全 文 ：书收稿日期:2011-09-23; 修订日期:2011-11-30
基金项目:国家“973”重点基础研究发展计划项目(No． 2006CB504100) ;
广东工业大学校级博士科研启动项目(No． 093002)
作者简介:郑 扬(1986-) ，男(汉族) ，广东潮州人，现为广东工业大学在
读硕士研究生，学士学位，主要从事天然药物化学研究工作．
* 通讯作者简介:张 焜(1963-) ，男(汉族) ，广东罗定人，现任广东工业
大学教授，博士研究生导师，博士学位，主要从事天然药物化学研究工作．
纤维素酶法提取翠云草总黄酮的工艺研究
郑 扬，郑俊霞，颜秋萍，周淑君，方岩雄，赵肃清，杜志云，张 焜*
(广东工业大学轻工化工学院，广东 广州 510006)
摘要:目的 研究纤维素酶法提取翠云草总黄酮的最佳提取工艺。方法 以翠云草总黄酮含量为指标，分别研究了酶用
量、酶解温度、pH值和酶解时间对总黄酮提取率的影响，在此基础上设计了 L9(3
4)正交实验，确定最佳提取工艺。结果
纤维素酶法提取翠云草中总黄酮的最佳工艺条件为:酶用量为 22 U /g，酶解温度为 45℃，pH 值为 5． 0，酶解时间为 60
min。结论 优化后的提取工艺条件合理可行，为翠云草总黄酮的工业化生产提供理论参考依据。
关键词:翠云草; 总黄酮; 提取工艺; 纤维素酶法
DOI标识:doi:10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2012． 04． 031
中图分类号:R284． 2 文献标识码:A 文章编号:1008-0805(2012)04-0859-03
Study on Extraction of Total Flavonoids from Selaginella uncinata (Desv．)Spring with
cellulase
ZHENG Yang，ZHENG Jun-xia，YAN Qiu-ping，ZHOU Shu-jun，FANG Yan-xiong，ZHAO Su-qing，DU Zhi-yun，ZHANG
Kun*
(Faculty of Chemical Engineering and Light Industry，Guangdong University of Technology，Guangzhou
510006，China)
Abstract:Objective To investigate the optimal extraction technology of total flavonoids from Selaginella uncinata (Desv．)
Spring with cellulase． Methods Using the content of flavonoids as the estimative targets，the effects of four factors of cellulose
concentration，hydrolysis temperature，pH and hydrolysis time on the extraction were investigated． On the basis as above，L9(3
4)
orthogonal experiment was designed to optimize the extraction technology of Selaginella uncinata (Desv．)Spring． Results The op-
timum conditions of cellulase enzymatic extraction of total flavonoids with cellulase from Selaginella uncinata (Desv．)Spring were
as follows:concentration was 22U /g，hydrolysis temperature was 45℃，pH was 5． 0，hydrolysis time was 60min． Conclusion The
optimum extraction conditions of cellulase enzymatic extraction are feasible，which can be taken as further theoretical basis for in-
dustrial production of the total flavonoids from Selaginella uncinata (Desv．)Spring．
Key words:Selaginella uncinata; Total flavonoids; Extraction technology; Cellulase method
翠云草为卷柏属植物翠云草 Selaginella uncinata (Desv．)
Spring的全草，主要分布于广西、广东、福建、浙江、安徽及西南各
地。《中药大辞典》记载其味微苦，性寒，具有清热利湿、解毒、消
淤、止血的功效［1］。据文献报道，翠云草的主要化学成分为黄酮
类物质［2，3］。经研究发现，翠云草具有良好的抗缺氧活性，而其
活性成分主要为黄酮类化合物［4 ～ 6］。近年来，纤维素酶提取技术
已在中草药有效成分的提取中得到了越来越多的重视，其原理是
利用纤维素酶破坏植物细胞壁的致密结构，加快药用成分的溶
出，从而提高药物有效成分的提取率［7 ～ 9］。本文采用纤维素酶提
取法，通过单因素实验以总黄酮提取率为指标，分别对酶用量、酶
解温度、pH值、酶解时间等因素进行考察，并通过 L9(3
4)正交实
验设计，优化翠云草总黄酮的提取工艺，为今后翠云草总黄酮的
药用开发提供科学依据。
1 材料与仪器
1． 1 材料与试剂 翠云草干燥全草，2010 年 4 月购于广西南宁
市，经广西中医药研究所赖茂祥教授鉴定为翠云草 Selaginella
uncinata (Desv．)Spring的全草。芦丁标准品购于中国药品生物
制品检定所(批号:100080 － 200707) ;纤维素酶(1 万 U/g)购于
阿拉丁(批号:31530) ;无水乙醇(分析纯) ;水为蒸馏水。
1． 2 仪器 TU － 1901 双光束紫外可见分光光度计(北京普析通
用仪器有限公司) ;A －1000S循环水真空泵(EYELA) ;FA2004 型
电子天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司) ;HWS26 型电热恒
温水浴锅(上海一恒科技有限公司) ;PHSJ － 3F型 pH计(上海雷
磁仪器厂)。
2 方法
2． 1 翠云草总黄酮提取 将翠云草干燥全草粉碎，称取 3g 粉末
(过 40 目筛) ，置于 250 ml圆底烧瓶中，加入 48 ml的纤维素酶水
溶液，并用醋酸 －醋酸钠缓冲溶液调节 pH 值，恒温提取一段时
间后，加入 72 ml的无水乙醇(使最终水溶液的乙醇浓度为 60%，
料液比为 1∶ 40) ，70℃下浸提 1． 5 h。
2． 2 标准溶液的配制 精密称取芦丁标准品 10． 0mg，置于 50 ml
容量瓶中，用 60%的乙醇溶解，定容至刻度，摇匀，静置。
2． 3 样品溶液的配制 样品浸提完毕后抽滤，将滤液转移至 200
ml容量瓶中，用 60%的乙醇定容至刻度，摇匀，静置。
3 结果
3． 1 标准曲线的制备 精密吸取标准溶液 0． 0，1． 0，3． 0，5． 0，
7． 0，8． 0 ml分别置于 6 个 25 ml的容量瓶中，依次加入 5%NaNO2
溶液 1 ml，摇匀，静置 6 min;加 10%Al(NO3)3 溶液 1 ml，摇匀，静
置 6 min;加 4%NaOH溶液 10 ml，摇匀，静置 10 min;用 60%乙醇
稀释至刻度，摇匀，静置 15 min。其中以芦丁标准溶液的 0． 0 ml
为空白对照，于 510 nm波长处测吸光度。以吸光度值 A 作为纵
坐标、溶液浓度 C作为横坐标，绘制标准曲线，得到标准回归曲
线方程:A = 13． 3942C － 0． 006 6，r = 0． 999 8。结果表明，芦丁
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LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2012 VOL． 23 NO． 4 时珍国医国药 2012 年第 23 卷第 4 期
标准溶液在 0． 000 ～ 0． 064 mg /ml范围内线性关系良好。
3． 2 样品的测定 精密吸取样品溶液 8． 0 ml，置于 25 ml容量瓶
中，按“3． 1”项操作，经静置显色后，于 510 nm波长处测吸光度。
3． 3 单因素实验
3． 3． 1 酶用量对翠云草总黄酮提取率的影响 在酶解温度为
50℃，pH值为 5． 0，酶解时间为 90 min 的条件下，考察酶用量分
别为:4(酶活力 /底物质量) ，6 10，16，22，28 U /g 对翠云草总黄
酮提取率的影响。结果如图 1 所示。酶用量达到 16U /g 时的总
黄酮提取率最高，当酶用量大于 16 U /g 时，总黄酮含量变化不
大，故把酶用量因素的考察水平定为:10，16，22 U /g。
图 1 酶用量对翠云草总黄酮提取率的影响
3． 3． 2 酶解温度对翠云草总黄酮提取率的影响 在酶用量为 16
U /g，pH值为 5． 0，酶解时间为 90min的条件下，分别考察酶解温
度为 40，45，50，55，60℃对翠云草总黄酮提取率的影响。结果如
图 2。从结果可知:提取温度大于或者小于 50℃时，总黄酮提取
率均呈下降趋势，故把酶解温度因素的考察水平定为:45，50，
55℃。
图 2 酶解温度对翠云草总黄酮提取率的影响
3． 3． 3 pH值对翠云草总黄酮提取率的影响 在酶用量为 16 U /
g，酶解温度为 50℃，酶解时间为 90 min 的条件下，分别考察 pH
值为 4． 0，4． 5，5． 0，5． 5，6． 0 对翠云草总黄酮提取率的影响。结
果如图 3。从结果可知，当 pH值 5． 0 时，提取率最高，当 pH值比
5． 0 大或者小时，总黄酮的含量呈下降趋势，故把 pH值因素的考
察水平定为:4． 5，5． 0，5． 5。
图 3 pH值对翠云草总黄酮提取率的影响
3． 3． 4 酶解时间对翠云草总黄酮提取率的影响 在酶用量为 16
U /g，酶解温度为 50℃，pH 为 5． 0 的条件下，分别考察提取时间
30，60，90，120 min及 150 min对翠云草总黄酮提取率的影响。结
果如图 4。可知:90 min 以后总黄酮提取率变化不大，故把酶解
时间因素的考察水平定为:60，90，120 min。
图 4 酶解时间对翠云草总黄酮提取率的影响
3． 4 正交实验
3． 4． 1 正交实验的设计 在单因素实验结果的基础上，考察酶用
量(A)、酶解温度(B)、pH(C)、酶解时间(D)4 种因素对翠云草
总黄酮提取率的影响，按 L9(3
4)正交表进行实验，以总黄酮提取
率作为考察指标，优化提取工艺条件。因素水平表见表 1。
表 1 因素水平
水 平
A
酶用量 C /U·g － 1
B
酶解温度 T /℃
C
pH值
D
酶解时间 t /min
1 10 45 4． 5 60
2 16 50 5． 0 90
3 22 55 5． 5 120
3． 4． 2 正交实验的结果 正交实验设计及方差分析结果见表
2 ～ 3。从极差 R分析可知，各因素对翠云草总黄酮提取率的影响
程度依次为:酶解时间 ＞ pH值 ＞酶用量 ＞酶解温度，最佳工艺条
件为:A3B1C2D1。根据最佳工艺条件重复提取 3 次，总黄酮提取
率分别为:0． 626%，0． 620%，0． 634%，平均提取率为 0． 627%，
RSD = 1． 121%，结果均高于表 2 中任何一次实验结果，证明该工
艺条件稳定可行。从方差分析知，酶解时间达到极显著水平，即
酶解时间对翠云草总黄酮的提取有极显著性影响，而其他因素影
响不显著。
表 2 正交实验设计及结果
试验号 A B C D 总黄酮提取率(%)
1 1 1 1 1 0． 615
2 1 2 2 2 0． 582
3 1 3 3 3 0． 543
4 2 1 2 3 0． 543
5 2 2 3 1 0． 609
6 2 3 1 2 0． 565
7 3 1 3 2 0． 588
8 3 2 1 3 0． 534
9 3 3 2 1 0． 621
K1 1． 740 1． 746 1． 714 1． 845
K2 1． 717 1． 725 1． 746 1． 735
K3 1． 743 1． 729 1． 740 1． 620
R 0． 026 0． 021 0． 032 0． 225
表 3 方差分析结果
方差来源 离差平方和 自由度 方差 F P 显著性
A 0． 000 13 2 0． 000 07 1． 627
B 0． 000 08 2 0． 000 04 1． 000 ＜ 0． 01 ＊＊
C 0． 000 19 2 0． 000 10 2． 327
D 0． 008 44 2 0． 004 22 101． 810
F0． 05(2，2)= 19． 00，F0． 01(2，2)=99． 000
4 结论
通过正交实验得到翠云草总黄酮的最佳提取工艺条件为:酶
用量为 22 U /g，酶提取温度为 45℃，pH值为 5． 0，酶解时间为 60
min。各提取因素的影响程度依次为:酶解时间 ＞ pH值 ＞酶用量
＞酶解温度，其中酶解时间对翠云草总黄酮的提取有极显著性的
影响。
中草药的酶法提取，工艺合理可行，操作简便，与传统的乙醇
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时珍国医国药 2012 年第 23 卷第 4 期 LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2012 VOL． 23 NO． 4
回流提取法相比，具有提取时间短、能耗小、成本低等优点，这为
今后中草药药用成分的深入研究以及中草药提取的工业化生产
提供了科学的参考依据。
参考文献:
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研究［J］．中草药，2006，，37(11) :1645．
收稿日期:2011-06-01; 修订日期:2011-11-11
基金项目:国家自然科学基金(No． 81001529) ;
山东省自然科学基金(No． Q2008C18)
作者简介:于 波(1976-) ，男(汉族) ，山东平原人，现任山东中医药大学
附属医院主治医师，博士学位，主要从事关节与骨折内固定的基础临床研
究工作．
复元活血汤对骨折大鼠
转化生长因子 β1 表达的作用研究
于 波，张 恒，谢 进
(山东中医药大学附属医院，山东 济南 250011)
摘要:目的 观察复元活血汤对骨折 SD大鼠生长因子 － β1(TGF － β1)mRNA 及蛋白表达的影响。方法 建立 SD 大鼠
开放性的股骨干骨折髓内固定模型，随机分组设立骨折后 3，7，14，21 d 4 个时相点。大鼠灌服 1 g /ml复元活血汤药液 2
ml，每天两次。取骨痂组织，通过 RT － PCR、ELISA法检测 TGF － β1 的表达。结果 TGF － β1 基因表达在骨折愈合的不同
阶段不同，并且高于生理盐水组。结论 复元活血汤能刺激骨折 SD 大鼠 TGF － β1 mRNA 及蛋白表达，能促进骨折的愈
合。
关键词:元复活血汤; 骨折; 生长因子 － β1
DOI标识:doi:10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2012． 04． 032
中图分类号:R285． 5 文献标识码:A 文章编号:1008-0805(2012)04-0861-03
Effects of Fuyuan Huoxue Tang on Expression of Transforming Growth Factor Beta 1 in
Rat Fracture Model
YU Bo，ZHANG Heng，XIE Jin
(The First Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250011，China)
Abstract:Objective To observe the effects of Fuyuan Huoxue Tang on expression of TGF － β1 mRNA and protein in rat fracture
model． Methods Kirschner wires were fixed in the bone marrow of the midshaft femur with the standadzed open fracture in SD
rats． The rats were randomly and equally divided into treatment group and saline group，further，each group was assigned into 4
points (3，7，14，21 days after fracture )． The rats in treatment group were administered Fuyuan Huoxue Tang ，2ml per day in two
administrations． Specimens of bony calluses were collected on the 3 rd，7 th，14 th，21 st days after fracture and the expression of
TGF － β1 was detected by RT － PCR and enzyme － linked immunosorbent assay． Result The expression of TGF － β1 was in-
creased to the first peak on the 3rd day after fracture ，but appeared a low point on the 7th day，and returned to the peak in the sec-
ond week，then decreased later． The expression of TGF － β1 mRNA was higher than that in saline group． Conclusion Fuyuan
Huoxue Tang can increase the expression TGF － β1 in bony callus of rats with early fracture ，and promote the fracture healing．
Key words:Fuyuan Huoxue Tang; Fracture; Growth Factor Beta 1
中医药治疗骨折历史悠久，效果独特。复元活血汤出自《医
学发明》，是目前骨伤科常用的一首方剂，具有活血祛瘀、疏肝通
络等作用。中医认为“血不活则骨不能接”，骨折局部血液循环
与骨折愈合的关系尤为重要。现代医学表明影响骨折愈合最根
本的因素是局部的血液供应，一切影响血液供应的因素，都会直
接影响骨折愈合过程。因此研究活血化瘀方药对骨折修复性细
胞因子的增殖和调控作用对探索中药促进骨折愈合的机制有着
非常重要的意义。
1 材料与仪器
1． 1 动物 清洁级健康 3 个月龄雄性 SD大鼠 48 只，体质量(280
± 20)g，由山东大学实验动物中心提供(实验动物合格证号:
SCXK鲁 20030004)。
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