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广西医科大学学报　２０１４Ｊｕｎ；３１（３）
＊基金项目：广西壮族自治区卫生厅中医药科技专项资助项目
（Ｎｏ．ＧＺＺＹ１３－３０）
△通信作者，Ｔｅｌ：（０７７１）３１３００６４，Ｅ－ｍａｉｌ：ｈｒｓ．３１３００６４＠１６３．ｃｏｍ
１广西民族医药研究院　南宁　５３０００１
收稿日期：２０１４－０１－０３
ＨＰＬＣ测定山牡荆中蜕皮甾酮含量的方法研究＊
竺　勇　黄瑞松１△　李耀华
（广西中医药大学药学院　南宁　５３０００１）
摘要　目的：建立壮、瑶药山牡荆中蜕皮甾酮的含量测定方法，为该药材质量标准制订提供依据。方法：采用高效液相色谱法，
摸索确定色谱条件；采用Ｌ９（３４）正交设计方法优化供试品溶液制备方法。结果：ＨＰＬＣ色谱条件：检测波长为２４７ｎｍ，色谱柱
为Ｇｅｍｉｎｉ　Ｃ１８（２５０ｍｍ×４．６ｍｍ，５μｍ），柱温为３０℃，流动相为乙腈—水（１８∶８２），流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ供试品溶液制备方法：
药材破碎度为过四号筛的粉末，提取溶剂为５０％甲醇，超声提取时间为６０ｍｉｎ。结论：建立的山牡荆药材蜕皮甾酮含量测定方
法简便可行，准确性和重复性好，可作为山牡荆质量评价和控制的方法。
关键词　山牡荆；蜕皮甾酮；ＨＰＬＣ
中图分类号：Ｒ９２７．２　　　文献标志码：Ａ　　　文章编号：１００５－９３０Ｘ（２０１４）０３－０３７７－０３
　　山牡荆亦称五指风，为广西特色壮、瑶药材，系马鞭草科
植物山牡荆Ｖｉｔｅｘ　ｑｕｉｎａｔａ（Ｌｏｕｒ．）Ｗｉｌ的干燥根和茎。本品
在我国主要分布于东南及华南各省，广西区内则多分布于南
宁、临桂、永福、梧州、藤县、贵港、平南、容县、北流、昭平、河
池、罗城、金秀和龙州等地［１，２］。壮、瑶族民间认为，山牡荆具
有止咳定喘，镇静退热之功，常用于治疗急慢性支气管炎［３］，
瑶医还用于治疗风湿性关节炎、肾炎。广西梧州中恒集团以
山牡荆为原料药材，生产的成药制剂“肾炎安胶囊”主要用于
治疗急性肾盂肾炎、尿路感染、慢性肾炎。文献报道，山牡荆
主要含黄酮类及蜕皮激素类成分［４］，其中蜕皮甾酮具有多种
药理学作用［３～６］，可促进 ＲＮＡ 和蛋白质的合成，影响糖代
谢，促进脂类代谢，免疫调节，影响中枢神经系统，促进动物
蜕皮、驱虫等功效，为该药材的主要有效成分之一。过去有
关山牡荆的质量评价和控制的方法研究甚少，致使该药材质
量未能得到有效控制，影响到临床用药的安全有效。为使山
牡荆药材质量可控，利于进一步开发利用，本文采用了
ＨＰＬＣ法对山牡荆中蜕皮甾酮含量测定方法中的色谱条件、
供试品溶液制备方法等进行研究，建立了山牡荆中蜕皮甾酮
的含量测定方法，为该药材质量标准的建立提供参考。
１　仪器与材料
１．１　仪器：Ａｇｉｌｅｎｔ１１００高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有
限公司）；ＬＣ－２０ＡＴ高效液相色谱仪（日本岛津公司）；ＳＨＩ－
ＭＡＤＺＵ　ＵＶ－２４０１ＰＣ紫外分光光度仪（日本岛津公司）；
１／１０５电子分析天平Ｘ２０５ＢＤＵ（瑞士梅特勒公司）；ＥＡＳＹＰＵ－
·７７３·池小钜，等 ．体外扩增ＣＩＫ细胞对结肠癌ＳＷ４８０细胞株杀伤作用的研究
DOI:10.16190/j.cnki.45-1211/r.2014.03.004
ＲＥⅡ超纯水器（美国热电公司）；ＴＧＬ－１６Ｇ高速离心机（上
海安亭科学仪器厂）；ＳＢ３２００ＤＴＳ双频超声清洗仪（宁波新芝
生物科技股份有限公司）。
１．２　材料：实验用药材共３批，分别采自广西药用植物园、
广西鹿寨县、广西龙州县，其中采集于广西药用植物园药材
的对应蜡叶标本经广西植物研究所韦发南研究员和广西食
品药品检验所黄燮才主任药师鉴定为马鞭草科植物山牡荆
Ｖｉｔｅｘ　ｑｕｉｎａｔａ（Ｌｏｕｒ．）Ｗｉｌ；蜕皮甾酮对照品为中国食品药品
检定研究院提供（批号１１１６３８－２００６０３）；流动相所用甲醇和
乙腈均为色谱纯（美国Ｆｉｓｈｅｒ公司），水为超纯水，其余试剂
均为分析纯。
２　方法与结果
２．１　色谱条件的摸索
２．１．１　检测波长的选择：取蜕皮甾酮对照品甲醇溶液，利用
紫外分光光度计在２００～６００ｎｍ波长范围内进行了光谱扫
描。结果：蜕皮甾酮对照品甲醇溶液在２４７ｎｍ处有最大吸
收峰，故确定本品的检测波长为２４７ｎｍ，见图１。
图１　蜕皮甾酮甲醇溶液紫外光谱扫描图
２．１．２　色谱柱的选择：同一色谱条件下，分别对 Ｗｅｌｃｈ　Ｃｏｌ－
ｕｍｎ　Ｃ１８、Ｉｎｅｒｔｓｉｌ　ＯＤＳ－３Ｃ１８和Ｇｅｍｉｎｉ　Ｃ１８３条色谱柱（规格均
为４．６ｍｍ×２５０ｍｍ，５μｍ）进行比较，结果：上述３条色谱柱
分离效果均较理想。本文采用其中的Ｇｅｍｉｎｉ　Ｃ１８色谱柱进行
实验。
２．１．３　 流 动 相 的 选 择：同 一 色 谱 条 件 下，以 乙 腈—水
（１８∶８２）、甲醇—水（４０∶６０）、甲醇—水（２０∶８０）３种流动相
进行比较。结果：以乙腈—水（１８∶８２）为流动相色谱分离效
果理想，蜕皮甾酮峰保留时间适中；甲醇—水系统色谱分离
效果较差。故本文使用乙腈—水（１８∶８２）为流动相。
２．１．４　理论板数的确定：经对３批药材样品进行测定，样品
中蜕皮甾酮峰的理论塔板数均大于８　０００。故本方法理论板
数按蜕皮甾酮峰计应不低于８　０００。
２．２　供试品溶液制备方法的确定
２．２．１　提取方法的摸索：取同一样品粉末２份各０．５ｇ，精
密称定，分别精密加入５０％甲醇２０ｍＬ，精密称重。其中一
份加热回流３０ｍｉｎ，另一份超声处理３０ｍｉｎ，放至室温，再精
密称定重量，用５０％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续
滤液，进样测定蜕皮甾酮含量。结果：加热回流提取蜕皮甾
酮得率为０．３２％，超声提取为０．３０％，两者含量相近。考虑
到超声提取操作简易，故初步确定提取方法为超声处理。
２．２．２　提取溶剂的摸索：取同一样品粉末２份各０．５ｇ，精密
称定，其中一份精密加入５０％甲醇２０ｍＬ，另一份精密加入
５０％乙醇２０ｍＬ，称定重量，超声提取３０ｍｉｎ，放至室温，再称
定重量，用相应溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液
进样测定。结果：５０％甲醇提取蜕皮甾酮得率为０．３３％，
５０％乙醇提取得率为０．２８％，５０％甲醇提取得率高于５０％乙
醇。故初步确定提取溶剂为５０％甲醇。
２．２．３　提取条件的优化：采用正交试验方法，选择药材破碎
度（Ａ）、甲醇浓度（Ｂ）、提取时间（Ｃ）作为考察因素，因素水
平，见表１。选用Ｌ９（３４）正交表设计，以蜕皮甾酮得率作为考
察指标，优化甲醇超声提取的条件，结果见表２和表３。
表１　甲醇超声提取因素水平
水平
因素
Ａ（筛号） Ｂ（％） Ｃ（ｔ／ｍｉｎ）
１ 过二号筛 ５０　 ３０
２ 过三号筛 ７５　 ４５
３ 过四号筛 １００　 ６０
表２　正交试验与结果
列号 Ａ　 Ｂ　 Ｃ　 Ｄ　 Ｙ１（％）
１　 １　 １　 １　 １　 ０．０２９　８
２　 １　 ２　 ２　 ２　 ０．０３４　１
３　 １　 ３　 ３　 ３　 ０．０３３　１
４　 ２　 １　 ２　 ３　 ０．０５２　６
５　 ２　 ２　 ３　 １　 ０．０５６　６
６　 ２　 ３　 １　 ２　 ０．０４１　８
７　 ３　 １　 ３　 ２　 ０．２１８　９
８　 ３　 ２　 １　 ３　 ０．２０２　３
９　 ３　 ３　 ２　 １　 ０．２０６　２
珡Ｋ１ ０．０３２　４　 ０．１００　４　 ０．０９１　３　 ０．０９７　５
珡Ｋ２ ０．０５０　３　 ０．０９７　７　 ０．０９７　６　 ０．０９８　３
珡Ｋ３ ０．２０９　１　 ０．０９３　７　 ０．１０２　９　 ０．０９６　０
Ｒ　 ０．１７６　７　 ０．００６　７　 ０．０１１　６　 ０．００２　３
表３　方差分析
方差
来源
离均差
平方和
自由度 Ｆ　 Ｐ
Ａ　 ０．５６８　１　 ２　 ６　９５４．９ ＜０．０１
Ｂ　 ０．０００　７　 ２　 ８．４４ ＞０．０５
Ｃ　 ０．００２　０　 ２　 ２４．６５ ＜０．０５
误差 ０．０００　１　 ２
总计 ０．５７０　９　 ８
　　　　注：Ｆ０．０１（２，２）＝９９．０１，Ｆ０．０５（２，２）＝１９．００
２．２．４　提取条件的确定：由表３可知，影响蜕皮甾酮得率的
因素大小顺序为：Ａ＞Ｃ＞Ｂ，其中 Ａ、Ｃ两因素对蜕皮甾酮得
·８７３· 广西医科大学学报　２０１４Ｊｕｎ；３１（３）
率的影响差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。因此，确定最佳提
取条件为Ａ３Ｂ１Ｃ３，即药材粉碎为过四号筛的粉末，以５０％甲
醇作为提取溶剂，超声提取６０ｍｉｎ。
２．３　溶液的制备：取蜕皮甾酮对照品适量，精密称定，加
５０％甲醇制成每１ｍＬ含１００μｇ的溶液，作为对照品溶液；
取本品粉末（过四号筛）１ｇ，精密称定，置具塞瓶中，精密加入
５０％甲醇溶液２０ｍＬ，称定重量，超声６０ｍｉｎ，放冷，再称定重
量，以５０％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为
供试品溶液；另取５０％甲醇溶液作为阴性对照溶液。
２．４　专属性试验：精密吸取上述对照品溶液、供试品溶液和
阴性对照溶液各１０μＬ，进样，测定。结果：供试品溶液的色
谱图在与对照品溶液色谱图相应位置上，有相同保留时间的
吸收峰，阴性对照溶溶色谱图则无相应吸收峰。说明本方法
测定山牡荆蜕皮甾酮含量专属性强，无阴性干扰，见图２。
图２　蜕皮甾酮 ＨＰＬＣ图谱
Ａ：对照品溶液；Ｂ：供试品溶液；Ｃ：阴性对照溶液；＊蜕皮甾酮峰
２．５　方法学考察
２．５．１　线性关系考察：分别精密吸取蜕皮甾酮对照品溶液
（２０４ｍｇ／Ｌ）１，２，４，６，８，１０ｍＬ置１０ｍＬ容量瓶中，各加甲醇
至刻度，摇匀，即得。各取１０μＬ进样测定，以峰面积积分值
为纵坐标，进样量（μｇ）为横坐标，绘制标准曲线，得蜕皮甾酮
回归方程为Ｙ ＝２２８．１１　Ｘ＋７．１０８　２，ｒ＝１．０００　０，蜕皮甾酮
在０．２０４～２．０４μｇ范围内与峰面积呈良好线性关系。
２．５．２　精密度试验：精密吸取同一供试品溶液１０μＬ，连续
进样测定６次。结果：６次测定的蜕皮甾酮峰面积平均值为
１　８３２．２５，ＲＳＤ值为０．１８％，表明本方法精密度较好。
２．５．３　重复性试验：取同一样品粉末，同法平行制备６份供
试品溶液，各精密吸取１０μＬ进样测定。结果：６份供试品溶
液蜕皮甾酮含量的平均值为１．２７％，ＲＳＤ值为０．４２％，表明
本方法重复性好。
２．５．４　稳定性试验：精密吸取同一供试品溶液１０μＬ，分别
于０，２，４，８，１６，２４ｈ进样测定。结果：６次测定的蜕皮甾酮
含量的平均值为１．２７％，ＲＳＤ值为０．２４％，表明供试品溶液
蜕皮甾酮含量在２４ｈ内基本稳定。
２．５．５　回收率试验：取药材粉末０．５ｇ共６份，分别精密称
定，各精密加入蜕皮甾酮对照品５０％甲醇溶液（３３ｍｇ／Ｌ）
２０ｍＬ，同法制备供试品溶液。各精密吸取１０μＬ进样测定，
计算平均回收率及ＲＳＤ。结果，蜕皮甾酮含量平均回收率＝
１０１．５％，ＲＳＤ＝１．１９％（ｎ＝６）。
２．５．６　耐用性试验：分别采用了 Ｗｅｌｃｈ　Ｃｏｌｕｍｎ　ＡＱ－Ｃ１８、Ａｇ－
ｉｌｅｎｔ　Ｅｘｔｅｎｄ－Ｃ１８和 Ｈｙｐｅｒｓｉｌ－Ｃ１８３种不同品牌色谱柱（规格均
为４．６ｍｍ×２５０ｍｍ，５μｍ），对同一供试品溶液进行测定。
结果：三根色谱柱测定蜕皮甾酮平均值＝１．２７２％，ＲＳＤ＝
０．５７％（ｎ＝３）；分别采用 Ａｇｉｌｅｎｔ　１１００型和岛津ＬＣ－２０ＡＴ
两台不同品牌的色谱仪，测定同一供试品溶液中蜕皮甾酮的
含量。结果：两台色谱仪测定蜕皮甾酮平均值＝１．２７２％，
ＲＡＤ＝１．１３％（ｎ＝２）。
２．６　样品测定：分别取上述３批样品，照“２．３”项方法制备
对照品溶液和供试品溶液，同法测定蜕皮甾酮含量。结果：３
批样品蜕皮甾酮含量分别为广西药用植物园１．２７％、广西鹿
寨县０．６２％、广西龙州县０．４４％。
３　讨　论
　　山牡荆为广西壮、瑶民族使用的药材，但过去有关该药
材质量控制方法的研究未见文献报道。本文以蜕皮甾酮作
为该药材质量控制的成分，通过对 ＨＰＬＣ测定色谱条件和供
试品溶液的制备方法进行研究，建立了该药材含量测定方
法，经方法学考察，该方法的线性关系、精密度、重复性、稳定
性和加样回收率等各项技术指标均符合中药含量测定的技
术要求。试验证实，该方法简便易行，准确可控，重复性好，
可作为瑶药山牡荆质量评价和控制的方法之一。
　　中草药来源于天然产物，其所含化学成分是丰富而复杂
的，对于山牡荆中蜕皮甾酮以外的其它成分的药理活性和含
量测定方法有待今后进一步的研究。
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