全 文 ：农业生物技术学报 !#$%&’()(*+$,-#’.#$&’(/,.0-1%’+2((((34456738(((95:;((((<=>?<=@
!研究论文!
柿和君迁子 AAB分析技术的建立 C
郭大龙 罗正荣 CC
华中农业大学园艺植物生物学教育部重点实验室#武汉 5<44D4$
摘要%通过搜寻核酸数据库中柿属植物核苷酸序列#利用 AE#.%,F 程序查找微卫星#利用 G$,H0$8G$0H,0$8IJ4 软件设计特异
微卫星引物#并对影响 GKB 扩增的 L+3M&NOPGQ&P&R SOT 聚合酶&引物浓度 6(以及退火温度等因素进行优化’ 最终确定柿
9S,QE2$Q F&F,(:和君迁子9SJ ’.#Q :(AABUGKB 最佳反应体系为%模板 SOT<4(%+#/#))0$(7!#L+3V3JI(HH’WX6NOPGQ(4J3(HH’WX6
P&R((SOT 酶 7(Y#引物 4J关键词%柿)君迁子)AAB)优化
[Q.&\’,Q1H0%.()(AAB(P0-1%,R#0()(S,QE2$Q F&F,((&%N(SJ’.#Q(
]Y^8S&UX%+8888XY^8_10%+UB%+CC
‘028X&\$&.$28)8a$.,-#’.#$&’8G’&%.8/,’+268L,%,Q.$28)8[N#-&.,%68a#&b1%+8T+$,-#’.#$08Y%,c0$Q,.268d#1&%85<44D468K1,%&$
P108%#-’0.,N08Q0R#0%-0Q8)8S,QE2$Q QEEJ8e0$08Q#$c020N8\28[OPB[_8,%8]0%/&%F68[L/X8&%N8SS/!68.108AABQ8e0$08
)#%N8\28.108AE#.%,F6 8.108E$,H0$Q8e0$08N0Q,+%0N8\28G$,H0$8G$0H,0$8IJ46 8&%N8.108)&-.$Q8.1&.8&))0-.0N8.108AABUGKB8$0&-.,%6 8.108
-%-0%.$&.,%8)8L+3f6 8NOPGQ6 8P&R8SOT8E’2H0$&Q06 8E$,H0$Q8&%N8 .108&%%0&’,%+8 .0HE0$&.#$06 8e0$08E.,H,b0NJ 8P108E.,H&’8 $0Q#’.Q8
e0$08&Q8)’’eQ; 8.0HE’&.08SOT8<48%+6 8/#))0$87!6 8L+3f83JI8HH’WX6 8NOPGQ84J38HH’WX6 8P&R SOT8E’2H0$&Q0878Y6 8E$,H0$84J!H’WX8&%N8&%%0&’,%+8.0HE0$&.#$08I48J8P108..&’8c’#H08)8$0&-.,%8e&Q834!!XJ8g.8e,’’8\08#Q0)#’8)$8Q.#N2,%+8+0%0.,-8N,c0$Q,.28&%N8
+0%H080c’#.,%8)8S,NE2$Q8QEEJ
S,QE2$Q F&F,8h8S,QE2$Q ’.#Q8h8AABh8^E.,H,b&.,%
C 基金项目%国家自然科学基金OJ<43D4@3I$(
郭大龙%男#7@D= 年生#在读硕博连读生(
CC 通讯作者( T#1$8)$8-$$0QE%N0%-0J8[UH&,’;﹤’#b1$iH&,’J1b&#J0N#J-%﹥J
888!!收稿日期%344AAB是指以少数几个核苷酸 多数为 3?5 个$
!#$%&’()*+ SOT 序列( AAB 在植物
,-.中随机和均匀分布&按孟德尔方式遗传&共显
性和遗传信息量大#近年在柑桔j7k&葡萄j3k&猕猴桃j苹果 j5k等果树上相继有报道( 其中#/e0$Q 等 jIk用
AAB 分析酿酒葡萄品种间亲缘关系#P0Q.’,% 等 j>k用
AAB 探讨桃品种起源和演化#表明 AAB 在种质起源
与进化研究中具有重要应用价值(为此#我们初步建
立柿和君迁子 //0分析技术#以期为柿属植物分子
进化和系统发育研究提供技术支持(
18888材料和方法
1213333材料
试材均采自华中农业大学果树标本园柿圃( 柿
l S,QE2$Q F&F,$ 品种有罗田甜柿&铜盆柿&富有&
前川次郎&花御所&西村早生&禅寺丸&次郎&阳丰&骏
河和松本早生)君迁子 SJ’.#Q$只用一个单株(
1243333引物设计
参考 a#&%+ 等 jDk 的方法# 用 [OPB[_ 查询
]0%/&%F&[L/X 和 SS/! 中已登录的柿属植物核
mnopq r AE#.%,F8程序查找微卫星序列 #用
G$,H0$8G$0H,0$8IJ4 软件设计特异微卫星引物( 共计
stuv D对 表 7$ (
1253333678提取与分离
按罗正荣等 j=k的方法提取基因组 SOT#紫外分
wxyz{|}~€‚ƒ„… SOT 质量( 稀
释至所需浓度后#置!34(†保存(
1293333:;0扩增
GKB扩增在 GPKU744(GKB 仪上进行( 扩增程序
‡ˆ@5(‰#5(H,%!@5(Š6(7(H,%h(I4(‹6(7(H,%h(D3(Œ6(7(H,%h(
第 !期 郭大龙等! 柿和君迁子 ##$ 分析技术的建立
%&’(’)*+#!,-./&012$ 反应体积 -3! 4%将56-7&
89:;+&:<=!#聚合酶&引物浓度等设置不同的梯度
详见结果与分析部分’ %以确定最佳反应体系$
表 >本实验所用 ##$?;@$ 引物及其序列
:##$?;@$BC10*C+D+*812EF1++ED8(
$%&’’’’()*产物检测
取 >G&上样缓冲液 >份 >3!:HI电泳缓冲液%J
份去离子甲酰胺%加溴酚蓝至 3K&L’与 ;@$产物混
合后在含有 IH 3K&06G04’ 的 >KMN琼脂糖凝胶上
电泳%在 #O9PI9I凝胶成像系统上观察和记录$
+Q结果
+%$’’’’,-+.浓度
由图 >可见%当 56-R浓度在 >K&S-K3S-K& 和 %K3
00T)G4 时均有扩增产物 (56-U浓度为 -K3 和 -K&
00T)G4 时在供试 % 个品种中扩增谱带均清晰且稳
VW 56-X浓度在 >K&00T)G4时% 产物量较少%%K3
00T)G4时背景加深%谱带模糊$所以 56-Y浓度确定
为 -K&00T)G4$
+%+’’’’/0(1浓度
图 -结果显示%不同 89:;+浓度) 3K>S3K-S3K%和
3K!00T)G4’ 扩增结果差异很大$ 在 3K!00T)G4 时
Z[\]^3K%Q00T)G4 时罗田甜柿扩增带较少S Q3K>Q
和 3K-Q00T)G4时扩增效果较好%在 3K-Q00T)G4 时谱
带更为清晰$ 所以 89:;+浓度确定为 3K-Q00T)G4$
+%2’’’’034’!# 聚合酶浓度
从图 % 可以看出%:<=’!#聚合酶在 3K&S Q>K3SQ
>K&和 -K3Q_时均有扩增产物% 但在 3K&Q_ 时谱带模
‘abc>Q_和 >K&Q_ 的扩增结果相似%-K3Q_ 时带较
亮且清晰%但酶量较大时%易出现非特异性扩增$ 所
以从经济稳定考虑%确定 :<=Q!#聚合酶适宜用量
d >Q_G-3e4$
图 >KQ##$ 分析 56-f浓度梯度实验
g16KQ>KQ:F*QE*+EQThQ+*C1*+QThQ56-i’T2’*2EC<2<)(+1+
5SQj4-333Q0SQ-SQ% 分别代表罗田甜柿&花御所和君迁子
m下同nlQ56-o浓度p
QK&lQASQ-K3lQQ’SQ-K&lQ8SQ%K3Q00T)G4$ 5SQj4-333Q0SQ-Q<28Q%SQ
C*BC*+*2EQhTCQ4DTE1<2E1<2+F1SQq<2+<0*Q<+QA*)TslQ:F*Q’T2’*2ECK&lQASQ-K3lQ
’SQ-K&Q<28Q8SQ%K3Q00T)G4K
图 -KQ##$ 分析 89:;+ 浓度梯度实验
g16K-KQ:F*QE*+EQThQ+*C1*+QThQ89:;+Q’T2’*2ECQ12QEF*Q##$Q<2<)(+1+
:F*Q’T2’*2EClQASQ3K-lQ’QSQ3K%Q<28Q8SQ3K!Q00T)G4K
+%5’’’’退火温度
在本研究中%退火温度设定为 !MQu%&3Qv和 &-Q
wSQ&!Qx$ 如图 ! 所示%在 &!Qy时%几乎无扩增产
z{&-Q|和 !MQ}时%谱带较弱(&3Q~时%谱带清晰稳
定$ 因所用为特异引物%在退火温度较高或较低时%
引物都不能很好地结合%所以扩增结果较差$故确定
退火温度为 &3€$
+%&’’’’引物浓度
由图 &可见% 在试验中引物浓度为 3K-S Q3K%Q和
3K!SQ3K&Q!0T)G4时均有扩增产物$ 3K- 和 3K&Q!0T)G4
时 % 扩增产物电泳谱带均较模糊 % 在 3K% 和 3K!Q
!0T)G4时谱带清晰稳定$考虑到引物量过大易形成
引物二聚体%所以确定引物浓度为 3K%Q!0T)G4$
;C10*CQ QQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQ#*=D*2’*
QQjB> QQQQQQQQQQQQQQQ&‚@‚P@@:‚‚P@‚P:PP:P‚P%ƒ
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%M,
农 业 生 物 技 术 学 报 !#$$年
图 %&$’’( 分析 )*+!#$聚合酶浓度梯度实验
,-.&%&$)/0$1021$34$205-02$34$)*+$$678$93:;<05*20$=3>=0>15*1-3>2$
->$1/0$’’($*>*:;2-2
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图 #&$’’( 分析退火温度实验
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图 A&$’’( 分析引物浓度梯度实验
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$->$1/0$’’($*>*:;2-2
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$
%&’((((引物
从数据库中共查询到 QI条核苷酸序列!其中有
R条包含有符合 ’9H1>-S 程序所认可的微卫星序列!
全部设计引物! 并在供试材料中均获得扩增产物
图 T# !但不同引物在不同品种间差别较大$
)&*((((++,反应体系的确立
以上述所确定的各组分条件!用引物 69#在供
U E!个品种和类型中扩增!扩增结果如图 R$ 由图
R可见扩增谱带清晰且具有区别性 678片段$
图 T&$’’( 分析不同引物对实验
,-.&T&$)/0$1021$34$F-44050>1$95-<052$->$1/0$’’($*>*:;2-2
V5-<052?$*D$69EB$CD$69!B$=D$69%B$FD$69#B$0D$69AB$4D$69TB$.D$69R&
图 R&高特异性引物扩增后对中国柿%日本柿
及君迁子区别性扩增片段
,-.&R&)/0$F-2=5-<->*1-W0$*<9:-4-0F$9534-:0$34$/-./$F-44050>1-*:$
’’($95-<05$->$X/->020$9052-<<3>D$Y*9*>020$9052-<<3>$*>F$
6*10$9:H<
ED$罗田甜柿& !D$铜盆柿& %D$君迁子& #D$富有& AD$前川次郎& TD$$西村早
Z[ RD$花御所& ID$禅寺丸& QD$次郎&ED$阳丰& EED$骏河&
E!D$松本早生$
ED$OH31-*>1-*>2/-B$!D$)3>.90>2/-B%D$6*10$9:H\*0S*]*^Y-53HBPTDP7-2/-*^.32/3BPIDPa0>b-<*5HB
PQDPY-53HBEDPc3H/3HBPEEDP’H5H.*BPE!DP\*12H<313^_*20&
综合以上各种因素! 从结果稳定性和经济性出
发! 确立柿和君迁子 ’’(^VX(扩增的最佳反应体系
和反应程序为’ 模板 678%P>.!dH4405PE!!\.!e!&AP
<<3:NO!F7)V2&!P<<3:NO!)*+ 678聚合酶酶 EPG!
fg &%!!<3:NO!反应总体积为 !!!O!退火温度 AP
h$
-PPPP讨论
在特定位点上按孟德尔方式分离的微卫星
678 提供高变的% 选择中性的和共显性的分子标
记$ 因而微卫星分析几乎可以无限制地应用于分子
生态%系统发育与进化研究!在分子标记辅助育种中
%II
第 !期 郭大龙等! 柿和君迁子 ##$ 分析技术的建立
也显示出巨大潜力!#$%% 等&’(将 )*+与其它分子标
记#尤其是与 $%&’$$(’) 和 (%&’ 进行比较%发现
##$ 标记可检测位点多态性水平明显高于 $%&’ 标
记%而且重复性优于 $(’)*与 (%&’ 相比%不同材
料的研究结果略有不同但 (%&’是一种显性标记%
不能获得相关位点的详细信息 因此%##$ 标记丰
富的多态性$高信息量%以及技术的方便性使其表现
出更大的优势
##$分析的关键是引物开发%目前 ##$引物获
得途径主要有!& +’查询核酸序列数据库设计引物
,+-.%& /’使用近缘种中已开发引物,++0+/.%& 1’从 2##$
中发展 ##$引物,+1.%& !’构建基因组文库等,+!.(
采用查询公共核酸数据库获得所研究材料 ##$
345678 ##$ 分析时首选方法%其方法简单且
结果可靠) #9:;<=等,+-.%>=此方法都获得了理想的研究结果
柿属植物 ##$引物开发才刚刚开始 本研究参
考前人在其它植物中已经采用的方法%利用核酸数据
库中核苷酸序列信息设计和筛选了部分引物%主要目
的是先建立起柿属植物 ##$技术体系 本研究所用
材料既有中国柿%又有日本柿%还有柿的近缘种在不
同材料之间%由于所用引物主要是在与乙烯合成有关
酶类的核苷酸序列中筛选的% 故多态性还不是很高
但在本实验所确立的实验条件下%结果表现稳定 一
旦有更多的引物得到开发%##$技术将在柿属植物起
源$进化等多个研究领域得到广泛应用
参 考 文 献
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