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天仙果根总黄酮提取工艺研究



全 文 :天仙果根总黄酮提取工艺研究
王喜周1,应跃跃2,张 昊1,姚晓伟1,陈学智3
(1.丽水学院医学院,浙江丽水 323000;2.丽水市质量技术监督检测院,浙江丽水 323000;3.景宁县人民医院,浙江丽水 31000)
摘要 [目的]优选天仙果根中总黄酮的超声辅助提取工艺。[方法]以总黄酮的含量为指标,采用单因素试验考察乙醇浓度、料液比、
提取时间和提取次数对天仙果根部总黄酮得率的影响,并采用正交试验优选天仙果根总黄酮的超声辅助提取工艺。[结果]4个因素对
天仙果根部总黄酮提取得率的影响大小顺序为:料液比 >乙醇浓度 >提取时间 >提取次数;最佳提取工艺为:提取溶剂乙醇的浓度为
50%,料液比 1∶ 20( W/V,g /ml,下同) ,提取 2次,每次 60 min;在此条件下,天仙果根部总黄酮得率为 27. 83 mg /g。[结论]提取工艺合
理,测定方法简单、快速、准确,为天仙果深度开发提供了科学依据。
关键词 天仙果( Ficus erecta Thunb. var. beecheyana ( Hook. et Arn. ) King) ; 总黄酮; 提取工艺;紫外分光光度法
中图分类号 S663 文献标识码 A 文章编号 0517 -6611( 2013) 02 -00601 -03
Extraction and Determination of Total Flavonoids from Ficus beecheyana Radix
WANG Xi-zhou et al ( Medical College of Lishui University,Lishui,Zhejiang 323000)
Abstract [Objective]To optimum ultrasonic-assisted extraction technique of total flavonoids in radix of Ficus beecheyana. [Method]Effects of
ethanol concentration,solid-liquid ratio,extraction time and times on yield of total flavonoids were investigated by using orthogonal test,and the
contents were determined by UV spectrophotometry. [Result]The order of influencing factors is: solid-liquid ratio > ethanol concentration > ex-
traction time > extraction times; the optimal extraction technique is: ethanol concentration 50%,solid-liquid ratio 1∶ 20( W/V,g /ml,the same as
follows) ,extraction 2 times and extraction time 60 min. Under these optimum conditions,the extraction efficiency of total flavonoids reached as
high as 27. 83 mg /g. [Conclusion]The extraction technique is proper,the determination method is simple,rapid and accurate,which will pro-
vide a scientific basis for deeply utilization of Ficus beecheyana.
Key words Ficus beecheyana; Total flavonoids; Extraction technique; UV spectrophotometry
基金项目 浙江省科技厅公益项目( 2011C23128 ) ; 2010 年度丽水学院
重点科研项目( kz201018 ) ; 2011 年度丽水市科技局公益项
目( 20111JYZB20) 。
作者简介 王喜周( 1969 - ) ,男,浙江缙云人,讲师,工程师,硕士,从事
天然药物研究,E-mail: wangxizhou88w@ sina. com。
收稿日期 2012-12-03
天仙果(Ficus erecta Thunb. var. beecheyana (Hook. et
Arn.)King)为桑科(Moraceae)榕属(Ficus)植物,又名大号
牛奶仔、牛奶柴、鬼馒头[1]、细叶牛乳绳、小叶牛奶绳、小攀
坡[2]、牛奶浆、野枇杷、牛奶珠、毛天仙果[3],最早记载于《本
草纲目》[4],主要分布于浙江、江西、福建、安徽、湖北、湖南、
广东、广西、四川、贵州和河南等地。天仙果是畲族常用的畲
药,也是苗药之一。其根入药,性温、味甘、淡、无毒,具有补
中益气、健脾化湿、行气活血、强筋壮骨、祛风通络和清热解
毒等功效,主治风湿痹痛、贫血、月经不调、脱肛、骨结核、皮
肤搔痒、跌打损伤和劳倦乏力等[5 -8]。天仙果除了药用之
外,在浙南山区还被用作烹制菜肴的调味品、保健品;其嫩叶
也是一种野菜[9]。
黄酮是自然界中广泛存在的化合物。在唇形科(Lami-
aceae)、玄参科(Scrophulariaceae)、爵床科(Acanthaceae)和菊
科等植物中分布较多。研究表明,桑科榕属植物中也富含黄
酮类化合物,如条叶榕(Ficus pandurata Hance var. angustifolia
Cheng)、全叶榕(Ficus pandurata Hance var. holophylla Migo)、
小叶榕(Ficus microcarpa var. pusillifolia)、薜荔(Ficus pumila)、
无花果(Ficus carica Linn)、珍珠莲(Ficus foveolata)、孟加拉湾
榕、聚果榕(Ficus racemosa Linn)和金卓叶(Ficus deltoidea)等。
榕属药用植物中的黄酮类活性物质具有广泛的生物活性作用,
如抗氧化、清除自由基、抗胆碱酯酶、护肝作用、抗血管紧张素
转换酶、抗菌、抗炎、抗动脉粥样硬化、抗醛糖还原酶、降血糖
等[10 -20]。笔者对天仙果根部的黄酮提取工艺进行研究,以期
为充分发掘利用天仙果药用资源提供依据。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 研究对象。野生天仙果,于 2010 年 8 月中旬采自遂
昌白马山国家森林公园,经丽水食品药品监督所李建良鉴定
为 Ficus erecta Thunb. var. beecheyana(Hook. et Arn.)King。
1. 1. 2 主要仪器。756型分光光度计,购自上海精密科学仪
器有限公司;KQ-100DB型数控超声波清洗器,购自昆山市超
声仪器有限公司;台式离心机,购自上海安亭科学仪器厂;手
提式高速中药粉碎机,购自温岭市大德中药机械有限公司。
1. 1. 3 主要试剂。纯度为 99%芦丁标准样品,购自中国药
品生物制品检定所;无水乙醇,氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝、
浓盐酸、四氢化二硼钠、镁粉、三氯化铝均为分析纯,市售。
1. 2 方法
1. 2. 1 样品的预处理。随机选取 20 株天仙果,取根部,水
洗、晾晒后置 60 ℃烘箱中烘干,粉碎,混匀,过 3 号筛,装保
鲜袋,冷藏备用。
1. 2. 2 供试品溶液制备。精密称定天仙果根粉末 1. 000 g,
置 100 ml容量瓶中,按设计的工艺条件(乙醇浓度、料液比、
提取时间和提取次数)超声辅助(功率 250 W,频率 40 kHz)
提取,真空抽滤,放冷,用相同浓度的乙醇溶液定容至容量瓶
刻度,摇匀,得供试品溶液。
1. 2. 3 对照品溶液的制备。精密称取 120 ℃干燥至恒重的
芦丁对照品适量,加浓度 70%乙醇制成浓度为 0、0. 10、0. 20、
0. 30、0. 40和 0. 50 mg /ml的溶液,即得。
1. 2. 4 线性关系的考察。精密量取对照品溶液 1. 0 ml分别
安徽农业科学,Journal of Anhui Agri. Sci. 2013,41(2):601 - 603 责任编辑 石金友 责任校对 卢瑶
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2013.02.017
置 10 ml容量瓶中,加 4. 0 ml浓度 70%乙醇,再加 0. 3 ml浓
度 5%的 NaNO2 溶液,摇匀静置 5 min,接着加 0. 3 ml 浓度
10%的 Al(NO3)3 溶液,摇匀静置 5 min,然后加 3. 0 ml 浓度
4%的 NaOH溶液,最后用浓度 70%的乙醇定至刻度,摇匀,
放置 15 min,以不加对照品溶液为空白,在 510 nm波长处测
定吸光度。以芦丁溶液浓度(C)为横坐标,吸光度(A)为纵
坐标,用最小二乘法作线性回归,计算线性回归方程。
1. 2. 5 总黄酮的测定[11,21]。(1)总黄酮的检识[21 -22]。采用
四氢化二硼钠反应、盐酸 -镁粉反应、三氯化铝反应和浓氨
水反应。(2)含量测定。采用分光光度法。黄酮类化合物在
亚硝酸盐存在的碱性条件下与铝离子形成稳定的红色络合
物。此络合物在 510 nm处有吸收带,然后用分光光度法直
接测定样品液中总黄酮的含量。精密量取供试品溶液 1. 0
ml加入 10 ml容量瓶,按“1. 2. 4”项下方法测定其吸光度,根
据回归方程计算出供试品溶液中总黄酮的含量。同样方法
平行 3次,求均值。
1. 2. 6 单因素试验[9]。(1)乙醇浓度。称取天仙果根粉末5
份,每份 1. 000 g,加入 10 ml的浓度分别为 30%、50%、70%、
80%和 95%的乙醇,超声辅助提取 45 min,按“1. 2. 4”项下方
法测定提取液中总黄酮的含量。(2)料液比。称取天仙果根
粉末 5份,每份 1. 000 g,分别加入 5、10、20 和 25 ml 的浓度
70%乙醇,并超声辅助提取 45 min,按“1. 2. 4”项下方法测定
提取液中的总黄酮含量。(3)提取时间。称取天仙果根粉末
5份,每份 1. 000 g,加入 10 ml的浓度 70%乙醇,分别超声提
取 15、30、45、60、75和 90 min,按“1. 2. 4”项下方法测定提取
液中总黄酮含量。(4)提取次数。称取天仙果根粉末 4 份,
每份1. 000 g,用10 ml的浓度70%乙醇,分别超声提取1、2、3
和 4次,每次 45 min,按“1. 2. 4”项下方法测定提取液中总黄
酮含量。
1. 2. 7 正交试验[21 -22]。为了综合考察影响因素,根据单因
素试验结果,设置乙醇浓度、料液比、提取时间和提取次数共
4个因素,每个因素 3 水平,即 L9(3
4)进行正交试验。根据
表 1设定的工艺条件,超声辅助提取天仙果总黄酮,取 1. 0
ml滤液,测定总黄酮含量,每个试验重复 3次,根据统计学处
理结果确定最优提取工艺。
表 1 正交试验因素水平设计
水平
因素
A料液比
g /ml
B提取
次数
C提取时间
min
D乙醇
浓度∥%
1 1∶ 20 2 45 60
2 1∶ 25 4 75 50
3 1∶ 15 3 60 70
1. 2. 8 正交试验最佳提取工艺的重复性验证。根据正交试
验得出的最佳工艺,超声辅助提取天仙果根的总黄酮,并测
定其含量,重复 3次,取均值,检验最佳提取工艺的重现性。
1. 2. 9 统计方法。采用 SAS数据处理软件和 Excel 软件处
理,回归分析采用 t检验,正交试验方差分析采用 F检验,总
黄酮含量均数采用 t检验。
2 结果与分析
2. 1 供试液总黄酮的检识 试验结果表明,盐酸 -镁粉反
应显红色;四氢硼钠反应显红色;三氯化铝反应显黄色并有
荧光;氨水反应呈黄褐色荧光,表明含有总黄酮成分。
2. 2 线性关系的考察 计算得线性回归方程为:Y = 1. 320 0
X -0. 007 1(R =0. 999 4)。试验结果表明,在 0 ~0. 05 mg /ml
范围内,芦丁浓度与吸光度的线性关系良好。
2. 3 单因素试验
2. 3. 1 乙醇浓度。图 1表明,乙醇浓度在 30% ~ 50%时,黄
酮的得率增加;当乙醇浓度超过 70%时,黄酮的得率随乙醇
浓度增加而下降。所以取浓度 50% ~ 70%乙醇作为提取溶
剂较好。
图 1 乙醇浓度对天仙果根部总黄酮得率的影响
2. 3. 2 料液比。图 2表明,黄酮得率在料液比为 1∶ 5 ~ 1∶ 20
时呈上升趋势,但在 1∶ 20 ~ 1∶ 25 时变化不明显。从经济角
度出发,选择料液比在 1∶ 15 ~1∶ 25时较好。
图 2 料液比对天仙果根部总黄酮得率的影响
2. 3. 3 提取时间。图 3表明,提取时间在 15 ~ 75 min时,总
黄酮得率呈上升趋势,但在 75 min后呈下降趋势。故时间以
45 ~75 min较佳。
图 3 提取时间对天仙果根部总黄酮得率的影响
206 安徽农业科学 2013 年
2. 3. 4 提取次数。图 4 表明,提取次数为与黄酮得率呈正
相关,综合考虑成本及提取效率的因素,提取次数以 2 次
较好。
图 4 提取次数对天仙果根部总黄酮得率的影响
2. 4 正交试验 由表 2 可知,料液比对天仙果根总黄酮提
取得率的影响最大,其次是提取溶剂乙醇的浓度。4 个因素
影响从大到小依次为:料液比 >乙醇浓度 >提取时间 >提取
次数。料液比与黄酮得率呈正相关,料液比越高,天仙果根
内外的黄酮浓度差增高,所以黄酮得率增加;在乙醇浓度为
50%时提取得率最大,其原因可能是天仙果根总黄酮中的苷
类含量较高,提取溶剂乙醇的浓度超过 50%时,黄酮的溶解
性下降[21];另外提取时间对总黄酮提取得率也有一定影响,
随着提取时间的延长,提取得率略有提高。
根据单因素试验和正交试验的结果,参考经济经济因
素,得到较优的提取工艺条件为:A1B1C3D2,即以天仙果根总
黄酮得率为指标,超声辅助提取溶剂为浓度 50%乙醇溶液,
料液比 1∶ 20,提取 2次,每次 60 min。
表 2 正交试验结果
试验号
因素
A B C D
天仙果总黄
酮含量∥mg /g
1 1 1 1 1 20. 46
2 1 2 2 2 24. 41
3 1 3 3 3 23. 25
4 2 1 2 3 23. 01
5 2 2 3 1 21. 59
6 2 3 1 2 23. 12
7 3 1 3 2 20. 75
8 3 2 1 3 18. 71
9 3 3 2 1 16. 04
k1 22. 71 21. 40 20. 43 19. 36
k2 22. 57 21. 24 21. 15 22. 76
k3 18. 17 20. 80 21. 86 21. 32
R 4. 54 0. 60 1. 43 3. 40
注:以上试验结果均为 3次重复的平均值;影响因素经 F检验,没有明
显差异。
2. 5 天仙果根的总黄酮含量 以选择料液比1∶ 20、提取次数2
次、提取时间 60 min、提取溶剂乙醇浓度 50%为条件进行验证
试验,重复 3次,测得天仙果根黄酮得率平均值为27. 83 mg /g,
比 A1B2C2D2 的得率(24. 41 mg /g)提高 14. 01%。
3 结论
试验利用超声波(功率 250 W,频率 40 kHz)辅助技术提
取天仙果根中的总黄酮,其最佳工艺条件为:提取溶剂为浓
度 50%乙醇溶液,料液比 1∶ 20,提取 2 次,每次 60 min;在此
工艺条件下,天仙果根的总黄酮得率为 27. 83 mg /g。按照研
究的提取工艺条件从天仙果根中提取总黄酮,可以获得到较
高的得率,值得进行进一步的研究。
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