全 文 ：不同采样策略对细距堇菜遗传多样性估算的影响
李　昂　王可青　葛　颂＊
(中国科学院植物研究所系统与进化植物学开放研究实验室 , 北京 100093)
摘要:　采用水平淀粉凝胶电泳技术对分布于北京金山 、檀柘寺 、香山 、樱桃沟的细距堇菜(Viola tenuicornis W.
Beck.)的遗传变异和群体分化进行了初步研究。对8 个酶系统 11 个等位酶位点的检测表明 ,该种在上述地区的
遗传变异水平明显高于多年生草本的平均值 ,多态位点百分率 P =72.7%, 等位基因平均数 A=2.4 , 平均期望杂合
度 He=0.243;群体间的遗传分化略小于多年生草本的平均值 , 杂和性基因多样度的比率 Fst=0.196。检测了空间
距离对遗传相似性的影响 ,发现二者无明显的相关性。研究了不同采样方法对遗传学估测的影响 , 表明对该物种
的群体进行取样时每群体取 30株时有较充分的代表性 ,小于 20 个个体的取样可能引起遗传多样性估测出现大的
偏差 ,尤其是 A 和He 2 个指标易受样本大小的影响。
关键词:　等位酶;遗传变异;群体分化;细距堇菜
中图分类号:Q346+.5　　　文献标识码:A　　　文章编号:0577-7496(2000)10-1069-06
Genetic Diversity Within and Among Populations of Viola tenuicornis
with Reference to Sampling Strategies
LI Ang , WANG Ke_Qing , GE Song＊
(Laboratory of Systematic and Evolutionary Botany , Institute of Botany , The Chinese Academy of Sciences , Beijing 100093, China)
Abstract:　Genetic diversity and population differentiation of Viola tenuicornis W.Beck.were studied in
nine populations in Beijing using horizontal starch gel electrophoresis.Allozyme data for 11 loci of 8 enzymes
indicated high level of genetic variability in this region with P=72.7%, A=2.4 and He =0.243.In con-
trast , the population differentiation was lower than the average of other perennial herb with Fst=0.196.It was
found that distances among populations had little effect on population differentiation.A sample of 30 individu-
als could well represent a population , but less than 20 individuals per population might lead to significant bias
in the estimation of genetic parameters , in particular the values of A and He.
Key words:　allozyme;genetic diversity;population differentiation;Viola tenuicornis
　　群体的遗传结构是一个物种最基本的特征之
一 ,与物种自身的进化历史和生物学特性有关 ,同时
也受各种进化因素的影响[ 1] 。尽管 20世纪 60年代
以来 ,酶电泳技术被广泛应用于植物群体遗传学研
究 ,但相对于栽培植物(如农作物 、林木等)来说 ,人
们对大量野生植物遗传多样性和群体遗传结构的认
识还相当不足[ 2 , 3] 。另一方面 , 尽管等位酶技术已
成为遗传多样性检测和群体遗传结构研究中的常规
方法[ 1 ,3 ,4] , 但由于目前利用的等位酶位点仍然有
限 ,群体中取样个体的数目和采样方式会对各种群
体遗传参数的估算产生一定的影响[ 5 , 6] 。因此 ,采样
策略是群体遗传学研究中不可忽视的问题 ,尤其是
对群体和个体数目有限的稀有和濒危物种 ,确定正
确的采样策略对保护措施的制定具有重要意
义[ 6 ,7] 。
细距堇菜为堇菜科堇菜属多年生草本植物 ,分
布范围广 、适应性强 ,我国北方大部分地区 、云南以
及朝鲜 、前苏联远东地区均有分布[ 8] 。由于该属植
物具有特殊的繁殖方式和种子传播机制 ,不少学者
对其开花特性 、花部形态学 、生殖特点 、细胞学和群
体扩散的方式开展了一些初步的研究 ,表明该种为
兼性生殖的二倍体植物(2n=24)[ 8-11] ,但国内外尚
未见到对其遗传多样性的研究。本研究应用等位酶
电泳技术对细距堇菜的遗传多样性和群体遗传结构
进行了初步研究 。与此同时 ,以细距堇菜为材料研
究了不同取样策略对遗传参数估算的影响 。
收稿日期:2000-01-28　接受日期:2000-04-05
基金项目:中国科学院生物和技术研究特支费(财政部专项)(STZ_1_10)。Foundation item:The Grant for Biological Science and Technology , The Chi-
nese Academy of Sciences(STZ_1_10).
＊通讯作者。Author for correspondence.
植　物　学　报　2000 , 42(10):1069-1074 　 　 　 　 　 　 　

Acta Botanica Sinica
1　材料和方法
1.1　采样
于1998年4 ～ 5月从北京金山(T01 、T02)、檀柘
寺(T03)、樱桃沟(T04 、T05 、T06)、香山(T07 、T08 、
T09)的 9个细距堇菜(Viola tenuicornis W.Beck)天然
群体采得 206 株个体 ,进行了等位酶检测 。各群体
采样个体数详见表 2 ,9个采样群体地理分布如图 1
(图中圈的大小与取样面积基本成正比)。
图 1.　细距堇菜采样群体分布图。
Fig.1.　Distribution map of Viola tenuicornis populations sampled
in this study.
The nine populations were sampled in Beijing at Jinshan (T01 and
T02), Tanzhesi(T03), Yingtaogou (T04 , T05 and T06), and
Xiangshan (T07 , T08 and T09)respectively.The circles are in di-
rectly proportional to sample areas in size.
在其中2个群体(T05 、T07)中 ,采用了两种方法
进行群体取样 ,以探讨不同取样方法对群体遗传参
数估算的影响:(1)将采样点划分为并排的 4 或 3
个小块 ,即将群体T05分成面积约 2 m×8 m 的 4块
(个体1 ～ 12 、13 ～ 22 、23 ～ 32 、33 ～ 42),将群体T07
分成约 2 m×8 m 的 3块(个体 1 ～ 13 、14 ～ 23 、24 ～
28)。用每一小块及它们的不同组合分别代表该群
体进行各种参数估算;(2)从群体中分别随机抽取
10 、20 、30个个体来代表该群体进行参数估算 。
1.2　酶的提取 、凝胶电泳和染色
取单株茎上部嫩叶 ,加 1 ～ 2滴 Tris_马来酸提取
液(pH 7.5)在冰上研磨 ,用7 mm×2mm的滤纸小条
蘸吸匀浆液 ,上胶电泳(或保存于-70 ℃超低温冰
箱 ,化冻时加 2%巯基乙醇 ,再上样电泳)。采用水
平板淀粉凝胶电泳技术 ,所用淀粉为美国 Sigma 公
司产品(S_4501),胶的浓度为 12%。所用凝胶缓冲
系统 、酶的组织化学染色方法均根据王中仁[ 12]的方
法稍有改动 。
1.3　等位酶分析及数据处理
等位酶和等位基因的命名如下:酶的缩写字母
代表该酶系统 ,连字符后的数字代表不同位点 ,越靠
近正极的位点以越小的数字表示 。若每个基因位点
有多个等位基因 ,则依照靠近阳极的次序 ,在该位点
数字后面再加上小写英文字母 a 、b 、c等[ 7] 。
遗传多样性以常规的多态位点百分率(P , per-
centage of polymorphic loci)、等位基因平均数(A , av-
erage number of alleles per locus)、平均期望杂合度
(He , average expected heterozygosity)和观察杂合度
(Ho , average observed heterozygosity)来度 量。用
Wright的 F 统计量(Fst)和遗传一致度(I)(genetic
identity)来衡量群体之间遗传分化的大小。
各参数的计算通过 Biosys_1软件来完成 ,其意
义和计算方法详见文献[ 12] 。
2　实验结果
共测定了 8 种酶系统 ,得到了 11个等位酶位
点 。所测酶系统的种类 、编码位点数目和检测所用
的凝胶缓冲系统详见表 1。一些单态位点及多态位
点的电泳谱带式样见图 2。
表 1　电泳检测所用酶系统 、凝胶缓冲系统和位点数目
Table 1　The enzyme systems and electrophoretic data
Enzyme system Abbreviation EC No. Gel buffer1) No.of loci
Aspartate aminotransferase AAT E.C.2.6.1.1 6 2
Diaphorase DIA E.C.1.6.2.2 6 2
Isocitrate dehydrogenase IDH E.C.1.1.1.42 1b 1
Leucine_amino peptidase LAP E.C.3.4.11.1 6 2
Phosphogluconate dehydrogenase PGD E.C.1.1.1.44 1b 1
Phosphoglucoisomerase PGI E.C.5.3.1.9 1b 2
Phosphoglucomutase PGM E.C.2.7.5.1 1b 1
Shikimate dehydrogenase SKD E.C.1.1.1.25 1b 1
1)6 , Borax/Tris_citric acid buffer(pH 8.6);1b , 4 mol/ L citric acid , trisodium salt/ 0.01 mol/ L L_histidine monohydrochloride buffer(pH 7.0).
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图 2.　酶电泳图谱。
Fig.2.　Zymograms of four enzyme systems.
2.1　遗传变异水平和群体分化
对细距堇菜 9个群体的分析表明 ,在所测定的
11个位点中 ,有 3个位点(Idh 、Dia_1 、Pgi_1)是单态
的(只有 1个等位基因),其余 8个位点(Aat 、Dia_2 、
Lap_1 、Lap_2 、Pgd 、Pgi_2 、Pgm 、Skd)是多态的(有 2
个以上等位基因),其中 Lap_1 、Lap_2 和Pgm 有 3个
等位基因;Aat 、Dia_2 和Pgi_2 有 4个等位基因;Pgd
和Skd有 5个等位基因。根据上述等位基因种类和
频率计算出9个群体及总群体的遗传学参数列于表
2。总群体的多态位点百分率(P)为 72.7%,等位基
因平均数(A)为 2.4 ,平均期望杂合度(He)为0.243 ,
固定指数(F)为-0.075。表明总群体中 , 72%左右
的位点是多态的 ,每个位点平均有 2.4个等位基因 ,
若群体为随机交配则会有大约 24%的杂合体 。A
和P 参数 T05 群体均为最大 , T06 群体均为最小 。
杂合位点比率和平均期望杂合度均以 T05为最高 ,
F 值除群体 T07明显大于 0之外 ,其他群体均接近
或小于0 。
　　采用Wright 的 F 统计量来测定群体之间遗传
分化的大小。由表 3可见 , Fst=0.196 , 即在总的
遗传变异中 ,有 19.6%的变异存在于群体之间。计
算出群体两两间的遗传距离和相似性 ,并作出聚类
图(图 3)。差异最大的两个群体为 T08和 T09 ,其相
似性系数为 0.806。
表 3　基因多样性及群体遗传分化
Table 3　Gene diversity and genetic differentiation among 9 popula-
tions at 8 polymorphic loci
Locus F is F it Fst
Aat 0.372 0.508 0.206
Dia_2 0.576 0.605 0.068
Lap_1 0.194 0.238 0.054
Lap_2 0.400 0.556 0.260
Pgd -0.468 -0.308 0.109
Pgi_2 -0.430 -0.280 0.105
Pgm 0.443 0.651 0.374
Skd 0.042 0.394 0.367
Mean -0.096 0.119 0.196
图 3.　群体间遗传相似性图。
Fig.3.　Phenogram of genetic similarity for 9 populations.
表 2　细距堇菜的遗传变异性指标
Table 2　Genetic variability in 9 Viola tenuicornis populations in Beijing
Population N A P Ho He F
T01 25 2.4 45.5 0.255 0.232 -0.099
T02 13 2.0 54.5 0.210 0.212 0.009
T03 26 2.1 45.5 0.290 0.218 -0.330
T04 26 1.7 45.5 0.235 0.189 -0.243
T05 42 2.6 72.7 0.333 0.297 -0.121
T06 11 1.6 36.4 0.204 0.193 -0.057
T07 28 2.2 54.5 0.185 0.255 0.275
T08 20 2.0 45.5 0.181 0.183 0.011
T09 15 1.9 54.5 0.214 0.192 -0.115
Species 206 2.4 72.7 0.226 0.243 -0.075
N , number of enumerated loci;A , average expected het rozygosity;P , percentage of polymorphic loci;He , average expected heterozygosity;Ho , average ob-
served helerozygosity.
10 期 李　昂等:不同采样策略对细距堇菜遗传多样性估算的影响 1071　
　　根据地图估算出各群体间的空间距离 ,遗传相
似性与空间距离二者的相关系数为 0.116 7 ,
t=0.68 , P <0.5 , 说明空间隔离对群体的遗传分
化没有显著影响 。
2.2　取样方法对遗传学参数估测的影响
2.2.1　方法1　将群体T05划分为面积基本相同的
小块(2 m×8 m),从中分别取 1 、2 、3 、4个小块代表
该群体进行遗传学运算 ,所得参数分别对不同样本
组合所覆盖的面积占群体总面积的比例作图(图
4)。可见依样本覆盖群体面积不同 ,各遗传学参数
均有一定变化。样本覆盖面积相同时 ,根据来自不
同部位的样本计算出的结果有很大差异 ,尤其是样
本覆盖面积较小时 ,遗传参数估算值的变化更大 。
群体 T07的处理结果相同。
2.2.2　方法 2　从采样个体较多的 T05群体中 ,按
10 、20 、30个个体 3个级别进行随机抽样 ,来代表该
群体进行遗传学计算 ,每个级别随机重复抽样 10
次。所得结果见图 5。由图可见 ,多态位点百分率
(P)的估算受采样个体数目的影响很小 ,即使在每
群体只采 10 个个体时 ,也能很好地代表整个群体
(只有一次偏离)(图 5 , a)。而 A 和He 的估算受采
样个体的影响很大 ,尤其在取样个体较少时;采样个
体越多 ,估计值也越接近实际(图 5 , b 、c)。
3　讨论
3.1　细距堇菜的遗传变异和群体分化
迄今利用酶电泳技术对许多物种的遗传多样性
和群体遗传结构进行了检测 ,积累了大量资料。据
统计 ,乔灌木的各种多样性指标在所有植物类别中
都是最高的 ,平均多态位点百分率(P)为 75.3%,等
位基因平均数(A)为 2.56;多年生草本植物平均多
态位点百分率(P)为 26.3%,等位基因平均数(A)
为 1.44[ 13] 。本研究结果显示 ,细距堇菜各群体的平
均值 A 为2.4 ,P 为 72.7%,均高出多年生草本的平
均值 ,而接近乔灌木的水平。以 Wright的 Fst来衡
量 ,本种群体间变异占 19.6%,略低于 Hamrick 和
Godt[ 14]统计的多年生草本的平均值23.3%。总群
体F值为负 ,在某些位点(如:Pgd 、Pgi_2)F值的负
图 4.　遗传参数与取样面积之间的关系(图中水平线为根据全部采样个体所得的数值)。
Fig.4.　Correlation between genetic parameters and sampling areas.
The horizontal line indicates the values calculated based on all sampled individuals.The sampling area is divided into four grades , i.e., 1
represents sampling 100% individuals;1/ 4 , 2/4 , and 3/ 4 represent sampling 25%, 50%, and 75% individuals , respectively.A , He , P ,
and F are the same as in Table 2.
1072　 植　物　学　报　　Acta Botanica Sinica 42 卷
图 5.　遗传参数和取样个体数之间的关系(图中水平线为根据全部采样个体所得到的数值 ,实心柱代表标准差 ,柱中横线代
表平均值)。
Fig.5.　Correlation between genetic parameters and sampling numbers.
The horizontal line indicates the values calculated based on all sampled individuals;the column represents the standard errors and the bar rep-
resents the mean.P , A , and He are the same as in Table 2.
偏离尤其明显 ,反映了群体中杂合体过多。由于本
种未观察到克隆繁殖现象 ,因此群体中是否存在某
种杂种优势有待进一步研究。
　　本种较高的遗传变异水平可能与其地理分布广
有关[ 14] 。由于本种分布范围大 ,生长于不同的地理
环境 ,受不同环境选择的机会多 ,因此群体间容易产
生遗传分化 。本种最适生于阴湿环境 ,因此不像其
近缘耐旱种早开堇菜(V.prionatha)那样呈现连续
分布 ,而是在一个大的分布区内形成一些小群体 。
这些小群体因受小环境选择 ,在形态 、等位酶等不同
水平上均产生了不同程度的变异。另外 ,根据汪劲
武等[ 15 ,16]的研究 ,本物种与其近缘种斑叶堇菜(V.
varigata)在形态上存在过渡 ,不排除它们有杂交的
可能 ,这也可能是造成该种遗传多样性高的原因。
基因流是影响群体遗传结构的另一关键因素 。
本种以及堇菜属存在复杂的交配系统 ,春花(完全
花)具有独特的结构以适应虫媒传粉 ,夏花(闭索花)
自花受粉也能结出可育的种子[ 9-11] 。本研究群体
间变异略低于Hamrick和Godt[ 14]统计的多年生草本
的平均值 ,可能与 Hamrick 和 Godt 统计的多为自交
物种而本种为兼性交配有关 。由于植物群体中只
要有少量的异花传粉就能阻止群体出现分化 ,所以
这种行兼性交配的物种其遗传结构与主要为异花传
粉的类群近似[ 1] 。总群体 F 值为负 ,也意味着本物
种以异交为主 。此外 ,本种及其所在属的植物有两
种种子散布机制 ———弹射和由昆虫散布[ 11] 。昆虫
参与种子的传播也可能是造成群体间变异略低的原
因之一 。
选择 、突变和基因流等的共同作用产生了遗传
差异 ,而空间距离并不一定产生遗传差异[ 14] 。如本
研究中群体 T08和 T09之间的遗传差异最大 ,但空
间距离却最近;而群体 T01和 T03之间的差异很小 ,
空间距离却相当大 。这一方面说明 ,即使存在不断
的基因流 ,强有力的选择也能使彼此相距很近的群
10 期 李　昂等:不同采样策略对细距堇菜遗传多样性估算的影响 1073　
体保持遗传上的差别;另一方面也说明 ,当选择作用
不那么明显时 ,只要有很小量的基因流便可有效地
阻止群体分化[ 2 ,17] 。
3.2　取样策略对遗传变异估算的影响
从空间上看 ,样本所覆盖的面积对遗传参数估
算有相当重要的影响 。样本覆盖面积占整个群体面
积的比例越小 ,对遗传参数估算引起的偏差可能越
大。因此 ,在进行群体遗传学研究时 ,首先要注意取
样个体应尽可能选自整个群体而不是其中的某一部
分。另外 ,样本在群体中所处的位置对遗传学参数
的估测也有影响 ,根据来自不同位置而面积相同的
样本计算出的遗传学参数有很大差异。
从取样数量上看 ,本研究得出的初步结果是 ,参
数 P 的估算基本不受个体数的影响 ,而参数 He和A
的估算则随个体数增加而接近实际值。Sjogren 和
Wyoni[ 6]曾就取样个体数对群体遗传学研究的影响
进行了一些计算机模拟 ,认为对于个体数大于 30的
群体 ,采样个体少于 20会低估多态性水平 。本研究
得出类似的结果 ,即对大群体取样时样本数至少应
大于 30才能得到较准确的遗传参数估算值 ,而样本
数小于20时的估算很可能有较大偏差 。另外 ,本研
究认为如果所取样本在空间上无法覆盖整个群体 ,
则增加样本数也可在一定程度上弥补这一缺陷。
致谢:　北京大学的汪劲武教授在采样过程中给予
了耐心的帮助和指导 ,在此表示衷心的感谢。
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(责任编辑:梁　燕)
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