全 文 ：土牛膝的生药学鉴定
欧丽兰，余 昕，张 椿，朱 烨 (泸州医学院药学院，四川泸州 646000)
摘要 ［目的］对土牛膝进行生药学鉴定。［方法］采用显微鉴别、薄层色谱鉴别和高效液相色谱法对土牛膝进行定性和定量鉴定。［结
果］土牛膝的性状特征和组织构造特征明显;并且，测得土牛膝中齐墩果酸的平均含量为 0． 445 3%，蜕皮甾酮的平均含量为 0． 103 3%。
［结论］该方法对土牛膝的生药学性状进行了鉴定，其结果可为土牛膝质量标准的制定提供参考依据。
关键词 土牛膝;薄层色谱鉴别;高效液相色谱法
中图分类号 S567;R282． 5 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611(2012)09 －05204 －03
Pharmacognostical Identification of Achyranthes aspera L． Roots
OU Li-lan et al (Department of Pharmacy，Luzhou Medical College，Luzhou，Sichuan 646000)
Abstract ［Objective］To identify the roots of Achyranthes aspera L． ． ［Method］A qualitative and quantitative study on the roots of Achyran-
thes aspera L． was carried out through microscopic identification，TLC and HPLC． ［Result］Obvious characteristics were found in the tissue
structures of Achyranthes aspera L． ． In addition，the average content of oleanolic acid and ecdysterone was 0． 445 3% and 0． 103 3%，respec-
tively． ［Conclusion］The result can be taken as the reference basis for the establishment of quality standards for Achyranthes aspera L． ．
Key words Achyranthes aspera L．;TLC;HPLC
作者简介 欧丽兰(1980 － ) ，女，四川泸州人，讲师，硕士，从事药用植
物学研究，E-mail:yuanouou@ yahoo． com． cn。
收稿日期 2011-12-08
土牛膝来源于苋科(Amaranthaceae)植物粗毛牛膝
(Achyranthes aspera L．)、柳叶牛膝(Achyranthes longifclia
Makino)及牛膝(Achyranthes bidentata Blume)野生种的干燥
根。其性平，微苦、凉，具有清热解毒、利咽化痰、抗菌消炎和
镇静止痛等作用，主治白喉、扁桃体炎、急慢性咽喉炎、感冒
发烧、麻疹肺炎、痈疽疖肿、蛇咬伤和类风湿关节炎等［1］。土
牛膝在四川各地是一味民间常用的中草药，不少地方都将其
用于治疗咽喉炎和扁桃体炎。通过查阅文献资料发现，川产
土牛膝中含有的齐墩果酸和蜕皮甾酮，是土牛膝当中的有效
成分［2］。药理研究表明，齐墩果酸具有抗炎、增强免疫、抑制
血小板聚集、降糖、抗氧化和利尿等多方面作用，还具有护
肝、抗高血脂、抗动脉粥样硬化及抗肿瘤等生物活性［3］;蜕皮
甾酮具有明显的抗动脉粥样硬化及抗脂质过氧化作用，能降
低血清中胆固醇含量，减少血小板聚集性等作用［4］。目前有
关土牛膝生药学的研究鲜有报道，故试验采用显微鉴别、薄
层色谱鉴别和高效液相色谱法对土牛膝进行定性和定量鉴
定，以期为制定土牛膝药材的质量标准提供参考依据。
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 研究对象。土牛膝，2009 年 9 月采自四川省泸州市
龙马潭区石洞镇，野生，经作者鉴别为苋科植物粗毛牛膝
的根。
1． 1． 2 主要仪器。KD － 1508A 轮转式切片机，购自浙江省
金华市科迪仪器设备有限公司;XSZ-2GA 生物显微镜，购自
重庆光学仪器厂;ST-424 透反射显微镜，购自重庆光学仪器
厂;高效液相色谱仪(P680A四元低压梯度泵，PDA-100 二极
管阵列检测器，TCC-100柱温箱，Chromeleon色谱工作站) ，购
自美国戴安公司;XR205SM-DR电子天平，购自瑞士 Precisa;
CQX25-06超声波清洗器，购自上海必能信超声有限公司;硅
胶 H薄层板，购自青岛海洋化工分厂;硅胶 G 薄层板，购自
青岛海洋化工分厂。
1． 1． 3 主要试剂。齐墩果酸对照品，购自贵州迪大科技有
限责任公司，纯度 99． 99%;蜕皮甾酮对照品，购自天津一方
科技有限公司，纯度为 99． 99%;甲醇为色谱纯，水为重蒸
馏水。
1． 2 方法
1． 2． 1 土牛膝的显微鉴别。取新鲜土牛膝，经 FAA固定液
固定，进行常规石蜡切片，并用番红 －固绿染色制定永久装
片［5］，放入显微镜中观察现象。
1． 2． 2 土牛膝粉末的显微鉴别。取土牛膝粉末，经水合氯
醛透化后，用甘油装片，然后放入显微镜中观察现象。
1． 2． 3 土牛膝中齐墩果酸和蜕皮甾酮的薄层色谱法鉴别。
1． 2． 3． 1 齐墩果酸的薄层色谱鉴别。取供试品和对照品溶
液各 10 μl，点样于同一硅胶 H薄层板上，以三氯甲烷 －无水
甲醇(40∶1，V /V)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以磷钼酸试
液，在 110 ℃加热(约 10 min)至斑点显色清晰。
1． 2． 3． 2 蜕皮甾酮的薄层色谱鉴别。取供试品和对照品溶
液各 10 μl，点样于同一硅胶 G薄层板上，以氯仿 －无水甲醇
(8∶1，V /V)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以浓度 10%硫酸乙
醇溶液，在 120℃加热至斑点显色清晰。
1． 2． 4 HPLC法测定土牛膝中齐墩果酸的含量。
1． 2． 4． 1 色谱条件。色谱柱为 Dikma Kromasil C18(250 mm
×4． 6 mm，5 μm) ;流动相为无水甲醇 －水(92∶8，V /V) ;检测
波长为 210 nm;柱温为 30 ℃;流速为 1． 0 ml /min;进样量为
10 μl。
1． 2． 4． 2 对照品溶液的制备。取经五氧化二磷减压干燥至
恒重的齐墩果酸对照品适量，精密称定，置量瓶中，加无水甲
醇制成浓度为 0． 5 mg /ml的溶液，即得。
1． 2． 4． 3 供试品溶液的制备。精密称取 1． 000 g 土牛膝粗
粉，按料液比 1∶12(g /ml)加入浓度 70%乙醇，水浴回流提取
1 h，过滤，过滤时用相同浓度的乙醇溶液少量频次的洗涤药
责任编辑 石金友 责任校对 卢瑶安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2012，40(9):5204 － 5206，5290
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2012.09.206
渣，然后将滤液定容到 50 ml容量瓶中，精密吸取定容提取液
10 ml，加入 10 ml浓度 20%的盐酸，在 100 ℃加热水浴回流 3
h，冷却后加 20 ml蒸馏水，蒸去部分乙醇，用氯仿萃取 5 次，
每次 10 ml，合并氯仿层，浓缩至干，用流动相无水甲醇 －水
(90∶10，V /V)溶解并定容于 10 ml 容量瓶中，作为供试品
溶液。
1． 2． 4． 4 系统适应性试验。取对照品溶液和供试品溶液，
按“1． 2． 3． 1”中色谱条件进样，观察各自的图谱，考察系统的
适应性。
1． 2． 4． 5 方法学考察。①线性关系考察。精密称取 5． 0 mg
齐墩果酸对照品，置于 10 ml容量瓶中，加无水甲醇稀释至刻
度，摇匀。分别精密吸取上述对照品溶液 2、4、6、8、10 和 20
μl，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，记录峰面积。以
浓度(X)与对应的峰面积(Y)作回归处理，绘制标准曲线。
②精密度试验。精密吸取 10 μl 齐墩果酸对照品溶液，注入
液相色谱仪，按上述色谱条件测定，连续重复进样 6次，计算
土牛膝中齐墩果酸峰面积的 RSD。③稳定性试验。取土牛
膝药材粉末适量，精密称定，按供试品溶液制备方法制备供
试品，分别于 0、2、4、6、8和 10 h分别精密吸取 10 μl，测定峰
面积值，计算土牛膝齐墩果酸峰面积的 RSD。④重复性试
验。称取同一批土牛膝粉末 6份，按供试品溶液制备方法制
备供试品，分别精密吸取 10 μl，注入液相色谱仪，进行定量
测定，计算土牛膝中齐墩果酸含量的 RSD。表明本法重现性
良好。⑤加样回收率试验。称取已知含量土牛膝药材 9 份，
每份加入适量对照品溶液，按供试品溶液制备方法制备供试
品，分别精密吸取样品溶液 10 μl，注入液相色谱仪，进行定
量测定，计算加样回收率和 RSD。
1． 2． 4． 6 样品中齐墩果酸的含量测定。分别取上述土牛膝
药材样品，按供试品溶液制备方法制备供试品，分别精密吸
取 10 μl，注入液相色谱仪，按上述色谱条件，分别测定样品
中齐墩果酸的含量。
1． 2． 5 HPLC法测定土牛膝中蜕皮甾酮的含量。
1． 2． 5． 1 色谱条件。色谱柱为依利特 SinoChrom ODS － BP
C18(250 mm ×4． 6 mm，5 μm) ;流动相为乙腈–水(20∶80，V /
V) ;检测波长为 248 nm;柱温为 30 ℃;流速为 1． 0 ml /min;进
样量为 10 μl。
1． 2． 5． 2 对照品溶液的制备。取经五氧化二磷减压干燥至
恒重的蜕皮甾酮对照品适量，精密称定，置量瓶中，加无水甲
醇制成浓度为 0． 125 mg /ml的溶液，即得。
1． 2． 5． 3 供试品溶液的制备。精密称取 2． 000 g 干燥土牛
膝粉末(过 40 目筛) ，用 25 ml 浓度 80%甲醇超声提取 30
min，过滤，并以浓度 80%甲醇分次洗涤容器和残渣，置水浴
锅上挥干溶剂后，用色谱甲醇溶解，并转移至 25 ml 容量瓶
中，加浓度 80%甲醇稀释至刻度，摇匀，经 0． 45 μm微孔滤膜
滤过，即得供试品溶液。
1． 2． 5． 4 系统适应性试验。取对照品溶液和供试品溶液，
按“1． 2． 4． 1”中色谱条件进样，考察系统的适应性。
1． 2． 5． 5 方法学考察。①线性关系考察。精密称取 5． 0 mg
蜕皮甾酮对照品，置于 10 ml容量瓶中，加无水甲醇稀释至刻
度，摇匀。精密吸取 0． 2、0． 6、1． 0、1． 4和 1． 8 ml，置 10 ml 容
量瓶中，加无水甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。分别精密吸
取上述对照品溶液 20 μl，注入液相色谱仪，按上述色谱条件
测定，记录峰面积。以浓度(X)与对应的峰面积(Y)作回归
处理，得标准曲线。②精密度试验。精密吸取对照品溶液，
注入液相色谱仪，测定峰面积值，重复进样 6次，计算土牛膝
蜕皮甾酮峰面积的 RSD。③稳定性试验。精密吸取同一供
试品溶液，分别于 0． 5、1、2、4、6 和 8 h分别精密吸取 10 μl，
测定峰面积值，计算土牛膝蜕皮甾酮峰面积的 RSD。④重复
性试验。称取同一批土牛膝粉末 5份，按供试品溶液制备方
法制备供试品，分别精密吸取 10 μl，注入液相色谱仪，进行
定量测定，计算土牛膝蜕皮甾酮峰面积的 RSD。⑤加样回收
率试验。称取已知含量土牛膝药材 5份，每份加入适量对照
品溶液，按供试品溶液制备方法制备供试品，分别精密吸取
样品溶液 10 μl，注入液相色谱仪，进行定量测定，计算加样
回收率和 RSD。
1． 2． 5． 6 样品中蜕皮甾酮的含量测定。分别取上述土牛膝
药材样品，按供试品溶液制备方法制备供试品，分别精密吸
取 10 μl，注入液相色谱仪，按上述色谱条件，分别测定样品
中蜕皮甾酮的含量。
2 结果与分析
2． 1 显微鉴别
2． 1． 1 土牛膝的显微鉴别。由图 1 可知，木栓层由数列类
长方形细胞构成;皮层较窄，少数薄壁细胞中含草酸钙砂晶;
中柱占根的大部分，有同心环状排列的异型维管束排列成 4
轮，最外轮维管束较小，有的仅由 1 ～数个导管构成，内三轮
维管束较大，木质部主要由导管及木纤维组成，导管木质化，
木纤维微木化;根中央的维管束为正常维管束，维管束分成 2
群，维管束类型为外韧维管束。
注:1． 木栓层;2．皮层;3．韧皮部;4．木质部;5．韧皮部;6．木质部。
图 1 土牛膝横切面
2． 1． 2 土牛膝粉末的显微鉴别。由图 2可知，粉末呈类白色;
纤维呈束存在，或与导管伴生，有的末端斜尖，直径 13 ～ 20
μm，纹孔呈单斜纹孔或人字形，孔沟明显，疏密不一;导管多以
网纹导管为主，直径 10 ～60 μm，有的导管分子末端呈梭形;薄
壁细胞多呈类圆形或类椭圆形，数个连在一起，细小草酸钙砂
晶散在于薄壁细胞中;木栓细胞呈类方形，垂周壁有波状弯曲。
502540 卷 9 期 欧丽兰等 土牛膝的生药学鉴定
注:1．纤维素;2．导管;国 3．木栓细胞;4．薄壁细胞。
图 2 土牛膝粉末
2． 2 薄层色谱法鉴别土牛膝中的齐墩果酸和蜕皮甾酮
2． 2． 1 齐墩果酸的薄层色谱鉴别。结果显示，供试品色谱
中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的蓝色斑点，表明
样品中含有齐墩果酸。
2． 2． 2 蜕皮甾酮的薄层色谱鉴别。结果显示，供试品色谱
中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，表明
样品中含有蜕皮甾酮。
2． 3 HPLC法测定土牛膝中齐墩果酸的含量
2． 3． 1 系统适应性试验。由图 3 可知，对照品和供试品溶
液在相同的保留时间上有对应的吸收峰，并且供试品溶液中
各峰的分离度良好，表明系统的适应性良好。
2． 3． 2 方法学考察。①线性关系考察。计算得标准曲线为
Y =6． 912 4X － 0． 053 7(R = 0． 999 9)。结果表明，在 1． 0 ～
10． 0 μg /ml浓度范围内，齐墩果酸对照品浓度与峰面积呈良
好的线性关系。②精密度试验。计算得土牛膝中齐墩果酸
峰面积的 RSD为 0． 25%，表明该方法精密度良好。③稳定
性试验。计算得土牛膝齐墩果酸峰面积的 RSD 为1． 93%。
可见供试品溶液在 10 h内，稳定性良好。④重复性试验。计
算得土牛膝中齐墩果酸峰面积的 RSD 为 0． 55%，表明重现
性良好。⑤加样回收率试验。计算得土牛膝齐墩果酸的平
均加样回收率为 96． 97%，RSD为 1． 02%，表明该方法准确可
靠，可用于土牛膝中齐墩果酸的含量测定。
注:A．对照品;B．供试品;1．齐墩果酸。
图 3 土牛膝齐墩果酸 HPLC色谱图
2． 3． 3 样品中齐墩果酸的含量测定。由表 1 可知，测得土
牛膝样品中齐墩果酸的平均含量为 0． 445 3%，RSD 为
0． 552%。
表 1 土牛膝齐墩果酸的含量测定
批次 齐墩果酸∥% 平均含量∥% RSD∥%
091016 0． 397 7
091028 0． 484 2
091116 0． 427 1 0． 445 3 0． 552
091221 0． 562 4
100325 0． 355 2
2． 4 HPLC法测定土牛膝中蜕皮甾酮的含量
2． 4． 1 系统适应性试验。由图 4 可知，对照品和供试品溶
液在相同的保留时间上有对应的吸收峰，并且供试品溶液中
各峰的分离度良好，表明系统的适应性良好。
2． 4． 2 方法学考察。①线性关系考察。计算得标准曲线为
Y =31． 247 3X +0． 272 6(R = 0． 999 8)。结果表明，在 0． 2 ～
1． 8 μg /ml浓度范围内，蜕皮甾酮浓度与峰面积呈良好的线
性关系。②精密度试验。计算得土牛膝蜕皮甾酮峰面积的
RSD为 0． 30%，表明精密度良好。③稳定性试验。计算得峰
面积的 RSD为 1． 65%，可见供试品溶液在 8 h 内稳定性良
好。④重复性试验。计算得峰面积的 RSD 为 0． 60%，表明
重现性良好。⑤加样回收率试验。计算得平均加样回收率
为 98． 72%，RSD为 0． 77%，表明该方法准确可靠，可用于土
牛膝中蜕皮甾酮的含量测定。
2． 4． 3 样品中蜕皮甾酮的含量测定。由表 2 可知，测得土
牛膝中蜕皮甾酮的平均含量为 0． 103 3%，RSD为 0． 406%。
表 2 土牛膝蜕皮甾酮的含量测定
批次 蜕皮甾酮的含量∥% 平均含量∥% RSD∥%
091016 0． 093 1
091028 0． 109 3
091116 0． 123 1 0． 103 3 0． 406
091221 0． 117 4
100325 0． 073 7
3 结论与讨论
川产土牛膝资源丰富，分布较广，沿用历史悠久，而被四
川民间广泛使用。通过试验定性和定量的研究，明确了土牛
膝中的有效成分，下一步可以通过核磁共振仪来确定土牛膝
中的未知化学成分，确定其结构式。土牛膝在民间被用来治
疗咽喉炎，但其治疗咽喉炎的活性成分尚不清楚，对其活性
成分的深入研究对川产土牛膝的开发利用和深加工具有重
要意义。
(下转第 5290页)
6025 安徽农业科学 2012年
得到，单层钢球冷却过程中，1 /2、3 /4、7 /8 预冷时间分别为
39、70和104 min。
图 3 单层钢球温度变化情况
3． 3． 2 多层钢球冷却试验结果。将 40 kg 钢球装在 2 个尺
寸为 540 mm ×380 mm ×300 mm的带孔塑料果蔬箱内，果蔬
箱放在下均风板上，在上、中和下层分别设置 2 个热电偶测
量温度，得到不同层面钢球内部温度随时间的变化情况见图
4。由图 4可知，上层钢球温度下降最快，而下层钢球温度下
降最慢。从降温曲线的趋势可以看出，最上层钢球的降温情
况与单层钢球预冷试验的降温情况相同，接近于指数变化规
律，拟合后的曲线方程为 y = 27． 117e －0． 005 9x，判定系数 R2 =
0． 912 2;最下层的温度变化规律近似为直线规律，拟合后的
直线方程为 y = －0． 109 8x +25． 619，R2 = 0． 966 7。温度由最
上层至最下层逐次上升，在实际应用中，应以下层果蔬的温
度值作为是否达到预冷温度设定值来进行控制。对试验温
度进行计算得到，多层钢球冷却试验中，1 /2、3 /4、7 /8 预冷时
间分别为 55、91和 130 min。
在单层和多层钢球试验中，对比同层各温度测点的情况
发现，气流均匀性很好，同一水平面各点温度值的变化情况
几乎一致，这说明这种压差送风冷却方式有较好的气流组织
形式，能够使箱体内形成稳定均匀的温度场。
图 4 多层钢球温度变化情况
3． 4 结论及建议 预冷箱体与制冷设备可分离的产地预冷
装置能很好地满足个体农户果蔬产品产地预冷的要求，在果
蔬采摘后及时提供预冷，保证果蔬的品质，尤其适用于经济
价值高、易腐烂的果蔬。采用冷风对内部注水的不锈钢小球
的冷却试验表明，对于上进下出的气流方式，上层果蔬的温
度呈指数规律变化，下层果蔬的温度近似呈线性规律变化，
气流均匀性好，同一水平面上温度变化情况一致。该试验是
以注水钢球来进行，未考虑不同果蔬呼吸热的影响，后续工
作应对不同种类果蔬进行研究，并对与之配套的制冷设备的
特性进行分析研究，并争取早日产品化，通过在实际应用中
不断改进和发展，真正实现果蔬产地预冷。
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1990．
(上接第 5206页)
注:A．对照品;B．供试品;1．蜕皮甾酮。
图 4 土牛膝蜕皮甾酮 HPLC色谱图
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