全 文 ：CRTER
P.O.Box1200,Shenyang 110004 kf23385083@sina.com www.zglckf.com
0 引言
在动脉粥样硬化发生早期,最主要的变化
是动脉内皮功能紊乱,血管内皮细胞损伤及功
能改变是动脉粥样硬化发生的初始环节[1]。蜂
胶是由蜜蜂生产的天然绿色产品,黄酮类化合
物是蜂胶中一类非常重要的生理活性物质,具
有多种医疗保健作用,其消炎、抗肿瘤、提高机
体免疫力和抗病毒等疗效已得到证实[2,3]。乔
松素是其中含量较高的一种,为 1.7%～2.8%。
本实验采用人脐静脉内皮细胞体外培养,将乔
松素作用于脂多糖诱导的人脐静脉内皮细胞,
观察其对脂多糖诱导人脐静脉内皮细胞的影
响,探讨乔松素对血管内皮细胞可能的保护作
用。
1 材料和方法
设计:单一样本观察。
单位:泰山医学院病理学教研室。
材料:实验于 2006-03/10在泰山医学院
生命科学研究所(省重点实验室)完成。取出
生1h内新生儿脐带,患者知情同意。药物与
Department of
Pathology, Taishan
Medical Colege,
Taian 271000,
Shandong Province,
China
LiDong-juan★ ,
Studyingformasters
degree, Department
ofPathology,Taishan
Medical Colege,
Taian 271000,
Shandong Province,
China
lidongjuan.001@
163.com
Received:2007-03-13
Accepted:2007-06-11
泰山医学院病理学
教研室,山东省泰安
市 271000
李东娟★,女,1980
年生,山东省菏泽市
人,汉族,泰山医学
院在读硕士,主要从
事动脉粥样硬化发
病机制的研究。
lidongjuan.001@
163.com
中图分类号:R541
文献标识码:B
文章编号:1673-8225
(2007)41-08318-03
收稿日期:2007-03-13
修回日期:2007-06-11
(07-50-3-1459/WL·A)
李东娟,王家富,李 伟
蜂胶乔松素对脂多糖诱导人脐静脉内皮细胞的保护作用★
基础医学
Protectiveefectofpinocembrinfrom propolisonhumanumbilicalveinendothelialcels
inducedbylipopolysaccharide
Abstract
AIM: Toinvestigatetheefectsofpinocembrinfrom propolisonhumanumbilicalveinendothelialcels (HUVECs)
inducedbylipopolysaccharide(LPS),andexploreitspossibleprotectiveefectonHUVECs.
METHODS:TheexperimentwasconductedintheInstituteofBiologicalSciences,TaishanMedialColegefromMarchto
October2006.①HUVECswereisolatedfromtheneonatalumbilicalcorein1hour(theinformedconsentwasobtained
fromthefamily)andcultured.Theinjurymodelwasestablishedbyincubatingin10mg/LLPSfor12hours.Therewere
blankcontrolgroup(D-Hankssolution),LPSgroup(10mg/L),andpinocembringroups(50,100,and200mg/Lafter
incubatedin10mg/LLPAfor12hours)inthestudywith8welsineachgroup.②Aftertreatmentof24hours,cel
morphouswasobservedunderlightmicroscope.EfectofpinocembrinoncelviabilitywasassessedbyMTTassay;
productionofvonWilebrandfactor(vWF)wasmeasuredbyELISA;HUVECsapoptoticratewasdetectedbyTUNEL.
RESULTS:①Celsinblankcontrolgroupcloselyatachedtothewalincobbleshape.MostofthecelsinLPSgroup
wereround,andthenumberofthosecelswasmorethanthatinpinocembringroup.②Comparedwithblankcontrol
group,LPScouldsignificantlyinducetheapoptosisofHUVECs(P<0.01);pinocembrinatdiferentconcentrationscould
improvecelmorphousandviability (P<0.05),inhibittheproductionofvWF (P<0.05),andsignificantlyinhibitthe
apoptosisrateofHUVECs(P<0.05).
CONCLUSION:PinocembrincouldenhancetheviabilityofHUVECs,andinhibittheapoptosisofHUVECs,therebyit
playsaroleinprotectingthevascularendothelialcels.
LiDJ, WangJF, LiW.Protectiveefectofpinocembrinfrom propolisonhumanumbilicalveinendothelialcelsinducedby
lipopolysaccharide.ZhongguoZuzhiGongchengYanjiuyuLinchuangKangfu2007;11(41):8318-8320(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/07-41/41k-8318(ps).pdf]
摘要
目的:观察蜂胶乔松素对脂多糖诱导人脐静脉内皮细胞的影响,探讨其对人脐静脉内皮细胞可能的保护作用。
方法:实验于2006-03/10在泰山医学院生命科学研究所(省重点实验室)完成。①实验材料:取出生1h内新生儿脐带,患者知情
同意。②实验分组及方法:培养人脐静脉内皮细胞,建立脂多糖损伤模型(以10mg/L的脂多糖培养液培养细胞12h),实验分为
空白对照组(加等量D-Hank’s液)、脂多糖组(10mg/L)、乔松素组(加10mg/L脂多糖预孵育12h后,按50,100,200mg/L分
别加入乔松素),各组设8个复孔,共同孵育24h。③实验评估:光镜下观察细胞形态,MTT法观察乔松素对人脐静脉内皮细胞
活性的影响,ELISA方法检测培养上清中血管假血友病因子的含量,TUNEL检测细胞凋亡率。
结果:①细胞形态:空白对照组细胞紧密贴壁,呈铺路石状生长。脂多糖组可见多数细胞呈圆形;乔松素组见上述细胞较脂多糖
组明显减少。②乔松素对人脐静脉内皮细胞活性、凋亡及血管假血友病因子含量的影响:与对照组比较,脂多糖组能明显诱导
人脐静脉内皮细胞的凋亡(P<0.01),不同浓度乔松素组可改善内皮细胞形态,组织活性明显升高(P<0.05),同时抑制内皮
细胞血管假血友病因子的释放(P<0.05),使脂多糖诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡细胞数明显减少(P<0.05)。
结论:乔松素能增强人脐静脉内皮细胞活性,抑制脂多糖诱导人脐静脉内皮细胞的凋亡,从而发挥可能的内皮细胞保护功
能。
关键词:乔松素;蜂胶;人脐静脉内皮细胞;凋亡;脂多糖
李东娟,王家富,李伟.蜂胶乔松素对脂多糖诱导人脐静脉内皮细胞的保护作用较[J].中国组织工程研究与临床康复,2007,11(41):8318-8320
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/07-41/41k-8318(ps).pdf]
中国组织工程研究与临床康复 第11卷 第41期 2007-10-14出版
JournalofClinicalRehabilitativeTissueEngineeringResearch October14,2007 Vol.11,No.41
8318
CRTER
沈阳1200邮政信箱 110004 kf23385083@sina.com www.zglckf.com
试剂:乔松素为本院实验室分离纯化 (质量分数 >
98%);Ⅰ型胶原酶、胰酶和 DMEM+F12培养基(美国
GIBCO公司);脂多糖 (来源于 Escherichia.coli
serotypeO55:B5);MTT (美国 Sigma公司);PAA
Gold A11-649 胎 牛 血 清 (PAA laboratories,
Austria);D-Hank’s液实验室配制。抗人Ⅷ因子抗体
染色试剂盒、血管假血友病因子含量测定试剂盒和缺
口末端标记试剂盒(TUNEL)购自武汉博士德生物工
程有限公司;ELISA检测试剂盒购自上海太阳生物公
司。
主要仪器:SW-CJ-2FD超净工作台 (苏州净化设
备 有 限 公 司 );SANYO MCO-15AC CO2 培 养 箱
(SANYO Electric,Japan); 倒 置 相 差 显 微 镜
(Olympus);全自动酶标仪(英国Labsys-tems公司)。
设计、实施、评估者:实验设计、干预实施、评估均
为第一作者。经过正规培训,采用盲法评估。
方法:
人脐静脉内皮细胞培养:用 1g/L胶原酶灌注消
化脐静脉内皮,以含体积分数为 0.2胎牛血清的
DMEM+F12培养,融合生长至 80%～90%即行传代。
倒置显微镜下,细胞呈典型的铺路石状镶嵌排列。第Ⅷ
因子相关抗原间接免疫荧光法鉴定呈阳性。第2～3代
细胞用于实验。
干预分组及形态学观察:按1×108L-1的密度将细胞
接种于96及24孔培养板。培养24h后,换无血清培养
液培养24h。实验分为空白对照组 (加等量D-Hank’s
液)、脂多糖组(10mg/L)、乔松素组(加 10mg/L脂多
糖预孵育12h后,按50,100,200mg/L分别加入乔
松素),各组设 8个复孔,继续培养 24h后,光镜下观
察细胞形态。
MTT法检测人脐静脉内皮细胞活性:上述各组细
胞观察大致形态后,每孔加入20μLMTT(2g/L),继续
孵育 4h,倾去上清液,每孔加二甲基亚砜 150μL,振
荡 10min,使蓝紫色结晶充分溶解,全自动酶标仪上
于560nm处测定吸光度(A)值。
ELISA检测细胞损伤标志物血管假血友病因子含
量:抗体为兔抗人血管假血友病因子单克隆抗体,方法
按试剂盒说明书进行,测细胞上清液中血管假血友病
因子抗原含量(%)。
TUNEL检测细胞凋亡:按TUNEL试剂盒说明操
作,用 Image-ProRPlus-Version4.0forwindowsTM
图像处理系统测量凋亡细胞百分比(%)。
主要观察指标:①人脐静脉内皮细胞的形态、活性
及凋亡率。②血管假血友病因子含量的变化。
统计学分析:由第一作者应用SAS7.0统计软件
包进行单因素方差分析,实验数据采用x±s表示。
2 结果
2.1 细胞形态观察 倒置显微镜下察可见空白对照
组细胞紧密贴壁,呈铺路石状。脂多糖组多数细胞呈圆
形,核浓缩;乔松素组上述细胞较脂多糖组明显减少。
2.2 乔松素对脂多糖诱导人脐静脉内皮细胞活性的
影响 见表1。
与空白对照组比较,脂多糖可明显降低细胞活性
(P<0.01),不同浓度乔松素均可明显抑制脂多糖的作
用,增加内皮细胞活性(P<0.05),且有随浓度增加细
胞活性增强的趋势。
2.3 乔松素作用人脐静脉内皮细胞时血管假血友病
因子含量的变化 见表2。
与空白对照组比较,脂多糖组人脐静脉内皮细胞
释放血管假血友病因子含量明显增加 (P<0.01);与
脂多糖组比较,乔松素组人脐静脉内皮细胞释放血管
假血友病因子含量减少 (P<0.05),且50～200mg/L
乔松素呈浓度依赖性减少人脐静脉内皮细胞释放血管
假血友病因子含量。
2.4 乔松素对脂多糖诱导人脐静脉内皮细胞凋亡的
影响 见表3。
表1 乔松素对脂多糖诱导人脐静脉内皮细胞活性的影响
(x±s,n=8,A)
组别
空白对照组
脂多糖组
200mg/L乔松素组
100mg/L乔松素组
50mg/L乔松素组
0.632±0.023
0.335±0.021b
0.513±0.013ac
0.473±0.027ac
0.459±0.025ac
吸光度
与空白对照组比较,aP<0.05,bP<0.01;与脂多糖组比较,cP<0.05
表2 乔松素作用人脐静脉内皮细胞时血管假血友病因子含量的变化
(x±s,n=8,%)
组别
空白对照组
脂多糖组
200mg/L乔松素组
100mg/L乔松素组
50mg/L乔松素组
1.960±0.209
4.301±0.119b
2.924±0.103ac
3.245±0.072ac
3.871±0.025ac
血管假血友病因子
与空白对照组比较,aP<0.05,bP<0.01;与脂多糖组比较,cP<0.05
表3 乔松素对脂多糖诱导人脐静脉内皮细胞凋亡的影响
(x±s,n=8,%)
组别
空白对照组
脂多糖组
200mg/L乔松素组
100mg/L乔松素组
50mg/L乔松素组
14.45±3.95
44.27±4.32b
22.33±2.54ad
31.07±3.81ac
35.95±6.35ac
凋亡率
与空白对照组比较,aP<0.05,bP<0.01;与脂多糖组比较,cP<0.05,dP<0.01
ISSN1673-8225 CN21-1539/R
www.zglckf.com kf23385083@sina.com 李东娟,等.蜂胶乔松素对脂多糖诱导人脐静脉内皮细胞的保护作用
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CRTER
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ISSN1673-8225 CN21-1539/R
www.zglckf.com kf23385083@sina.com李东娟,等.蜂胶乔松素对脂多糖诱导人脐静脉内皮细胞的保护作用
与空白对照组相比,脂多糖明显诱导内皮细胞凋
亡的发生(P<0.01)。50～200mg/L乔松素能明显减少
细胞凋亡的发生,与脂多糖组相比,有显著性差异(P<
0.05),以 200mg/L作用最强(P<0.01),但与空白对
照组相比均未能达到正常水平(P<0.05)。各组内皮细
胞凋亡变化情况见图1。
3 讨论
以动脉粥样硬化为基础的心脑血管疾病是目前发
病率和病死率最高的疾病。在动脉粥样硬化的形成过
程中,内皮细胞病变起着重要的作用。血管内皮细胞可
因许多因素受损,主要包括脂多糖、炎症介质、自由基。
其中脂多糖由于其广泛的生物学作用,越来越引起人
们的关注。大量研究表明,脂多糖参与动脉粥样硬化的
形成过程,特别是动脉粥样硬化血管炎症的初始过程,
脂多糖可通过直接或间接的方式激活并损伤内皮细
胞,引起血管内皮细胞形态与功能的改变[4,5]。近几年
研究发现,在动脉粥样硬化斑块形成的过程中,存在血
管内皮细胞凋亡现象,并反过来参与和加速动脉粥样
硬化进程。
本实验采用人脐静脉内皮细胞体外培养,将乔松
素作用于脂多糖诱导的人脐静脉内皮细胞,观察其对
人脐静脉内皮细胞的影响,探讨乔松素对血管内皮细
胞可能的保护作用。结果发现,脂多糖可明显降低人脐
静脉内皮细胞活性,使人脐静脉内皮细胞释放血管假
血友病因子含量增加,显著诱导内皮细胞发生凋亡;
3种浓度乔松素能显著增强人脐静脉内皮细胞的活
性,减少血管假血友病因子的释放,且均能部分拮抗脂
多糖诱导内皮细胞凋亡,并随着脂多糖浓度增加,细胞
凋亡率也相应增加,以乔松素浓度为 200mg/L时作
用最强,说明乔松素可抑制脂多糖对人脐静脉内皮细
胞的损伤,减少内皮细胞的凋亡,发挥其保护血管内皮
细胞的功能。目前国内外对蜂胶黄酮的研究多集中于
总黄酮的探讨,而对于黄酮单体的研究甚少。进一步加
强蜂胶黄酮化学成分的分离鉴定和对有效成分进行深
入的药理研究,寻找具有活性的化学单体,对阐明蜂胶
防治动脉粥样硬化的相关物质基础和进一步开发利用
蜂胶资源具有重要的意义。
4 参考文献
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2003,19(6):381-383
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其心功能的意义[J].中国临床康复,2003,7(30):4054-4055
a:空白对照组
b:脂多糖组
c:50mg/L乔松素组
d:100mg/L乔松素组
e:200mg/L乔松素组
图1 TUNEL测定各组内皮细胞的凋亡变化情况(×200)
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