脑 IR
早期，可能产生神经损伤作用，而在 IR晚期，被诱导
的 iNOS 表达增多，催化生成大量毒性 NO［10 － 11］。
本研究显示，与假手术组比较，IR 组与治疗组在 IR
2 h 的 nNOS、iNOS 表达显著增多，其中 nNOS 的表
达尤其显著。在 IR 24 h，nNOS 表达较 IR 2 h 无显
著增多趋势，iNOS 的表达则随 IR时间延长，进一步
显著增多。这提示本研究 IR 早期出现的神经行为
缺损及神经元凋亡，可能主要是由 nNOS 催化的 NO
所介导;随 IR延长逐渐增多的 iNOS表达，催化大量
毒性 NO，可能导致进一步的神经行为缺损及神经
元凋亡。与 IR 组相应时段比较，治疗组 IR 2 h 及
IR 24 h的 nNOS、iNOS 表达显著下降，表明治疗组
神经行为缺损改善及神经元凋亡减少，是由于香港
远志提取物抑制大鼠脑 IR后神经元 nNOS、iNOS 的
表达。
本研究结果证实，应用香港远志乙酸乙酯提取
物预处理，在大鼠脑缺血的超早期和急性期，对 IR
损伤具备显著的保护作用，其作用机制可能是下调
nNOS、iNOS的表达，延缓或阻止缺血后神经元凋亡
进程，改善神经行为缺损症状，从而发挥有效的药理
性预适应作用。
［参考文献］
［1］ LONGA E Z，WEINSTEINe P R，CARLSON S，et al． Re-
versible middle cerebral artery occlusion without craniec-
tomy in rats［J］． Stroke，1989，20(1) :84 － 91．
［2］ FISHER M，JONAS S，SAUO R L，et al． Prophylactic
neuroprotection for cerebral ischemia［J］． Stroke，1994，25
(6) :1075 － 1080．
［3］ 阴 健，郭力弓． 中药现代研究与临床应用第 3 卷
［M］．北京:学苑出版社，1993:336 － 339．
［4］ WU J F，CHEN S B，GAO J C，et al． Antioxidants and a
new dihydroisocoumarins from Polygala hongkongensis
Hemsl［J］． Natural Prod Res，2007，21(7) :580 － 584．
［5］ WU J F，CHEN S B，GAO J C，et al． Xanthone glycosides
702第 2 期 詹海涛，等:香港远志提取物对大鼠脑缺血再灌注后神经功能、细胞凋亡及 NOS表达的影响
from herbs of Polygala hongkongensis Hemsl and their an-
tioxidant activities［J］． Asian Nat Prod Res，2008，10
(7) :665 － 670．
［6］ SHAHRAKI A，STONE T W． Blockade of presynaptic a-
denosine A1 receptor responses by nitric oxide and super-
oxide in rat hippocampus［J］． Eur J Neurosci，2004，20
(3) :719 － 728．
［7］ BREDT D S． Isolation of nitric oxidesynthetase，a calmo-
drlinrequring enzyme［M］． USA:Proc Natl Acad Sci，
1990:682 － 689．
［8］ NIWA M，INAO S，TAKAYASU M，et al． Time courses of
expression of three nitric oxide synthase isoforms after
transient middle cerebral artery occlusion in rats［J］． Neu-
rol Med Chir，2001，41(2) :63 － 73．
［9］ ZHU D Y，DENG Q，YAO H H，et al． Inducible nitric ox-
ide synthase expression in the ischmic core and penumbra
after transient focal cerebral ischemia in mice［J］． Life
Sci，2002，71(17) :1985 － 1996
［10］ SAMDANI A F，DAWSON T M，DAWSON V L． Nitric
oxide synthase in models of focal ischemia［J］． Stroke，
1997，28(6) :1283 － 1288．
［11］ HIGUCHI Y，HATTORIL F，KUME T，et al． Increase in
nitric oxide in the hypoxic-ischemic neonatalrat brain and
suppression by 7-nitroindazole and aminoguanidine［J］．
Eur J Pharmacol，1998，342(1) :47 － 49．
［责任编辑:陈咏梅］
(上接第 198 页)
［3］ KERBEL R S． Tumor angiogenesis［J］． N Engl J Med，
2008，358(19) :2039 － 2049．
［4］ 蔡小芳，杨筱曦，蔡继业，等． 正常人眼角膜上皮细
胞的原子力显微镜观察［J］． 分析测试学报，2009，28
(8) :881 － 885．
［5］ LYDATAKI S，LESNIEWSKA E，TSILIMBARIS M K，et
al． Observation of the posterior endothelial surface of the
rabbit cornea using atomic force microscopy［J］． Cornea，
2003，22(7) :651 － 664．
［6］ 潘运龙，邱思远，覃 莉，等． 纳米金抑制裸鼠肝癌
血管生成及肝癌生长［J］． 中华医学杂志，2009，89
(12) :800 － 804．
［7］ HUMBERT M，MONTANI D，PERROS F，et al． Endo-
thelial cell dysfunction and cross talk between endothelium
and smooth muscle cells in pulmonary arterial hypertension
［J］． Vascul Pharmacol，2008，49(4 －6) :113 －118．
［8］ BINNIG G，QUATE C F，GERBER C． Atomic force mi-
croscope［J］． Phys Rev Lett，1986，56(9) :930 － 933．
［9］ LEE S，MANDIC J，VAN VLIET K J． Chemomechanical
mapping of ligand-receptor binding kinetics on cells［J］．
Proc Natl Acad Sci U S A，2007，104(23) :9609 －
9614．
［10］ PAN Y L，CAI J Y，LI Q，et al． Atomic Force Micros-
copy-based Cell Nanostructure for Ligand-conjugated
Quantum Dot Endocytosis［J］． Acta Biochimica et Bio-
physica Sinica，2006，38(9) :646 － 652．
［11］ MESTAS J，LEY K． Monocyte-endothelial cell interac-
tions in the development of atherosclerosis［J］． Trends
Cardiovasc Med，2008，18(6) :228 － 232．
［12］ FREDERIX P L，BOSSHART P D，ENGEL A． Atomic
force microscopy of biological membranes［J］． Biophys
J，2009，96(2) :329 － 338．
［责任编辑:陈咏梅］
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