全 文 ：第３６卷第４期
２０１３年１２月
辽宁师范大学学报（自然科学版）
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｉａｏｎｉｎｇ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｅｄｉｔｉｏｎ）
Ｖｏｌ．３６ Ｎｏ．４
Ｄｅｃ． ２０１３
收稿日期：２０１１－０８－２０
作者简介：方鹏（１９７６－ ），男，辽宁铁岭人，铁岭师范高等专科学校副教授．
文章编号：１０００－１７３５（２０１３）０４－０５４３－０５
ｄｏｉ：１０．１１６７９／ｌｓｘｂｌｋ２０１３０４０５４３
山梗菜嫩茎无性系的建立
方 鹏１， 宁淑香２
（１．铁岭师范高等专科学校，辽宁 铁岭 １１２００８；２．辽宁师范大学 生命科学学院，辽宁 大连 １１６０８１）
摘 要：以山梗菜的嫩茎为试验材料，先后对其愈伤组织培养、愈伤组织分化、分化芽生
根和试管苗的栽培进行了研究．结果证明：ＭＳ＋ＫＴ０．２ｍｇ·Ｌ－１＋２，４－Ｄ１．４ｍｇ·Ｌ－１
是愈伤组织诱导培养的理想培养基；１／２ＭＳ＋ＮＡＡ０．１ｍｇ·Ｌ－１＋ＺＴ０．１ｍｇ·Ｌ－１＋
ＡｇＮＯ３０．３ｍｇ·Ｌ－１是愈伤组织分化培养的理想培养基；１／２ＭＳ＋ＮＡＡ０．１ｍｇ·Ｌ－１＋
ＩＡＡ０．２ｍｇ·Ｌ－１＋ＡＢＴ２号１．０ｍｇ·Ｌ－１是试管苗生根继代增殖培养和不定芽生根培
养的适宜培养基．试管苗移栽成活率为９４．２％；定植成活率达到了９９％以上．定植的试
管苗不仅具有野生山梗菜所有植物学性状，而且还能在翌年正常开花结果．
关键词：山梗菜；组织培养；无性系
中图分类号：Ｑ８１３．１２；Ｑ９４９．７８３．２ 文献标志码：Ａ
山梗菜（Ｌｏｂｅｌｉａ ｓｅｓｓｉｌｉｆｏｌｉａ）是桔梗科半边莲属草本植物，在我国东北地区的黑龙江及辽宁的彰
武等地区有分布［１］．全草含有山梗菜碱、山梗菜聚糖、熊果酸等有机成分［２］，具有清热解毒、祛痰止咳、
宜肺化痰等功效，可以治疗感冒发热、咳嗽痰多、肝硬化等疾病［１－２］．虽然目前已有植物组织培养研究的
报道［３－４］，并且有无性系建立的报道［５］，但迄今未见山梗菜无性系建立研究的报道．因山梗菜的药用价
值大，中药的市场需求量也很大，但在辽宁仅彰武地区有少量分布，且多年的药用采挖，已经濒于绝迹，
难以满足作为药材使用的需求．为保护这种野生资源，达到栽培的目的，笔者对其进行建立嫩茎无性系
的研究，以期获得山梗菜的嫩茎试管苗．
１ 材料与方法
１．１ 材料及前处理
将生长于辽宁阜新草甸上的山梗菜挖回后，移栽到花盆中，待生长旺盛后，向植株上连续喷洒３ｄ
２０ｍｇ·Ｌ－１青霉素溶液，将嫩茎采回实验室，作为实验材料．
１．２ 材料灭菌
参见天蓝刺头［６］和益母草［７］组织培养研究．
１．３ 培养条件
参见黄秋葵［８］和翻白草组织培养研究．
１．４ 试验方法
１．４．１ 愈伤组织培养 将无菌嫩茎切成段状后，接种到附加 ＫＴ０．２ｍｇ·Ｌ－１和质量浓度不同的
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ＮＡＡ、ＩＢＡ、２，４－Ｄ的 ＭＳ培养基上培养愈伤组织，进行不同质量浓度生长素对嫩茎愈伤组织培养的影
响试验．这一试验进行２次重复，每一处理接种８０个茎段．
１．４．２ 分化培养 把扩大培养的愈伤组织用解剖针分散为边长约０．３ｃｍ的块状后，接种到附加质量
浓度为ＺＴ０．１ｍｇ·Ｌ－１＋ＡｇＮＯ３０．３ｍｇ·Ｌ－１的１／２ＭＳ、１／２ＭＳ＋ＮＡＡ０．１ｍｇ·Ｌ－１、１／２ＭＳ＋
ＩＡＡ０．１ｍｇ·Ｌ－１、Ｂ５、Ｂ５＋ＮＡＡ０．１ｍｇ·Ｌ－１、Ｂ５＋ＩＡＡ０．１ｍｇ·Ｌ－１、ＬＳ、ＬＳ＋ＮＡＡ０．１ｍｇ·Ｌ－１、
ＬＳ＋ＩＡＡ０．１ｍｇ·Ｌ－１、ＭＳ、ＭＳ＋ＮＡＡ０．１ｍｇ·Ｌ－１、ＭＳ＋ＩＡＡ０．１ｍｇ·Ｌ－１这１２种培养基上，进行
扩大愈伤组织的分化培养．这种培养进行３次重复，每种处理接种８０块愈伤组织．
１．４．３ 芽生根培养 把由分化培养得到的芽从底部取下后，把基部插入基本培养基为１／２ＭＳ＋
ＡＢＴ２号１ｍｇ·Ｌ－１＋ＮＡＡ０．１ｍｇ·Ｌ－１、附加质量浓度各异的ＩＡＡ、ＩＢＡ的培养基上，进行不定芽的
生根培养试验．试验共进行了３次重复，１种处理接种培养的不定芽为１００个．
１．４．４ 生根扩繁培养 把由不定芽培养并生长旺盛的试管苗，剪成包括２个生长点的茎段后，再接种
到１／２ＭＳ＋ＡＢＴ２号１．０ｍｇ·Ｌ－１＋ＮＡＡ０．１ｍｇ·Ｌ－１＋ＩＡＡ０．２ｍｇ·Ｌ－１培养基上，进行试管苗的
生根扩繁培养试验．扩繁培养试验进行２次重复，每次试验相继扩繁６代，每种扩繁培养基培养１００个
茎段．
１．４．５ 试管苗栽植 把继代增殖培养的试管苗用镊子从瓶中拔出后，用在室内已存放２ｄ左右的清
水把附着的培养基洗净，移栽到上半部装有干净炉灰渣的营养钵中．共进行了２次移栽．第一次栽植了
２００株试管苗，第二次栽植了７００株．夏初，把栽植成活的８００株试管苗，定植到铁岭郊区河岸旁．
２ 结果及分析
２．１ 不同质量浓度生长素对愈伤组织诱导培养的影响
接种后定期记录周期，培养至５０ｄ时进行全面统计，结果由表１明确显示，不同种类、不同质量
表１ 不同生长素对嫩茎愈伤组织诱导培养的影响
Ｔａｂｌｅ １ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｕｘｉｎｓ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｋｉｎｄｓ ａｎｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｎ ｃａｌｕｓ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｔｅｎｄｅｒ ｓｔｅｍｓ
ＮＡＡ／（ｍｇ·Ｌ－１） ＩＢＡ／（ｍｇ·Ｌ－１） ２，４－Ｄ／（ｍｇ·Ｌ－１） 诱导数 诱导率／％ 长势
０ ０ ０ ０ ０ －
０．７ ０ ０ ２０ ２５ ＋
１．４ ０ ０ ２１ ２６．２５ ＋
２．１ ０ ０ ４２ ５２．５ ＋
２．８ ０ ０ ３７ ４６．２５ ＋
０ ０．７ ０ ０ ０ －
０ １．４ ０ ０ ０ －
０ ２．１ ０ ０ ０ －
０ ２．８ ０ ０ ０ －
０ ０ ０．７ ４６ ６１．３ ＋＋
０ ０ １．４ ７１ ８８．７５ ＋＋
０ ０ ２．１ ６０ ７３．４ ＋
０ ０ ２．８ ５２ ５５．６ ＋
注：＋＋长势旺盛；＋长势一般；－不生长（下同）
第４期 方 鹏等： 山梗菜嫩茎无性系的建立 ５４５
浓度的生长素对嫩茎愈伤组织诱导培养影响不同．附加不同质量浓度的３种生长素，在附加 ＮＡＡ、
２，４－Ｄ的培养基上，都可以诱导培养材料形成愈伤组织．但从愈伤组织的诱导率和长势看，在２，４－Ｄ质
量浓度不同的培养基上，从诱导率和长势两个主要方面看所培养的愈伤组织都好于ＮＡＡ的培养基．
其中培养效果最好的是质量浓度为１．４ｍｇ·Ｌ－１２，４－Ｄ的培养基，愈伤组织的诱导率达到了８８．７５％，
并且直接外观也显示其愈伤组织的长势旺盛．培养中的观察还显示，在这一质量浓度的２，４－Ｄ的培养
基上，培养１０ｄ，就在大多数嫩茎的切口边缘形成愈伤组织．初期形成的愈伤组织直径约０．１ｃｍ左右，
颜色呈浅黄色；后期愈伤组织生长为半球形，直径约１．５ｃｍ，表面凹凸不平，呈嫩绿色（见图１）．把在
ＭＳ＋ＫＴ０．２ｍｇ·Ｌ－１＋２，４－Ｄ１．４ｍｇ·Ｌ－１培养基中诱导的愈伤组织用镊子在培养瓶中分散为块状
后，接种到相同的培养基上，进行扩大培养．经过４８ｄ一个培养周期的培养，就又会扩大培养出一代颜
色嫩绿的愈伤组织，并且重复试验与首试验的结果一致．以上试验结果显示，诱导山梗菜嫩茎形成愈伤
组织的适宜培养基是 ＭＳ＋ＫＴ０．２ｍｇ·Ｌ－１＋２，４－Ｄ１．４ｍｇ·Ｌ－１．
２．２ 不同培养基对愈伤组织分化培养的影响
３次重复分化培养试验的结果证明，在１／２ＭＳ＋ＮＡＡ０．１ｍｇ·Ｌ－１＋ＺＴ０．１ｍｇ·Ｌ－１＋
ＡｇＮＯ３０．３ｍｇ·Ｌ－１这种培养基分化培养的愈伤组织结果最好，其平均分化率高达９３．２％，并且芽生
长旺盛．统计还证明，分化的不定芽高约０．８ｃｍ，每块愈伤组织平均可分化４．２个不定芽．观察还可以
看出，在这种培养基上，接种培养４０ｄ左右就会在愈伤组织块上分化出数量不等的绿色不定芽（见图
２）．之后，伴随着先分化不定芽的生长，分化率也不断增加，并且同一块愈伤组织上会同时分化出多个
不定芽，从而每块愈伤组织分化生长出一丛不定芽．以上结果明确显示，山梗菜愈伤组织分化培养的适
宜培养基是１／２ＭＳ＋ＮＡＡ０．１ｍｇ·Ｌ－１＋ＺＴ０．１ｍｇ·Ｌ－１＋ＡｇＮＯ３０．３ｍｇ·Ｌ－１．
图１ 茎诱导培养的愈伤组织
Ｆｉｇ．１ Ｃａｌｕｓ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｓｅｐｔｉｃ ｓｔｅｍｓ
图２ 愈伤组织分化出不定芽
Ｆｉｇ．２ Ｃａｌｕｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ ｂｕｄ
２．３ 质量浓度不同的ＩＡＡ、ＩＢＡ对不定芽生根培养的影响
不定芽接种培养３２ｄ统计观察，由表２显示，在包括质量浓度为１．０ｍｇ·Ｌ－１在内和质量浓度低于
１．０ｍｇ·Ｌ－１的２种生长素培养基上都能达到不定芽生根的目的．但在附加ＩＡＡ的质量浓度为０．２ｍｇ·Ｌ－１
时所取得的生根结果最好．不仅试管苗看起来生长旺盛（见图３），而且每株能生出５．７条根，平均生根
率９６％，同时，生根时间早，根色白，株高３．６～５．３ｃｍ．重复的３次试验统计数据表明其结果基本一
致．以上结果显示：１／２ＭＳ＋ＡＢＴ２号１．０ｍｇ·Ｌ－１＋ＮＡＡ ０．１ｍｇ·Ｌ－１＋ＩＡＡ０．２ｍｇ·Ｌ－１为山梗
菜愈伤组织分化芽生根培养的适宜培养基．
５４６ 辽宁师范大学学报（自然科学版） 第３６卷
表２ 不同质量浓度的ＩＡＡ、ＩＢＡ对不定芽生根培养的影响
Ｔａｂｌｅ ２ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ＩＡＡ、ＩＢＡ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｎ ｒｏｏｔｉｎｇ ｏｆ ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ ｂｕｄｓ
ＩＡＡ／（ｍｇ·Ｌ－１）ＩＢＡ／（ｍｇ·Ｌ－１） 生根率／％ 生根数／株 试管苗长势
０ ０ ０ ０ －
０．２ ０ ９６ ５．７ ＋＋
０．４ ０ ７１ ３．２ ＋
０．６ ０ ２３ ２．９ ＋
０．８ ０ １３ １．３ ＋
１．０ ０ ６ ０ ＋
１．２ ０ ０ ０ －
０ ０．２ ３１ １．６ ＋
０ ０．４ ６９ ４．１ ＋
０ ０．６ ３６ ２．０ ＋
０ ０．８ ３３ １．９ ＋
０ １．０ ８ １．２ ＋
０ １．２ ０ ０ －
图３ 生长旺盛的试管苗
Ｆｉｇ．３ Ｔｕｂｅ ｓｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｃａｌｕｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ
２．４ 生根扩繁培养
重复２次的生根扩繁试验，每次继代扩繁６代的
记录统计结果如下：经过３０ｄ为一个扩繁周期的培养，
就会培养出与愈伤组织分化芽生根培养３２ｄ性状一致
的试管苗．以３２ｄ为扩繁一代计算，其繁殖系数为２．８．
这证明，１株试管苗一年中能扩繁出２０多万株试管苗．
除掉扩繁时多种抑制因素的影响，一年内１株试管苗
会培养出１０万株左右的试管苗．这种数量达到了快速
繁殖的目的．以上结果证明：培养基１／２ＭＳ＋ＡＢＴ２号
１．０ｍｇ·Ｌ－１＋ＮＡＡ０．１ｍｇ·Ｌ－１＋ＩＡＡ０．２ｍｇ·Ｌ－１是
生根扩繁培养的适宜培养基．
２．５ 试管苗栽植
移栽了２次，成活８４８株，成活率为９４．２％．定植３０ｄ后统计，共成活８１４株，成活率为９９．３％．对
定植的试管苗定期观察还发现，不仅保持了该植物的所有植物学性状，并且生长旺盛，翌年即可正常开
花结果．
３ 讨论
前人相关研究认为，通过愈伤组织分化的不定芽所培养的试管苗，会发生较大的变异而难以保持
其后代遗传性［１０］．而在本研究中，通过嫩茎愈伤组织所获得的试管苗保持了野生山梗菜所有植物学性
状．这不仅说明山梗菜嫩茎的愈伤组织能保持山梗菜的遗传性，同时也说明本研究所得到的无性系技
第４期 方 鹏等： 山梗菜嫩茎无性系的建立 ５４７
术，对实现山梗菜的栽培和野生资源的保护具有一定的参考价值．
在以往的植物愈伤组织分化研究中［１１］，培养基都加入了较高浓度的细胞分裂素和生长素．本研究的
愈伤组织分化中，虽然也加入了细胞分裂素ＺＴ和生长素ＮＡＡ，但其使用的质量浓度均为０．１ｍｇ·Ｌ－１．
这说明山梗菜愈伤组织分化培养所需要的外源细胞分裂素ＺＴ和生长素ＮＡＡ都很低，这可能与其基
因型有关．也就是说，有的植物愈伤组织在低质量浓度细胞分裂素和生长素的条件下也能分化．
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Ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｃｌｏｎｅ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ Ｌｏｂｅｌｉａ ｓｅｓｓｉｌｉｆｏｌｉａ
ＦＡＮＧ Ｐｅｎｇ１， ＮＩＮＧ Ｓｈｕｘｉａｎｇ２
（１．Ｔｉｅｌｉｎｇ Ｎｏｒｍａｌ Ｃｏｌｅｇｅ，Ｔｉｅｌｉｎｇ １１２００８，Ｃｈｉｎａ；２．Ｃｏｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｌｉａｏｎｉｎｇ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｄａｌｉａｎ １１６０８１，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ，ｔｅｎｄｅｒ ｓｔｅｍｓ ｏｆ Ｌｏｂｅｌｉａ ｓｅｓｓｉｌｉｆｏｌｉａ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ａｓ ｍａｔｅｒｉａｌ
ｔｏ ｄｏ ｔｈｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ ｃａｌｕｓ ｉｎｄｕｃｅｍｅｎｔ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，ｒｏｏｔｉｎｇ ｏｆ ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ ｂｕｄｓ，ｒａｎｓｐｌａｎｔａ－
ｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｂｅ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ ａｎｄ ｓｔａｂｌｅ ｐｌａｎｔｉｎｇ．ＭＳ＋ＫＴ０．２ｍｇ·Ｌ－１＋２，４－Ｄ１．４ｍｇ·Ｌ－１ ｗａｓ ｔｈｅ ｉｄｅａｌ
ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ｃａｌｕｓ ｉｎｄｕｃｉｎｇ；１／２ＭＳ＋ＮＡＡ０．１ｍｇ·Ｌ－１＋ＺＴ０．１ｍｇ·Ｌ－１＋ ＡｇＮＯ３０．３ｍｇ·Ｌ－１
ｗａｓ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｃａｌｕｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ；ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ｒｏｏｔｉｎｇ ｏｆ ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ ｂｕｄｓ ａｎｄ ｒｏｏｔｉｎｇ
ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｗａｓ １／２ＭＳ＋Ｎｏ．ＡＢＴ２ １．０ｍｇ·Ｌ－１＋ＮＡＡ０．１ｍｇ·Ｌ－１＋ＩＡＡ０．２ｍｇ·Ｌ－１．Ｔｈｅ
ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｉｎｇ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｒａｔｅ ｏｆ ｔｕｂｅ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ ｗａｓ ９４．２％ａｎｄ ｓｔａｂｌｅ ｐｌａｎｔｉｎｇ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｒａｔｅ ｗａｓ ９９％．
Ｔｈｅ ｔｕｂｅ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ ｓｔａｂｌｅ ｐｌａｎｔｅｄ ｍａｉｎｔａｉｎｅｄ ａｌ ｂｏｔａｎｙ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅ ｗｉｌｄ Ｌｏｂｅｌｉａ ｓｅｓｓｉｌｉｆｏｌｉａ
ａｎｄ ｂｅａｒｅｄ ｆｏｌｏｗｉｎｇ ｙｅａｒ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｌｏｂｅｌｉａ ｓｅｓｓｉｌｉｆｏｌｉａ；ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ；ｃｌｏｎｅ