全 文 ：[文章编号 ] 　1007-3949(2010)18-05-0351-04 ·实验研究·
乔松素对脂多糖诱导的人脐静脉
内皮细胞凋亡的影响
李　伟 , 李东娟 , 杨　艳
(山东省泰山医学院 , 山东省泰安市 271000)
[关键词 ] 　乔松素;　人脐静脉内皮细胞;　凋亡;　脂多糖
[摘　要 ] 　目的　探讨蜂胶乔松素对脂多糖诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡的影响。方法　用消化灌注法收集人
脐静脉内皮细胞进行体外原代培养 ,于培养液中给予 10mg/L脂多糖处理以建立细胞凋亡模型 ,乔松素处理组于
模型条件培养液中分别加入不同浓度的乔松素 (50、100和 200mg/L)干预 , 共同孵育 24h。光镜下观察细胞形态 ,
MTT法测定细胞存活率以观察细胞增殖变化 ,缺口末端标记技术 TUNEL法检测细胞凋亡率 , 免疫细胞化学法检测
信号转导系统核因子 κB亚基 p65核易位变化。结果　模型组内皮细胞凋亡率明显高于阴性对照组 , 不同浓度乔
松素组细胞凋亡率均低于模型组 ,同时细胞存活率增高(P<0.01)。加入不同浓度乔松素能显著降低脂多糖诱导
的人脐静脉内皮细胞核因子 κBp65核易位活性(P<0.01)。结论　乔松素可通过抑制脂多糖诱导的人脐静脉内
皮细胞凋亡而保护内皮细胞功能 ,其机制可能与抑制核因子 κBp65活化有关。
[中图分类号 ] 　R96 [文献标识码 ] 　A
EffectofPinocembrinonApoptosisinHumanUmbilicalVeinEndothelialCelsIn-
ducedbyLipopolysaccharide
LIWei, LIDong-Juan, andYANGYan
(TaishanMedicalColege, Taian, Shandong271000, China)
[ KEYWORDS] 　Pinocembrin;　HumanUmbilicalVeinEndothelialCells;　Apoptosis;　Lipopolysaccharide
[ ABSTRACT] 　　Aim　Toinvestigatetheefectofpinocembrinonapoptosisofhumanumbilicalveinendothelialcels
(HUVEC)inducedbylipopolysaccharide(LPS).　　Methods　HUVECwerecolectedbydigestion-perfusionculture.
　AnapoptoticmodelofHUVECwasestablishedby10mg/LLPS.　TheapoptosisofHUVECinducedbyLPSwasmixed
withculturemediumof50mg/L, 100 mg/Land200 mg/Lpinocembrin, aftertreatmentof24 hours, HUVECapoptotic
ratewasdetectedbyTUNELassay.　Cell-morphosiswasobservedbylightmicroscope.　Celsurvivalratewasmeasured
byMTTassay.　Expressionofnuclearfactor–kappaBp65(NF-κBp65)wasdetectedbyimmunocytochemistrystaining.
　　Results　HUVECapoptoticrateofmodelgroupincreasedobviouslythancontrolgroup, anddiferentdosagepinocem-
bringroupdiscreasedsignificantlythanmodelgroup(P<0.01).　Meanwhile, celsurvivalratewasincreasedafterpino-
cembrintreatment.　ExpressionofNF-κBp65 inLPSinducedHUVECwasreducedsignificantlyafterpinocembrintreat-
mentcomparedwiththoseinducedapoptosisgroupbyLPS(P<0.01).　　Conclusion　Pinocembrinmayinhibittheap-
optosisofHUVEC, theprotectionmechanismofpinocembrinonHUVECmayberelatedtoreducingtheactivityofNF-κB.
Therebyitplaysaroleinprotectingthevascularendothelialcels.
[收稿日期 ] 　2010-04-20　　　　[修回日期 ] 　2010-05-16
[基金项目 ] 　山东省自然科学基金(Y2008C86)
[作者简介 ] 　李伟 ,教授 ,硕士研究生导师 , 主要研究方向为动脉粥
样硬化发病机制。通讯作者李东娟 ,硕士 , 讲师 ,主要研究方向为动
脉粥样硬化发病机制 , E-mail为 lidongjuan.001@163.com。杨艳 ,硕
士研究生 ,主要研究方向为动脉粥样硬化发病机制。
　　血管内皮细胞的损伤及功能改变是动脉粥样硬
化(athrosclerosis, As)发生的初始环节 [ 1] 。黄酮类
化合物是蜂胶中一类非常重要的生理活性物质 ,具
有多种医疗保健作用 ,其消炎 、抗肿瘤 、提高机体免
疫力和抗病毒等疗效已得到证实[ 2, 3] 。近几年一些
流行病学调查证实 ,摄入富含类黄酮物质食物的量 ,
与 As的发生率和死亡率呈负相关 [ 4, 5] ,其中蜂胶黄
酮具有广泛的抗 As功能 [ 6] 。乔松素是蜂胶黄酮类
化合物中含量较高的一种 ,约为 1.7% ～ 2.8%。本
实验采用人脐静脉内皮细胞 (humanumbilicalvein
endothelialcels, HUVEC)体外培养 ,将乔松素作用
于脂多糖 (lipopolysaccharide, LPS)诱导的 HUVEC,
观察其对脂多糖诱导 HUVEC凋亡的影响 ,探讨乔
松素对血管内皮细胞可能的保护作用。
1　材料与方法
1.1　药物与试剂
乔松素系本院实验室分离纯化(经高效液相色
谱仪检测质量分数 >98%), I型胶原酶 、胰酶和
351CN43-1262 /R中国动脉硬化杂志 2010年第 18卷第 5期
DMEM+F12培养基购自美国 GIBCO公司;脂多糖
(来源于 Escherichia.coliserotypeO55:B5)和 MTT购
自美国 Sigma公司;PAAGoldA11-649胎牛血清购
自澳大利亚 PAA实验室;D-Hank s液由实验室配
制 。缺口末端标记试剂盒 (TUNEL)、核因子 κB
(NF-κB)p65一抗 、SABC免疫组织化学试剂盒购自
武汉博士德生物工程有限公司 。
1.2　人脐静脉内皮细胞的培养和鉴定
取出生 1 h内新生儿脐带用 0.1%胶原酶灌注
消化脐静脉内皮 ,以 20%胎牛血清的 DMEM+F12
培养 ,汇合生长至 80% ～ 90%即行传代。倒置显微
镜下 ,细胞呈典型的铺路石状镶嵌排列 。第 Ⅷ因子
相关抗原间接免疫荧光法鉴定呈阳性。第 2 ～ 3代
细胞用于实验。
1.3　形态学观察和分组
按 1×108 /L将细胞接种于 96及 24孔培养板 。
培养 24 h后 ,换无血清培养液培养 24 h。实验分阴
性对照组(加等量 D-Hank S液)、模型组(10 mg/L
脂多糖)和不同浓度乔松素组(于模型条件培养液
中分别加入 50、100和 200mg/L的乔松素干预),各
组设 8个复孔 ,培养 24 h后 ,光镜下观察细胞形态 。
1.4　MTT法测定细胞存活率
上述各组细胞观察大致形态后 ,每孔加 20 μL
MTT,继续孵育 4h,倾去上清液 ,每孔加二甲基亚砜
150μL,振荡 10 min,使蓝紫色结晶充分溶解 ,酶联
免疫检测仪(英国 Labsys-tems公司)测 A570值 ,细
胞存活率 =实验组 A570 /对照组 A570 ,取平均值。
1.5　TUNEL检测细胞凋亡
按 TUNEL试剂盒说明操作 ,计算阳性细胞凋亡
率(%)。
1.6　免疫细胞化学法检测核因子 κBp65
细胞爬片 ,按照 SABC试剂盒说明操作 ,每组各
取 6张染色片 ,切片于 400倍镜下随机选择 5个视
野 ,计算 NF-κBp65阳性细胞所占比率 。以细胞核
内或核周边出现棕黄色颗粒的细胞为阳性细胞 。用
Image-Pro Plus-Version4.0forwindowsTM图像处理
系统测量 NF-κBp65核易位阳性细胞百分比(%)。
1.7　统计学处理
实验数据用 x±s表示 ,应用 SAS8.0统计软件
进行单因素方差分析和因素相关分析。
2　结 果
2.1　人脐静脉内皮细胞的鉴定
倒置显微镜下 ,培养的细胞呈典型的铺路石状
镶嵌排列;内皮细胞第 Ⅷ因子相关抗原间接免疫荧
光法检测发现 ,阳性细胞达 95%以上 ,胞浆内可见
大量棕色或棕黑色颗粒(图 1)。
图 1.人脐静脉内皮细胞的鉴定　　左为培养的 HUVEC倒置
显微镜下观(×50),右为第Ⅷ因子相关抗原染色照片(×100)。
2.2　乔松素对脂多糖诱导的人脐静脉内皮细胞形
态学的影响
倒置显微镜下动态观察可见阴性对照组细胞紧
密贴壁 ,呈铺路石状生长;模型组可见多数细胞呈圆
形 ,胞膜空泡 ,核浓缩;乔松素组见上述细胞较模型
组明显减少(图 2)。
2.3　乔松素对脂多糖诱导的人脐静脉内皮细胞存
活率的影响
与阴性对照组比较 ,脂多糖可明显降低细胞存
活率(P<0.01),不同浓度的乔松素(50 mg/L、100
mg/L和 200 mg/L)均可明显抑制脂多糖的作用 ,升
高细胞存活率(P<0.05;表 1)。
图 2.乔松素对脂多糖诱导的人脐静脉内皮细胞形态学的影响(×100)　　从左到右依次为阴性对照组 、模型组及 50、 100和 200
mg/L乔松素组。
352 ISSN1007-3949ChinJArterioscler, Vol18, No5, 2010
表 1.乔松素对脂多糖诱导的人脐静脉内皮细胞存活率的影
响(x±s, n=8)
分　组 细胞存活率
阴性对照组 0.632±0.021
模型组 0.335±0.019a
50mg/L乔松素组 0.459±0.025b
100mg/L乔松素组 0.473±0.027b
200mg/L乔松素组 0.523±0.013bc
a为 P<0.01,与阴性对照组比较;b为 P<0.05,与模型组比较;c为
P<0.01,与 50mg/L乔松素组比较。
2.4　乔松素对脂多糖诱导的人脐静脉内皮细胞凋
亡的影响
与阴性对照组比较 ,脂多糖能明显诱导内皮细
胞凋亡的发生(P<0.01)。 50 ～ 200mg/L乔松素能
明显减少细胞凋亡的发生 ,与模型组相比差异有显
著性 (P<0.01);100和 200 mg/L乔松素对细胞凋
亡的抑制作用比 50 mg/L乔松素更明显(P<0.01;
表 2和图 3)。
图 3.TUNEL测定内皮细胞凋亡变化(×100)　　从左到右依次为阴性对照组 、模型组及 50、100和 200mg/L乔松素组。
2.5　核因子 κBp65免疫细胞化学法分析
阴性对照组可见少量细胞胞浆淡染 ,核膜及核
内极少阳性染色;模型组可见多量细胞核膜与近核
膜的胞浆区域深染 ,可见棕黄色颗粒沉积 。加入乔
松素干预后 ,可见多数细胞胞浆淡染 ,核内阳性染色
明显减少 , HUVECNF-κBp65核易位显著减少 ,并呈
现一定的浓度依赖趋势 ,乔松素高浓度抑制 NF-κB
p65核易位作用最明显(表 2和图 4)。
表 2.乔松素对脂多糖诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡和核因
子 κBp65表达的影响(x±s)
分组 细胞凋亡率(n=8) NF-κBp65(n=30)
阴性对照组 2.49%±0.97% 2.72%±0.63%
模型组 11.06%±2.56%a 10.89%±2.57%a
50mg/L乔松素组 3.36%±1.65%b 3.92%±1.41%b
100mg/L乔松素组 2.44%±1.01%bc 2.60%±0.88%bc
200mg/L乔松素组 2.02%±0.66%bc 2.70%±0.45%bc
a为 P<0.01,与阴性对照组比较;b为 P<0.01,与模型组比较;c为
P<0.01,与 50mg/L乔松素组比较。
图 4.核因子 κBp65免疫细胞化学染色结果(×100)　　从左到右依次为阴性对照组 、模型组及 50、100和 200mg/L乔松素组。
2.6　核因子 κB与细胞凋亡率之间的相关性分析
相关分析发现 NF-κBp65与细胞凋亡率正相关
(r=0.99, P=0.0001),因变量 NF-κBp65增加 ,自
变量细胞凋亡率随之增加 。
3　讨 论
以 As为基础的心脑血管疾病是目前发病率和
病死率最高的疾病。在 As形成过程中 ,内皮细胞病
变起着重要作用。脂多糖可通过直接或间接的方式
激活并损伤内皮细胞 ,引起相关细胞因子的合成和
释放 ,引起血管内皮细胞形态与功能的改变 ,导致
As的发生 [ 7, 8] 。
近几年研究发现 ,在 As斑块形成过程中 ,存在血
管内皮细胞凋亡现象 ,并反过来参与和加速 As进程。
本实验通过 MTT法证实三种不同浓度的乔松素均可
拮抗脂多糖诱导的细胞存活率下降 ,并能部分拮抗脂
353CN43-1262 /R中国动脉硬化杂志 2010年第 18卷第 5期
多糖诱导内皮细胞凋亡 ,说明乔松素可抑制脂多糖对
HUVEC的损伤 ,减少内皮细胞的凋亡 ,发挥其保护血
管内皮细胞的功能。
脂多糖在血管内皮细胞的跨膜信号转导是引起
细胞效应的关键 , NF-κB信号转导通路是脂多糖所
介导的信号转导通路中最重要的下游通路 [ 9] 。 NF-
κB是参与免疫和炎症反应的许多基因的多效性调
节基因 , NF-κB激活后可增强各种前炎症因子的转
录和蛋白质表达 ,由此引发细胞黏附性增强 、炎性细
胞趋化 、细胞分化和细胞外基质降解 ,参与并促进
As的进展[ 10, 11] 。 Brand等 [ 12]提出 As可能是 NF-κB
介导的慢性炎症过程 ,在此过程中血管内皮的 NF-
κB激活被认为是 As的起始事件。近年来研究表
明 ,黄酮类化合物可抑制 NF-κB的激活 [ 13] 。本实验
中加入不同浓度乔松素均能显著减少内皮细胞 NF-
κBp65核易位 ,而且 NF-κBp65的核易位程度与细
胞凋亡率呈显著正相关 ,存在明显的依存关系 ,说明
NF-κB对脂多糖引起的血管内皮细胞凋亡率升高可
能起一定的调控作用 ,抑制 NF-κB活化这个中间环
节可能为治疗 As提供一种新的思路。
目前国内外对蜂胶黄酮的研究多集中于总黄酮
的探讨 ,而对于黄酮单体的研究甚少。进一步加强
蜂胶黄酮化学成分的分离鉴定和对有效成分进行深
入的药理研究 ,寻找具有活性的化学单体 ,对阐明蜂
胶防治 As的相关物质基础和进一步开发利用蜂胶
资源具有重要意义。
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(此文编辑　许雪梅)
354 ISSN1007-3949ChinJArterioscler, Vol18, No5, 2010