全 文 ： 中国现代应用药学 2012年 2月第 29卷第 2期 Chin JMAP, 2012 February, Vol.29 No.2 ·159·
UPLC-MS/MS快速鉴定乔松素在人肝微粒体中的代谢产物

李元圆，上官盈盈(浙江医学高等专科学校，杭州 310053)

摘要：目的 以超高效液相色谱质谱联用法(UPLC-MS/MS)快速鉴定乔松素在人肝微粒体中的代谢产物。方法 以人肝
微粒体体外孵育体系对乔松素进行代谢研究，以 UPLC-MS/MS鉴定乔松素的体外代谢产物。结果 建立了乔松素的体外
代谢孵育体系，UPLC-MS/MS在 6 min内检测到乔松素的 4个代谢产物，分别鉴定为柚皮素、5,6,7-三羟基二氢黄酮、5,7,8
-三羟基二氢黄酮和乔松素-7-葡萄糖醛酸苷，这 4个代谢产物均为首次发现的乔松素人肝微粒体体外代谢产物。结论 乔
松素在人肝微粒体中的主要代谢途径为羟基化和葡萄糖醛酸化，5,7,8 -三羟基二氢黄酮是其主要羟基化产物，乔松素-7-
葡萄糖醛酸苷可能为乔松素的主要代谢失活形式。
关键词：乔松素；人肝微粒体；代谢产物；超高效液相色谱质谱联用法
中图分类号：R969.1 文献标志码：B 文章编号：1007-7693(2012)02-0159-05

UPLC-MS/MS Analysis of the Metabolites of Pinocembrin in Human Liver Microsome

LI Yuanyuan, SHANGGUAN Yingying(Zhejiang Medical College, Hangzhou 310053, China)

ABSTRACT: OBJECTIVE To characterize the metabolism of pinocembrin in human liver microsome by UPLC-MS/MS.
METHODS Pinocembrin was incubated with human liver microsomal incubation system. UPLC-MS/MS was used to
characterize the metabolites. RESULTS Naringenin, dihydrobaicalein, dihydronorwogonin and pinocembrin-7-O-glucuronide
were identified within 6 min via UPLC-MS/MS. These 4 metabolites were first reported as the metabolites of pinocembrin in
human liver microsomal incubation system. CONCLUSION The results indicated that pinocembrin can only be metabolited as
the forms of hydroxylation and glucuronidation in human liver microsome. Dihydronorwogonin was the main hydroxylated
metabolite. Pinocembrin-7-O-glucuronide was the predominant deactivated metabolic pathway.
KEY WORDS: pinocembrin; human liver microsome; metabolite; UPLC-MS/MS

姜科植物草豆蔻 Alpinia katsumadai Hayata具
有燥湿健脾、温胃止痛、止呕截疟的功能，主要
用于治疗寒湿内阻、脘腹胀满、冷痛、嗳气呕逆、
不思饮食等症[1]。前期研究表明，乔松素是草豆蔻
发挥传统功效的药效物质基础之一，具有显著的
抑制幽门螺旋杆菌、抗病毒、促进胃肠蠕动等药
理活性[2-5]，有较好的开发应用前景。乔松素在草
豆蔻中含量很高，前期研究建立的以乔松素为主
要指标成分的草豆蔻药材质量标准已被《中国药
典》(2010版一部)收载[6]。黄酮类化合物的代谢过
程对生物活性的发挥、维持乃至毒性的产生都会
产生重大影响，并具有多种药理活性[7-8]。鉴于乔
松素重要的质量控制意义和良好的药理活性，有
必要对其代谢过程进行研究，阐明其在体内的作
用形式。文献研究表明黄酮类化合物在人体内主
要通过 P450酶和 UGT转移酶代谢[9-10]。而乔松素
在人肝微粒体中的代谢形式未见报道。本实验首
次应用超高效液相色谱质谱联用技术 (UPLC-
MS/MS)对乔松素在人肝微粒体中的代谢产物进
行了鉴定，为其体内代谢研究提供了理论基础。
1 材料
1.1 仪器
Waters Acquity UPLC ,Quattro Premier XE质
谱仪(Masslynx4.1 软件)；VDRTEX-5 型调速振荡
器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)；Avanti
J-25I 型高速冷冻离心机(美国 Beckmen)；Himac
CP100MX 型超高速冷冻离心机(日本 Hitachi)；
BP211D型电子天平(德国 Sartorius)。
1.2 药品与试剂
乔松素、柚皮素对照品(上海中药标准化中心，
纯度≥98%)；葡糖-6-磷酸(G-6-P)、葡萄糖-6-磷酸
脱氢酶(D-glucose-6-phosephate dehydrogenase)购
于 Sigma-Aldric 公司；尿苷二磷酸葡糖醛酸
(UDPGA)、烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸(NADP+)、
月桂醇聚氧乙烯醚(Brij)均购于 Fluka公司；Tris 碱
(上海美季生物技术有限公司，分析纯)；乙腈
基金项目：浙江省教育厅资助项目(Y200909605)
作者简介：李元圆，男，博士，讲师 Tel: (0571)87692857 E-mail: lyy3207@163.com
DOI:10.13748/j.cnki.issn1007-7693.2012.02.023
·160· Chin JMAP, 2012 February, Vol.29 No.2 中国现代应用药学 2012年 2月第 29卷第 2期
(Merck公司，色谱纯)；水为超纯水；其他试剂均
为分析纯。
1.3 肝微粒体
人肝微粒体购于瑞德肝脏疾病研究(上海)有
限公司，80 ℃贮存备用。
1.4 色谱条件
Acquity UPLC BEH C18柱(2.1 mm ×50 mm，
1.7 μm)；Van Guard BEH C18，1.7 μm预柱；柱温
45 ℃；流动相为 A(0.1%甲酸)和 B(乙腈)，梯度洗
脱 0~0.5 min，A：90%~75%；0.5~2.0 min，A：
75%~70%；2.0~3.0 min，A：70%~60%；3.0~4.0 min，
A：60%~20%；4.0~5.0 min，A：20%~5%(瞬时变
化)；5.0~6.0 min，A：5%~90%(瞬时变化)；流速：
0.3 mL·min1；进样体积：5 μL。
1.5 质谱条件
电喷雾离子源(ESI)，正离子方式，毛细管电
离电压：3 kV，锥孔电压：40 V，萃取电压：2 V，
离子源温度：120 ℃，去溶剂气温度：400 ℃，喷
雾气：氮气，去溶剂气流速：500 L·h-1，锥孔气流
量：50 L·h-1，碰撞气为氩气，碰撞气流速：0.15
mL·min-1。质谱扫描方式采用全扫、子离子扫描和
选择离子监测(SIR)。
2 方法
2.1 肝微粒体Ⅰ相反应孵育体系
孵育体系包括肝微粒体 0.5 mg·min1，G-6-P
(10 mmol·L1)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(1 U·mL1)，
MgCl2(4 mmol·L1)，磷酸缓冲液(100 mmol·L1，
pH=7.4) ， 乔 松 素 (20 mmol·L1) ， NADP+(1
mmol·L1)，总体积 200 L，其中有机溶剂体积小
于 1%。设反应组，阴性组(NADP+以磷酸缓冲液
代替)和空白组(底物以甲醇代替)。反应从加入
NADP+开始，37 ℃孵育 30 min，加入冰冷乙腈 100
L，冰浴中止反应。13 000 r·min1离心 10 min，
取上清液，进样分析。
2.2 肝微粒体Ⅱ相反应孵育体系
孵育体系包括肝微粒体 0.5 mg·mL1，Brij
(0.05 mg·mL1)， MgCl2(4 mmol·L1)， Tris-HCl
(50 mmol·L1，pH=7.4)，乔松素(20 mol·L1)，
UDPGA(5 mmol·L1)，总体积 200 L，其中有机溶
剂体积<1%。设反应组，阴性组(UDPGA以 buffer
代替)和空白组(底物以甲醇代替)。将肝微粒体
0.5 mg·mL1 与 Brij(0.05 mg·mL1)混匀，预孵
3 min，反应从加入 UDPGA 开始，37 ℃孵育
30 min，加入冰冷乙腈 100 L，冰浴中止反应。
13 000 r·min1)离心 10 min，取上清液，进样分析。
3 结果
3.1 乔松素及其代谢产物的质谱裂解规律
乔松素为二氢黄酮类化合物，易发生碳 1,3和
碳 1,4 断裂。二级质谱分析表明其 A 环主要裂解
碎片为 m/z 153、m/z 97，B环主要裂解碎片为 m/z
131、m/z 103，结果见图 1。若乔松素的单羟基化
发生在 A环，其 A环裂解碎片增加 16，为 m/z 169、
m/z 141(m/z 169－CO)，若单羟基化发生在 B环，
其 B环裂解碎片增加 16，为 m/z 147、m/z 119。

图 1 乔松素主要质谱裂解碎片
Fig 1 Main fragments of pinocembrin
柚皮素为乔松素 4位羟基化产物，对其进行二
级质谱分析，其主要裂解碎片为 m/z 153、m/z 97、
m/z 147、m/z 119与上述推断一致。
3.2 乔松素在人肝微粒体中代谢产物的鉴定
将反应组、空白组、阴性组样品及乔松素、
柚皮素标准品注入超高效液相质谱联用仪，分别
采用全扫(mass scan)、选择离子监测(SIR)和子离子
扫描(daughter scan)模式对样品进行分析比较。在
人肝微粒体Ⅰ相代谢孵育体系中，检测到 m/z 273
的 3 个代谢产物(M1~M3)。在人肝微粒体Ⅱ相代
谢孵育体系中，检测到 m/z 433 的 1 个代谢产物
(M4)。在Ⅰ相及Ⅱ相代谢孵育体系中都检测到了
乔松素原型 m/z 257。见图 2~3。
M1的准分子离子[M+H]+为 m/z 273，比原药
乔松素的准分子离子[M+H]+ m/z 257多 16，其二
级质谱主要碎片离子为 m/z 153，m/z 147、m/z 119，
见图 4B。A环碎片离子 m/z 153与乔松素相同，B
环碎片离子 m/z 147，m/z 119比乔松素 B环碎片离
子 m/z 131、m/z103多 16，说明M1为乔松素 B环
羟基化代谢产物。M1的色谱保留时间、准分子离
子及二级质谱主要碎片离子与柚皮素标准品相
同，见图 4A。因此鉴定代谢产物 M1 为柚皮素
(naringenin)[11]。
中国现代应用药学 2012年 2月第 29卷第 2期 Chin JMAP, 2012 February, Vol.29 No.2 ·161·

图 2 乔松素Ⅰ相代谢产物及原型的选择离子流色谱图
A阴性组选择离子 m/z 273；B反应组选择离子 m/z 273；C反应组
选择离子 m/z 257；D柚皮素对照品选择离子 m/z 273
Fig 2 Chromatograms of pinocembrin and its phase Ⅰ
metabolites in SIR mode
Anegative control m/z 273; Breaction group m/z 273; Creaction group
m/z 257; Dnaringenin standard m/z 273

图 3 乔松素Ⅱ相代谢产物M4及原型的选择离子流色谱图
A阴性组选择离子 m/z 433；B反应组选择离子 m/z 433；C反应组
选择离子 m/z 257
Fig 3 Chromatograms of pinocembrin and its phaseⅡ
metabolites in SIR mode
A-negative control m/z 433; B-reaction group m/z 433; C-reaction group
m/z 257
M2、M3的准分子离子[M+H]+为 m/z 273，比
原药乔松素的准分子离子[M+H]+ m/z 257 多出
16。M2的二级质谱主要碎片离子为 m/z 169，m/z
141，m/z 131，M3的二级质谱主要碎片离子为 m/z
169，m/z 141，m/z 131，m/z 103，见图 4C和 4D。
M2 和 M3 的 A 环碎片离子比乔松素多 16，说明
M2、M3 为乔松素的 A 环羟基化产物。乔松素 A
环可以羟基化的位点为 6 位和 8 位，文献表明黄
酮类化合物的 5,6,7-三羟基取代产物较 5,7,8-三羟
基取代产物极性略大，保留时间短[12]。代谢产物
M2的保留时间为 2.77 min，M3为 3.18 min，因此，
推断 M2 为 5, 6, 7-三羟基二氢黄酮 (dihydro-
baicalein)，M3为 5, 7, 8-三羟基二氢黄酮(dihydro-
norwogonin)。
M4的准分子离子[M+H]+为 m/z 433，比原药
乔松素的准分子离子[M+H]+ m/z 257多出 176，二
级质谱主要碎片离子为 m/z 257，m/z 153，m/z 131，
m/z 103与乔松素一致，见图 4E。推断为乔松素的
葡萄糖醛酸化代谢产物。黄酮类化合物上羟基发
生葡萄糖醛酸化的优先顺序为 7-、3-、3-或 4-羟
基上[13-14]。在乔松素人肝微粒体 P450酶Ⅱ相代谢
体系中只检测到一个葡萄糖醛酸化代谢产物，根
据优先顺序，初步鉴定 M4 可能为乔松素-7-葡萄
糖醛酸苷。
4 讨论
本实验首次建立了 UPLC-MS/MS快速分析鉴
定乔松素在人肝微粒体中代谢产物的方法，在 6
min内即可对乔松素的主要代谢产物进行分离、鉴
定，具有分析时间短、灵敏度高、选择性好的优
点。实验结果表明，乔松素在人肝微粒体中的主
要代谢途径为 I相代谢羟基化反应，产物为M1、
M2、M3 及 II 相代谢葡萄糖醛酸化反应，产物为
M4，见图 5。未发现其甲基化和硫酸化代谢产物。
其主要羟基化产物为 5,7,8 -三羟基二氢黄酮，仅有
及少量代谢为柚皮素和 5,6,7 -三羟基二氢黄酮，说
明 5,7,8 -三羟基二氢黄酮可能是乔松素在人体内
发挥药理活性的作用形式之一。乔松素在人肝微
粒体中的Ⅱ相代谢产物只检测到乔松素-7-葡萄糖
醛酸苷，其转化率较高，可能为乔松素的主要代
谢失活途径。本实验室也对乔松素大鼠灌胃给药
后的体内代谢产物进行了研究，在大鼠尿液、粪
便样品中检测到柚皮素和乔松素-7-葡萄糖醛酸
苷，在胆汁样品中检测到乔松素-7-葡萄糖醛酸苷，
此结果与人肝微粒体体外代谢结果相近，进一步
验证了乔松素在人肝内代谢途径的推断，为其体
内代谢研究提供了理论基础。
·162· Chin JMAP, 2012 February, Vol.29 No.2 中国现代应用药学 2012年 2月第 29卷第 2期

图 4 乔松素代谢产物的二级质谱图
A柚皮素对照品；BM1；CM2；DM3；EM4
Fig 4 MS/MS spectra of the metabolites from pinocembrin
Anaringenin standard; BM1; CM2; DM3; EM4

图 5 乔松素人肝微粒体中的代谢途径
Fig 5 The metabolic pathway of pinocembrin in human
liver microsome
REFERENCES
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收稿日期：2011-05-11



HPLC测定逍遥丸中甘草苷、异甘草素和甘草酸的含量

成英，宋九华*(乐山师范学院化学与生命科学学院功能性分子设计中心，四川 乐山 614004)

摘要：目的 建立测定逍遥丸中甘草苷、异甘草素和甘草酸含量的方法。方法 色谱柱：Shim-packVP-ODS(150 mm×
4.6 mm，5.0 μm)。流动相：甲醇-0.5%冰醋酸梯度洗脱；流速 1 mL·min1；检测波长 0～7 min为 276 nm，7～18 min为
370 nm，18 min以后为 254 nm。结果 甘草苷的线性范围是 0.018 40～0.368 0 μg(r=0.999 8，平均回收率为 97.96%，RSD
为 0.60%)；异甘草素的线性范围是 0.015 2～0.304 0 μg(r=0.999 9，平均回收率为 97.17%，RSD为 1.02%)；甘草酸的线
性范围是 0.441 8～8.835 0 μg (r=0.999 9，平均回收率为 97.52%，RSD为 1.06%)。结论 所建立的方法简便可行、重复
性好，可用于逍遥丸的质量控制。
关键词：高效液相色谱法；逍遥丸；甘草苷；异甘草素；甘草酸
中图分类号：R284.1; R917.101 文献标志码：A 文章编号：1007-7693(2012)02-0163-04

Determination of Liquiritin, Glycyrrhizic Acid and Isoliquiritigenin in Xiaoyao Wan by HPLC

CHENG Ying, SONG Jiuhua*(Center for Functional Molecular Design, College of Chemistry and Life Science, Leshan
Normal University, Leshan 614004, China)

ABSTRACT：OBJECTIVE To develop an HPLC method for the liquiritin, glycyrrhizic acid and isoliquiritigenin in Xiaoyao
Wan. METHODS The column Shim-pack VP-ODS(150 mm×4.6 mm，5.0 μm)was used. The mobile phase consisted of
methanol-0.5% acetic acid with a gradient elution, and the flow rate was 1.0 mL·min1. The detection wavelengthes were 276 nm
in 0-7 min, 370 nm in 7-18 min, 254 nm after 18 min．RESULTS The linear range of liquiritin was 0.018 400.368 0 μg,
r=0.999 8. The average recovery was 97.96%, RSD=0.60%. The linear range of glycyrrhizic acid was 0.015 200.304 0 μg ,
r=0.999 9. The average recovery was 97.17%, RSD=1.02%. The linear range of isoliquiritigenin was 0.441 88.835 0 μg , r
=0.999 9. The average recovery was 97.52%, RSD=1.06%. CONCLUSION This method is simple, feasible, and the
repeatability is good. It can be used for quality control of Xiaoyao Wan.
KEY WORDS: HPLC; Xiaoyao Wan; liquiritin; glycyrrhizic acid; isoliquiritigenin

逍遥丸(浓缩丸)由柴胡 100 g、当归 100 g、白
芍 100 g、白术(炒)100 g、茯苓 100 g、薄荷 20 g、
生姜 100 g、甘草(蜜炙) 80 g 组成，本品为亮黑色
的浓缩丸；气微，味甜、辛、而后苦。具有舒肝
清热、健脾养血的功能，用于肝郁血虚、肝脾不
和、两胁胀痛、头晕目眩、倦怠食少、月经不调、
脐腹胀痛的治疗[1]。
甘草是一种药用价值高的荒漠草原药用植物，
其主要有效成分为甘草酸和黄酮类化合物，具有
明显的抗肿瘤、抗溃疡、抗菌、降血脂和镇痛的
作用，并对爱滋病病毒有很强的抑制增殖作用[2-8]，
是甘草有效成分开发的热点。甘草黄酮的主要成
分甘草苷，是反映甘草黄酮内在质量的一个重要
指标[9]。经典的黄酮含量测定方法，是以芦丁为对
照品，采用紫外分光光度法测定[10-11]，但此方法
用于甘草黄酮的测定尚有诸多不足之处。目前也
基金项目：四川省教育厅支持项目(10zB024)
作者简介：成英，女，博士，副教授 Tel: 13308133386 E-mail: cying215@hotmail.com *通信作者：宋九华，女，高级实验师
Tel: 13628196037 E-mail: songjh@lstc.edu.cn