全 文 ：收稿日期:2009-11-12;　修订日期:2010-07-16
基金项目:青海省科技厅重点攻关科技项目(No.2007-N-130)
作者简介:叶　菊(1978-),女(汉族),青海西宁人 ,现任青海民族大学化
学与生命科学学院讲师 ,硕士学位 ,主要从事药用植物开发与利用工作.
正交实验法优选大叶白麻总黄酮提取工艺研究
叶　菊 ,马　敏 , 林鹏程
(青海民族大学化学与生命科学学院 , 青海 西宁　810007)
摘要:目的 用正交实验法对柴达木地区野生大叶白麻总黄酮提取工艺进行优选。方法 以大叶白麻总黄酮含量为考察
指标 , 采用正交实验 L9(34)表进行实验 , 对乙醇浓度 、提取时间 、提取温度及料液比 4个影响因素进行考察研究。结果与
结论 影响大叶白麻总黄酮提取工艺的显著因素为提取时间和料液比。最佳提取工艺为 70℃水浴下 , 用 25倍量的 40%
乙醇提取 2次 , 每次 2.5 h。
关键词:大叶白麻;　总黄酮;　提取工艺;　正交实验;　紫外分光光度法
DOI标识:doi:10.3969 /j.issn.1008-0805.2010.12.069
中图分类号:R285　　文献标识码:B　　文章编号:1008-0805(2010)12-3181-02
　　大叶白麻 Poacynumhendersoni(Hook.f.)Woodson, 为夹竹桃
科 , 白麻属多年生半灌木 [ 1] ,为 3种罗布麻中的一种 ,主要分布于
新疆 、青海和甘肃等省区 [ 2] , 别名野麻 、白麻 、大花罗布麻等 , 是
一种优质的药用植物和纺织材料 [ 3] 。大叶白麻中的黄酮含量较
高 , 这些黄酮成分具有降压 、降脂 、抗感冒 、镇静安神等功效。目
前作为同科植物罗布麻 ApocynumvenetumL.的代用品而被广泛
应用于药用保健业 [ 4～ 9] ,但对大叶白麻总黄酮提取工艺的研究未
见报道。本文通过正交实验对大叶白麻叶总黄酮的提取进行了
工艺研究 , 筛选出了较满意的工艺条件 , 为大叶白麻药效学的研
究和资源开发利用提供了一定的科学依据。
1　药品与仪器
大叶白麻样品 , 2007-07中旬采自青海柴达木地区 , 阴干 ,
待用。对照品 , 芦丁(中国药品生物制品检定所)。
乙醇 、亚硝酸钠 、硝酸铝 、氢氧化钠等 , 均为国产分析纯试剂。
FZ102型粉碎机 、RE-52CS型旋转蒸发仪 、TU-1800型紫
外可见分光光度计 , DZKW-C型电子恒温水浴锅(黄石市恒丰
医疗器械有限公司);FA1604N型电子天平(上海箐海仪器有限
公司);DZX-1型 (6050B)真空干燥箱(上海福玛实验设备有
限公司)。
2　方法与结果
2.1　总黄酮的含量测定 以芦丁为标准品 , 利用紫外可见分光光
度法测定待测样品总黄酮含量 [ 10 ～ 12] 。
2.1.1　对照品溶液的制备 精密称取 120℃干燥至恒重的芦丁
对照品 28.6 mg, 置于 100ml容量瓶中 , 80%乙醇适量溶解 ,加水
稀释至刻度 , 摇匀 ,即得(每毫升含芦丁对照品 286μg)。
2.1.2　供试品溶液的制备 称取大叶白麻叶若干 , 粉碎 , 过 40目
筛。称取粉碎样 3.0 g, 置于 100 ml平底烧瓶 ,采用热回流法提
取(提取溶剂为 60%乙醇 ,料液比为 1∶10,提取温度为 70℃,提
取时间为 2 h, 提取 2次)。提取液过滤 、合并 ,石油醚萃取 , 转至
200ml容量瓶 ,定容 , 摇匀 ,待测。
2.1.3　比色原理及最大吸收波长选择 大叶白麻含多种黄酮类
化合物 [ 2, 13] ,其黄酮母核所含的游离羟基在适当的介质条件下能
与金属铝离子形成络合物而显色。用一定浓度的 NaNO2溶液 、Al(NO)3溶液 、NaOH溶液显色 , 于 300 ～ 700 nm处扫描 , 对照品
和供试品溶液的吸收光谱均在 502 nm处有最大吸收(光谱扫描
曲线见图 1), 因此测定波长选择 502nm。
2.1.4　标准曲线的制备 精密量取对照液 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0
ml分别置于 50 ml容量瓶中 ,加 5%亚硝酸钠溶液 1.0 ml摇匀 ,
放置 6min;加 10%硝酸铝溶液 1.0ml摇匀 , 放置 6 min;加 4%氢
氧化钠溶液 10 ml, 加水稀释至 50ml摇匀 , 放置 15min;置比色皿
中 , 以试剂同法做空白 , 在 502 nm处测定吸光度 A, 并以吸光度
对浓度进行回归。 得回归方程:A=0.011 56 ×C-0.007 591
(R=0.999 8),在 2.86 ～ 84.62 μg/ml范围内 , 呈良好的线性关
系。
图 1　最大吸收波长选择图谱
2.1.5　重复性实验 取同一大叶白麻叶样品 5份 , 按供试品溶液
的制备项下操作进行试验 , 按标准曲线项下操作显色 , 计算每份
样品中总黄酮的含量 , 5次测得的平均含量为 3.69%, RSD=
0.146%(n=5),表明本测定法的重复性良好。
2.1.6　精密度实验 精密吸取供试品溶液 1 ml,按标准曲线项下
操作显色 ,重复测定吸光度 5次 , 计算吸光度相对标准偏差 RSD
=0.454%(n=5), 表明精密度良好。
2.1.7　显色剂稳定性实验 精密吸取供试品溶液 1ml, 按标准曲
线项下操作显色 ,在 0 ～ 50min内每隔 10min进行测定吸光度值。
计算吸光度相对标准偏差 RSD=0.135%(n=5), 表明样品在室
温下 50min内稳定。
2.1.8　加样回收率实验 精密称取同一大叶白麻叶粉碎样 0.5 g
(3份 , 总黄酮含量为 9.03%), 精密加入芦丁对照品适量 , 按供
试品溶液的制备项下进行提取 、萃取 、定容 ,并取 1 ml于 50ml容
量瓶中 ,按标准曲线项下操作显色 , 测定吸收度;按回归方程求得
总黄酮含量 ,计算得平均回收率为 104.98%,表明该方法测得的
结果准确。结果见表 1。
表 1　加样回收率测定结果
加样量 m/μg 加标量 m/μg实测黄酮量 m/μg回收率(%)平均回收率(%)
45.15 25.37 73.50 111.75
45.15 30.43 75.22 98.82
45.15 40.27 87.11 104.20 104.98
45.15 50.63 96.27 100.97
45.15 55.12 105.33 109.18
2.1.9　供试液总黄酮含量的测定 分别量取待测液 1 ml, 置 50
ml的容量瓶 ,按标准曲线项下操作显色 ,测定吸收度 , 利用吸光
度及回归方程计算各样品总黄酮百分含量(T)。
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计算公式为:T=C(mg/ml)×50 ×N×V(ml)/W(mg)×
100%
N为样品稀释倍数;V为提取液定容体积;W为样品质量
2.2　单因素试验与结果
2.2.1　乙醇浓度对提取率的影响 准确称取粉碎样 3.0 g(6
份), 置于 100 ml平底烧瓶 , 分别加入 0%, 20%, 40%, 60%,
80%, 95%乙醇 30ml, 采用热回流法提取(提取温度为 70℃, 提
取时间为 2 h,提取 2次)。提取液过滤 、合并 , 石油醚萃取 , 转至
200ml容量瓶 ,定容 、摇匀 、测定 、计算提取率。结果见图 2。
图 2　乙醇浓度对提取率的影响
从图 2可以看出 , 乙醇浓度为 60%时 ,提取率达到最高。在
实验中 , 随着乙醇浓度(60% ～ 95%)的增加 , 总黄酮提取率显著
下降 , 可能是由于乙醇浓度的增加导致溶液黏度增加 ,影响了黄
酮类化合物的浸出。另外 , 随着乙醇浓度的增加 ,叶绿素提取率
显著升高 , 叶绿素含量的增加对后续的萃取等操作造成了一定的
影响。因此 , 乙醇浓度以 60%为宜。
2.2.2　料液比对提取率的影响 准确称取粉碎样 3.0 g(5份),
置于 100 ml平底烧瓶 , 分别加入 60%乙醇 30, 45, 60, 75, 90 ml,
采用热回流法提取(提取温度为 70℃, 提取时间为 2 h, 提取 2
次)。提取液过滤 、合并 , 石油醚萃取 ,转至 200 ml容量瓶 , 定容 、
摇匀 、测定 、计算提取率。结果见图 3。
图 3　料液比对提取率的影响
从图 3可以看出 , 随着料液比的增大 , 黄酮的提取率也随着
提高。当料液比达到 1∶25时 ,总黄酮溶出率基本达到高峰。继
续提高料液比时 , 提取率增加不显著 ,因此 ,从经济角度考虑 ,料
液比以 1∶25为宜。
2.2.3　提取时间对提取率的影响 准确称取粉碎样 3.0 g(5
份),置于 100 ml平底烧瓶 ,分别加入 60%乙醇 75 ml, 70℃回流
提取 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5 h, 共提取 2次。提取液过滤 、合并 ,
石油醚萃取 , 转至 200ml容量瓶 ,定容 、摇匀 、测定 、计算提取率。
结果见图 4。
图 4　提取时间对提取率的影响
从图 4可以看出 , 当提取时间为 2.0 h时 , 提取率达到最大
值。此后在延长提取时间时 , 提取率缓慢下降 , 因此 ,提取时间以
2.0 h为宜。
2.2.4　提取温度对提取率的影响 准确称取粉碎样 3.0g(5份),
置于 100 ml平底烧瓶 , 加入 60%乙醇 75 ml, 分别于 50, 60, 70,
80, 90℃的水浴中回流提取 2.0 h, 共提取 2次。提取液过滤 、合
并 , 石油醚萃取 , 转至 200 ml容量瓶 , 定容 、摇匀 、测定 、计算提取
率。结果见图 5。
图 5　提取温度对提取率的影响
从图 5可以看出 , 随着温度(50 ～ 80℃)的升高 ,提取率呈上
升趋势 , 这是因为温度的升高 , 加快了分子的扩散能力 [ 14, 15] 。当
温度为 80℃时 ,提取率达到最大值。温度再提高时 ,可能高温引
起了黄酮类物质的变质 , 提取率反而下降。因此 , 提取温度以为
80℃为宜。
2.3　大叶白麻叶总黄酮提取正交实验与结果 根据单因素试验
结果 , 编制正交实验因素水平表。结果见表 2。以总黄酮提取率
为考察指标 , 选取 L9(34)正交表进行正交实验。结果见表 3。方
差分析结果见表 4。
表 2　正交实验设计因素水平表
水平 A乙醇浓度(%)
B
固液比
C
提取温度 /℃
D
提取时间 /h
1 40 1∶20 70 1.5
2 60 1∶25 80 2
3 80 1∶30 90 2.5
表 3　正交实验及结果
因素 A乙醇浓度
B
固液比
C
提取温度
D
提取时间
实验结果
(%)
实验 1 1 1 1 1 9.883
实验 2 1 2 2 2 11.836
实验 3 1 3 3 3 13.666
实验 4 2 1 2 3 10.834
实验 5 2 2 3 1 12.904
实验 6 2 3 1 2 7.904
实验 7 3 1 3 2 5.84
实验 8 3 2 1 3 16.543
实验 9 3 3 2 1 10.261
均值 1 11.795 8.852 11.443 11.016
均值 2 10.547 13.761 10.977 8.527
均值 3 10.881 10.61 10.803 13.681
极差 1.248 4.909 0.64 5.154
表 4　方差分析表
因素 偏差平方和 自由度 F比 F临界值 显著性
乙醇浓度 2.503 2 3.81 19
固液比 37.112 2 56.487 19 ＊
提取温度 0.657 2 1 19
提取时间 39.866 2 60.679 19 ＊
误差 0.66 2
　　F0.05(2 , 2)=19.00
从表 2 ～ 4可以看出 , 对提取效果的因素依次为提取时间 >
固液比 >乙醇浓度 >提取温度 , 固液比与提取时间有显著性差
异。综合考虑 , 确定各因素最佳水平组合为:提取时间 2.5 h, 固
液比 1∶25,乙醇浓度 40%, 提取温度 70℃。
2.4　验证性试验与结果 准确称取粉碎样 3.0 g(5份),置于 100
ml平底烧瓶 ,分别加入 40%乙醇 75 ml, 70℃回流提取 2.5 h, 共
提取 2次。提取液过滤 、合并 ,石油醚萃取 , 转至 200 ml容量瓶 ,
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时珍国医国药 2010年第 21卷第 12期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2010VOL.21NO.12
定容 、摇匀 、测定 , 计算得平均提取率为 17.83%, RSD=0.517,结
果高于其他各组试验结果 ,表明本工艺稳定可行。
3　结论与讨论
分光光度法是用来测定总黄酮含量的常用方法 , 此方法快
速 、稳定 、适与生产工艺过程中的产品检测。正交实验法用于提
取工艺优化 , 减少实验次数 ,节约成本 , 是天然产物有效成分提取
工艺优化的良好工具。本研究采用分光光度法进行含量的测定 ,
采用正交实验进行工艺的优选 ,得出大叶白麻总黄酮提取优选工
艺是:采用热回流提取法 , 提取时间为 2.5 h、固液比为 1∶25、乙
醇浓度为 40%、提取温度为 70℃。
黄酮类化合物具有多个苯环和酚羟基结构 , 苯环为非极性基
团(疏水基团),而酚羟基为亲水基团, 具极性 ,所以用于提取黄酮
类化合物的溶剂应为具一定碳链长度的极性混合溶剂 [ 16] , 较低浓
度的乙醇溶液符合此条件, 表明本研究结论符合理论依据。
本研究中 , 提取液进行了石油醚萃取操作 ,通过高效液相分
析 , 石油醚萃取物中未发现黄酮类物质 , 此步骤在一定程度上减
少了后续试验中的干扰因素 ,使实验结果更加稳定可靠。
参考文献:
[ 1] 　中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志 [ M].北京:科学
出版社 , 1977:157.
[ 2] 　张云峰 ,魏　东 ,郭祀远 ,等,大花罗布麻的化学成分研究 [ J] 天然
产物研究与开发 , 2006 , 18(6):954.
[ 3] 　初敬华.重要经济植物-罗布麻 [ J] .白城师范学院学报 , 2007, 3:
41.
[ 4] 　YokozawaT, DongE, KashiwagiH, etal.Invitroandinvivostudies
onantilipidperoxidationefectofextractfromLuobumaleaves[ J].
NaturalMedicines, 1997, 51:325.
[ 5 ] 　顾振纶.大花罗布麻叶的药理学研究 -1.对血小板凝集的影响
[ J] .中成药 , 1989, 11(11):28.
[ 6 ] 　KimD· W, YokozawaT, HattoriM, etal.Luobumaleafinhibitsoxida-
tionoflowdensitylipoproteinincholesterol-fedrats[ J] .Journalof
TraditionalMedicines.1998, 15:40.
[ 7 ] 　YokozawaT, NakagawaT.InhibitoryefectsofLuobumateaandits
componentsagainstglucose-mediatedproteindamage[ J] .Foodand
ChemicalToxicology, 2004, 42:975.
[ 8 ] 　钱曾年.大花罗布麻叶的药理学研究 -2.大花罗布麻叶延缓衰老
作用的实验观察 [ J].中成药 , 1990, 12(3):28.
[ 9 ] 　钱曾年.大花罗布麻叶的药理学研究 -3.对心血管系统的影响
[ J] .中成药 , 1991, 13(7):27.
[ 10]　许正斌 ,佟婉筠 ,杨　光.刺五加各器官有效成分的含量测定 [ J] .
中草药 , 1984, 15(5):33.
[ 11]　范维刚 ,解成喜 ,李　锋 ,等.罗布麻叶中黄酮类化合物含量的测定
[ J] .新疆大学学报 , 2005, 22(3):464.
[ 12]　付桂明 , 万　茵 ,周建斌.杜仲叶醇提液中黄酮测定方法的比较研
究 [ J] .中国食品学报 , 2006, 6(1):224.
[ 13]　马挺军 ,刘　诚 ,李久长 ,等 , 大花罗布麻叶黄酮的提取 [ J].食品
科学 , 2005, 26, 12:273.
[ 14]　ZhongG, RomeoTToledo, ChenZD.EfectsofHeatTreatmenton
FlavonoidsContentandAntioxidantCapacityofBuckwheat(Fagopy-
rumtataricumGaert)FlourEthanolicExtracts[ J].AgriculturalSciences
inChina, 2003, 2(9):1035.
[ 15]　LiuCM, ZhaoXL, LiuZQ, etal.IsolationandExtractionofTotal
FlavonoidsfromEpimediumKoreanumNakaibySupercriticalFluidEx-
traction[ J] .Chem.Res.ChineseU., 2004, 20(6):707.
[ 16]　刘锡建 , 王艳辉 , 李　平 , 等.沙棘果渣中总黄酮提取的研究 [ J] .
北京化工大学学报 , 2004, 31(1):19.
收稿日期:2010-01-19;　修订日期:2010-07-22
基金项目:贵州省教育厅重点科研项目(No.2004121)
作者简介:蒋　品(1989-), 男(汉族), 安徽蚌埠人 , 现为贵阳中医学院
2009级在读硕士研究生 ,学士学位 ,主要从事中药质量及新药研究工作.
＊通讯作者简介:高言明(1956-),男(汉族),贵州贵阳人 ,现任贵阳中医
学院教授 , 硕士研究生导师 ,学士学位 , 主要从事中药质量及新药研究工
作.
毛细管区带电泳法测定龙胆
不同采收期龙胆苦苷含量的变化
蒋　品 ,高言明＊ ,杨玉琴 ,李　健 ,张丽艳 ,何　平 ,刘光文
(贵阳中医学院 ,贵州 贵阳　550002)
摘要:目的 考察不同采收期龙胆中龙胆苦苷含量的变化 , 确定最佳采收期。方法 采用熔融石英毛细管柱(50 μm×
52.1 cm, 有效长度为 43.9 cm)为分离通道;运行缓冲液为含 25%甲醇的 20 mmol· L-1硼砂缓冲液(pH=9.32, 25℃);工
作电压 30kV;柱温 25℃;检测波长:275nm;芦荟苷为内标物。结果 龙胆苦苷在 9, 10月份含量相对较高。结论 9, 10月
份采收的龙胆质量较好 。
关键词:龙胆;　龙胆苦苷;　毛细管区带电泳;　不同采收期
DOI标识:doi:10.3969 /j.issn.1008-0805.2010.12.070
中图分类号:R284.2　　文献标识码:B　　文章编号:1008-0805(2010)12-3183-02
　　中药龙胆系龙胆科多年生草本植物 , 常以根入药 ,主要有效
成分龙胆苦苷有泻肝胆实火 , 除下焦湿热的功能。在利尿作用方
面 , 龙胆地下部分(根)明显优于地上部分(茎和叶), 由于地上
部分同样具有抗炎 、抗菌 、利尿的药理作用 , 并且其抗炎作用还
强于地下部分 , 因此龙胆地上部分可以替代地下部分的药
用 [ 1, 2];龙胆苦苷已被《中国药典》 2005版作为 HPLC方法含量测
定的定量化学指标 [ 3] 。目前国内外用毛细管电泳分析龙胆苦苷
的报道极少。为扩展分析方法和扩大用药部位提供依据 ,本文采
用毛细管区带电泳法 ,首次以芦荟苷为内标物 , 分别测定了不同
采收期龙胆的地上部分和地下部分龙胆苦苷的含量 ,并以此确定
中药龙胆最佳采收时间。
1 　仪器与材料
HP3DCE高效毛细管电泳仪(安捷伦公司), DAD检测器 , 自
动进样器;AE-240双量程电子分析天平 ,量程:万分之一和十万
分之一两档(梅特勒—托利多上海有限公司);Dela320型 pH计
(梅特勒—托利多上海有限公司)。硼砂 、甲醇 、氢氧化钠均为分
析纯;水为重蒸馏水;龙胆苦苷对照品(110770-200308)、芦荟苷
对照品(110787-200504)均为中国药品生物制品检定所提供;实
验材料分别采自贵州省龙里县洗马河以及贵阳市郊乌当水田 , 采
收时间均为当月 15 ～ 19日之间。经我院付智明讲师鉴定均为龙
胆科(Gentianaceae)植物坚龙胆(GentianarigesensFranch), 本实
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LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2010VOL.21NO.12 时珍国医国药 2010年第 21卷第 12期