全 文 ：微生物学通报 Sep. 20, 2013, 40(9): 16641672
Microbiology China © 2013 by Institute of Microbiology, CAS
tongbao@im.ac.cn


基金项目：国家自然科学基金青年科学基金项目(No. 31000243); 云南省西南林业大学生物技术特色专业建设项目
(No. 50116001); 西南林业大学大型仪器设备共享平台资助项目
*通讯作者：Tel: 86-871-5167696; : chenjy@xtbg.ac.cn
收稿日期：2013-02-01; 接受日期：2013-04-15
简 报
对叶榕榕果内生细菌分离鉴定及抑菌活性的研究
朱丽丽 1 陈吉岳 2* 熊智 1 刘绍雄 1 张静宜 1 田荣荣 1
(1. 西南林业大学 云南 昆明 650233)
(2. 中国科学院西双版纳热带植物园 云南 昆明 650233)


摘 要: 【目的】为植物-内生细菌的生态关系研究, 以及植物内生细菌资源的利用提供
一定的依据。【方法】采用微生物学传统分离培养的方法从对叶榕果实中分离到内生细菌
54株, 通过限制性酶切分析(ARDRA)共有 16个操作分类单元(Operational taxonomic units,
OTUs), 对 16株代表菌株 16S rDNA序列系统发育分析。【结果】16个菌株都找到了与其
相似性最高的菌株, 相似性达到 95%−100%。其中 6株为芽孢杆菌 Bacillus属, 为对叶榕
果实内生细菌优势菌属; 3株为 Staphylococcus属, 2株为 Pseudomonas属, 1株为 Serrata
属, 1 株为非培养细菌的同源菌, 1 株为 Kocuria 属, 1 株为 Delftia 属, 还有 1 株为
Acinetobacter属。【结论】这 16株内生菌在系统发育树中明显聚为两大支; 在参与抑菌试
验的 14株内生菌中, 有 13株对受试菌有不同程度的拮抗作用。尤其是其中的芽孢菌属的
Swx15和不动杆菌属的 Swx25菌株, 抑菌作用较强, 且有较广的抑菌谱性。
关键词: 对叶榕, 内生细菌, 分离, 鉴定, 系统发育分析, 抑菌







朱丽丽等: 对叶榕榕果内生细菌分离鉴定及抑菌活性的研究 1665

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Isolation, identification and the inhibition effect endophytic
bacteria in Focus hispida fruit
ZHU Li-Li1 CHEN Ji-Yue2* XIONG Zhi1 LIU Shao-Xiong1
ZHANG Jing-Yi1 TIAN Rong-Rong1
(1. Southwest Forestry University, Kunming, Yunnan 650233, China)
(2. Xishuangbanna Tropical Botanical Garden, Chinese Academy of Sciences,
Kunming, Yunnan 650233, China)
Abstract: [Objective] To provide a certain basis, for the relationship between the ecology of
endophytic bacteria and plant as well as the resources of endophytic bacteria. [Methods] Use
tradational cultural methods isolated 54 endophytic bacteria from the fruit of Focus hispida
through the restriction enzyme analysis (ARDRA) told have 16 operational taxonomic units,
16S rDNA sequence system development analysis on 16 representative strains. [Results] The
results showed that 16 strains were found the highest similarity of strains from GenBank, the
identities are from 95% to 100%. Six endophytic bacreia were classed to Bacillus genera, the
identities are from 95% to 98%, was the dominant genus among the endophytic bacteria in
Focus hispida fruit. Three were classed to Staphylococcus genera, one were classed to Pseu-
domonas genus, one was similar to uncultured bacterium, one were classed to Kocuria genus,
one were classed to Delftia genus. [Conclusion] The phylogenic tree showed that the 16
endophytic bacteria clustered two main branches. The inhibition experiment of 14 endophytes
bacteria, 13 strains have different degrees of inhibition effect. Especially the swx15 of Bacillus
genus and the swx25 of Acinetobacter genus had the biggest inhibition spectrum.
Keywords: Focus hispida, Endophytic bacteria, Isolation, Identification, Phylogenetic analysis,
Inhibition
对叶榕(Focus hispida L.)为桑科榕属植物,
雌雄异株, 灌木或小乔木, 隐头果少有腋生或生
于落叶枝上, 多数生于老茎发出的下垂无叶枝
上。分布在广东、海南、广西、云南及贵州, 国
外分布在印度、泰国、马来西亚等地[1]。在西双
版纳地区, 该榕树主要分布在季节性雨林遭破坏
后的荒地、城镇、村庄旁和房屋前后, 是热带地
区典型的先锋种[2]。其根、叶、树皮为傣族、基
诺族常用药, 味甘, 性凉, 有清热祛湿、消积化
痰、行气散瘀等功效, 主要用于痢疾、结膜炎、
感冒、支气管炎、腹胀疼痛、风湿痛、跌打劳伤
等的治疗[3]。
植物内生菌是指在其生活史的一定阶段生活
在活体植物组织内, 不易受环境的影响, 可在植
株体内定殖和传导, 而不引起植物明显病害与植
物建立和谐联合关系的微生物, 主要包括真菌、
细菌和放线菌[4−5]。健康植物体内存在大量的内生
细菌, 具有丰富的物种多样性和生态分布多样
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性, 目前从经济作物中发现的拮抗内生细菌已
超过 745种隶属于 8个属[6]。某些内生细菌可通
过产生抗生素、水解酶类等抗菌活性物质在植株
体内直接或间接影响植物的生理作用, 诱导宿
主植物的抗性反应长期发挥生防作用, 因此受
到国内外研究者的广泛重视[7−8]。近年来, 国内
外从多种植物内生菌中筛选出具有防病或诱导
抗病作用的内生菌, 例如石晶盈等[9]从番木瓜里
分离出对 10 种病原菌具有较强拮抗活性的铜绿
假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa); 陈敏等 [10]
从黄瓜体内分离到 1株内生拮抗菌株 HE-1对黄
瓜青枯菌(Ralstonia solanacearum)有较好的抗菌
效果。然而国内外有关榕树内生菌的研究比较
少, 仅有 Suryanarayanan 和 Vijaykrishna 调查了
印度孟加拉榕(Ficus benghalensis L.)的叶片、叶
柄、空气中的气生根和靠近土壤的气生根等不同
组织上内生真菌的多样性 [11]; 苏印泉等对无花
果(Ficus carica)根、茎、叶内生真菌进行了分离、
鉴定[12], 张弘驰等(2007)对这些内生真菌的抗病
原真菌活性进行了筛选试验[13]。关于榕果内生细
菌的研究尚未见报道。本研究通过对对叶榕榕果
内生细菌进行分离, 并对具有广谱抗菌活性的
菌株进行初步筛选, 从而为植物-内生细菌的生
态关系研究以及植物内生细菌资源的利用提供
一定的依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样品采集: 对叶榕榕果采自云南省西双版
纳热带植物园, 采样时间为 2011 年 11 月中旬。
在榕树园内, 选取无明显植物病害的对叶榕树 15
棵并采集健康的榕果。采集后马上回实验室进行
分离。
1.1.2 供试菌株: 详见表 1。
1.1.3 分离培养基(g/L): 改良牛肉膏蛋白胨培养

表 1 供试病原菌及其来源
Table 1 The tested pathogenies and their source
编号
Number
病原菌
Pathogenic bacteria
来源
Source
B1 白菜黑斑病 云南农业大学
B2 稻瘟病 云南农业大学
B3 柑橘青霉菌 云南农业大学
B4 黄瓜枯萎病 云南农业大学
B5 番茄早疫病 云南农业大学
B6 梨黑星病 云南农业大学
B7 番茄灰霉病 云南农业大学

基(NA)。1 000 mL NA培养基中含 20 mL无菌对
叶榕榕果水浸液和 5万单位制霉菌素。对叶榕榕
果水浸液的制备方法为: 取健康榕果打碎后, 称
取 80 g加入 200 mL水, 1×105 Pa灭菌 20 min后
用无菌纱布过滤。
1.1.4 主要试剂和仪器: 蛋白胨、NaCl、牛肉膏、
琼脂、葡萄糖、细菌基因组 DNA 快速提取试剂
盒(溶液型)、2×Taq PCR MasterMix等, 购自昆明
硕阳科技有限公司; 16S通用引物(27f−1492r), 上
海生物工程技术服务有限公司合成。凝胶成像系
统为T2A, PCR仪为MJ Mini, 美国Bio-Rad公司。
1.2 内生细菌的分离与纯化
将新鲜、无虫害的隐头果用肥皂水刷洗, 清
水冲洗干净, 沥干水分后用 75%酒精漂洗 30 s,
无菌水冲洗 3−4次, 0.1%升汞浸泡 10 min, 无菌
水冲洗 6−7 次, 以去掉表面消毒剂。加无菌石英
砂研磨, 梯度稀释至 10−3, 每一稀释梯度采用稀
释分离法[14]涂布 10 个分离平板。每个样品都取
最后一次无菌水洗液涂于相应平板上, 以检测表
面消毒是否彻底。定期观察分离平板, 挑取分离
纯化好的单菌落于试管斜面中存于 4 °C备用。
1.3 形态观察
在光学显微镜下观察个体形态并测量菌体大
小; 参照文献[15]进行革兰氏染色和芽孢染色方
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法进行形态结构观察, 以《伯杰氏细菌鉴定手册》
及《常见细菌系统鉴定手册》为依据对菌株进行
初步鉴定。
1.4 DNA提取和 16S rDNA扩增
用细菌基因组 DNA 快速提取试剂盒(溶液
型), 提取菌株基因组 DNA 后, PCR 扩增 16S
rDNA。细菌引物 27f: 5′-AGAGTTTGATCCTGG
CTCAGAACGAACGCT-3′和1492r: 5′-TACGGCT
ACCTTGTTACGACTTCACCCC-3′[16]。PCR采用
50 µL反应体系: 2×Taq PCR MasterMix 25 µL,
Each primer (10 µmol/L) 2.5 µL, DNA (20 mg/L)
1 µL, 补足灭菌双蒸水至 50 µL。16S rDNA-PCR
扩增条件: 95 °C 5 min; 95 °C 30 s, 55 °C 30 s,
72 °C 3 min, 共 30个循环; 72 °C 10 min; 4 °C
30 min。PCR产物检测: 经质量分数为 1.0%琼脂
糖凝胶电泳后 4S 核酸染料染色观察, 用凝胶成
像仪照相。
1.5 核糖体 DNA 扩增片段限制性酶切分析
(ARDRA)
采用 HinfⅠ和 TaqⅠ对上述的 16S rDNA 进
行酶切, 其反应体系为: HinfⅠ 15 U, TaqⅠ15 U,
10×Taq Basal buffer 2 µⅠ L, 0.1% BSA 2 µL, DNA
10 µL (≤1 μg), 灭菌水补充到 20 µL。37 °C反应
2−3 h后再于 65 °C反应 2 h, 用 4S染料染色, 用
浓度为 1.5%的琼脂糖凝胶分离酶切片段。根据
ARDRA 酶切图谱的差异进行分析聚类, 划分为
不同的操作分类单元(Operation taxonomic unit,
OTU)。并随机选取每个 OTU中的代表性菌株进
行 16S rDNA扩增, PCR产物送往 Invitrogen公司
测序。
1.6 抑菌试验
采用抑菌圈法[17]对 7种病原菌进行拮抗作用
试验。配制供试病原菌悬浮液, 取 2 mL的病原菌
悬浮液, 分别加入到约 45 °C 18 mL的 PDA加牛
肉浸膏和蛋白胨培养基中, 混合均匀后倒成含供
试病原菌的培养基平板, 在平板中央移入一块直
径为 5 mm的内生细菌菌苔, 在 28 °C培养 3 d,
测量抑菌圈直径。
1.7 数据处理
根据测序结果, 从 GenBank 数据库中, 利用
BLAST 软件搜索并选取同源性较高的序列, 用
MEGA 4.1中的Maxmium Composite Likelihood
模式分析和构建系统发育树[18]。
2 结果与分析
2.1 对叶榕榕果内生细菌的分离及初步鉴定
用微生物传统分离方法从对叶榕果实中分离
得到内生细菌 54 株, 其中除个别菌株为革兰氏
阴性外, 皆为革兰氏阳性; 绝大部分为短杆状,
个别为杆状或球杆状(图 1)。


图 1 部分内生细菌革兰氏染色显微照片
Fig. 1 Microgram of part endophytic bacteria by Gram stain
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2.2 内生细菌 16S rDNA的 PCR扩增及限制
性酶切分析(ARDRA)
根据菌株间形态学上的差异, 挑选出 34株形
态不同的内生细菌, 以其基因组DNA为模板, 用
引物 27f和 1492r, 进行 16S rDNA-PCR扩增。扩
增出约 1 400 bp大小的条带(图 2)。用限制性内切
酶对 PCR 扩增产物进行酶切(图 3), 根据酶切图
谱的差异进行聚类, 发现分离出的 54 株菌共有
16个特有的 ARDRA类型。初步说明了对叶榕榕
果内生细菌群落具有丰富的多样性。
2.3 内生细菌系统发育分析
利用 NCBI 中的 BLAST 软件对测序结果进
行同源性比对搜索, 结果 54 株菌株均找到了其
相似性最高的菌株, 其中 22 株属于 Bacillus 属,

图 2 部分内生细菌 16S rDNA的 PCR扩增结果
Fig. 2 The results of 16S rDNA of some endophytic
bacteria by PCR

图 3 部分内生细菌的 ARDRA结果
Fig. 3 The results of ARDRA of some endophytic bac-
teria
其序列分别与该属中 2个种的典型菌株的序列相
似性最高, 其相似度为 95%和 100%, 所以此 6株
菌可能分属于 Bacillus属中的 2个种; 有 16株属
于Staphylococcus属, 其序列分别与该属中2个种
的典型菌株的相似性达到了为 99%和 100%, 故
此 3 株菌可能属于该属中的 2 个种; 5 株属于
Acinetobacter 属, 且与 Acinetobacter baumannii
的序列相似性为 100%, 可能属于该种; 4株属于
Pseudomonas 属, 其序列分别与该属中 2 个种的
典型菌株的相似度均为100%, 因此这4株菌可能
为该属的 2个种; 2株属于 Serratia属, 与 Serratia
marcescens的序列相似度达到了100%, 可能属于
该种; 1 株为非培养细菌的同源菌 , 相似度为
99%; 还有 2株属于 Kocuria属, 其相似度与该属
中的某一种菌的相似性达到了为 100%; 2 株为
Delftia 属, 其相似度与该属中的某一种菌的相似
度达到了 100%。所以, 榕果中分离出的 54株代
表菌株可分属于 7个属 16个种, 其中有 5个类型
占了总菌株数的 55.7%, 其代表菌株分别为
Swx1、Swx4、Swx10、Swx15和 Swx25 (表 2)。
2.4 内生细菌系统发育树的建立
对 16株内生细菌及其同源菌株的 16S rDNA
序列, 利用MEGA 4.1[19]构建出系统发育树(图 4):
Swx13与 Bacillus cereus及 Bacillus thuringiensis
聚在一起 , 亲缘关系较近 ; Swx4 与 Bacillus
megaterium 聚在一起, 亲缘关系较近; Swx8 与
Bacillus tequilensis 亲缘关系较近 ; Swx31 与
Bacillus subtilis及 Bacillus amyloliquefaciens亲缘
关系较近; Swx10与 Staphylococcus saprophyticus
亲缘关系较近; Swx1和 Swx18和 Staphylococcus
sp.及 Staphylococcus sciuri亲缘关系较近; Swx26
与Kocuria sp.亲缘关系较近; Swx23与Uncultured
bacterium 亲缘关系较近; Swx34与 Delftia sp.亲
缘关系较近; Swx5 和 Swx24 与 Pseudomonas
argentinensis及Pseudomonas fulva亲缘关系较近;
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表 2 16S rDNA扩增产物序列相似性比对
Table 2 Comparison of the 16S rDNA sequence identity
代表菌株
Representative strain
最相似菌株
The closest NCBI match
相似性
Similarity (%)
菌株数
Number of strains
比例
Proportion (%)
Swx1 Staphylococcus sp. (AB689746.1) 99 5 9.3
Swx4 Bacillus megaterium (JX885486.1) 100 6 11.1
Swx5 Pseudomonas fulva (JN257136.1) 100 2 3.7
Swx6 Bacillus cereus (GQ329658.1)) 95 3 5.5
Swx8 Bacillus tequilensis (JQ904626.1) 100 3 5.5
Swx10 Staphylococcus saprophyticus (JN644598.1) 100 9 16.7
Swx13 Bacillus thuringiensis (JX456174.1) 100 2 3.7
Swx15 Bacillus amyloliquefaciens (JX519215.1) 100 5 9.3
Swx18 Staphylococcus sciuri (JX134627.1) 100 2 3.7
Swx23 Uncultured bacterium clone (GQ016558.1) 99 1 1.8
Swx24 Pseudomonas argentinensis (JQ770188.1) 100 2 3.7
Swx25 Acinetobacter baumannii (HQ632003.1) 100 5 9.3
Swx26 Kocuria sp. (HM045839.1) 100 2 3.7
Swx31 Bacillus subtilis (JX524224.1) 100 3 5.5
Swx32 Serratia marcescens (JQ308608.1) 100 2 3.7
Swx34 Delftia sp. (HQ327477.1) 100 2 3.7

Swx25和 Acinetobacter baumannii亲缘关系较近;
Swx32 与 Serratia marcescens 聚在一起, 亲缘关
系较近; Swx6和Swx15聚在一起, 亲缘关系较近。
2.5 内生细菌抑菌谱的测定
对叶榕榕果内生细菌抑菌谱测定结果见表 3。
对 14株对叶榕榕果内生细菌用于抑菌谱的测定。
供试内生细菌除 Swx26菌株对这 7种病原菌都没
有抑制作用外, 其余的 13 株内生菌对于不同的
病原菌表现出了不同的抑制作用, 其中 Swx15和
Swx25广谱性最大, 可以抑制 6种病原菌; Swx5
和 Swx8 可以抑制 5 种病原菌; Swx1、Swx4 及
Swx10 可以抑制 4 种病原菌; Swx24、Swx31 及
Swx6可以抑制 3种病原菌; Swx13和 Swx34可以
抑制 2种病原菌; Swx18的广谱性最低只能抑制 1
种病原菌。
3 结论与讨论
通过传统的微生物学分离培养方法从西双版
纳热带植物园对叶榕的果实中共分离到 54 株内
生细菌, 其中 22 株为 Bacillus 属, 其余分别为
Staphylococcus属、Pseudomonas属、Serrata属、
Kocuria 属及 Delftia 属, 还有 1 株为非培养细菌
的同源菌。由此可知芽孢杆菌为对叶榕果实内生
细菌优势菌属, 由系统发育树可知这 16 株内生
细菌明显的聚为两支。本文中参与内生细菌抑菌
谱测定的 14 株内生细菌中, 除 Swx26 号菌株对
这 7种病原菌都没有抑制作用外, 其余的 13株内
生菌对于不同的病原菌表现出了不同的抑制作
用, 其中 Swx15和 Swx25号抑菌普最大, 抑菌菌
作较强, 因此具有一定的潜在应用价值。
1670 微生物学通报 Microbiol. China 2013, Vol.40, No.9

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图 4 内生细菌及其同源菌株给予 16S rRNA序列的系统发育树
Fig. 4 Phylogenetic tree derived from 16S rRNA sequences of endophytic bacteria and the nearest type strains

植物内生菌的种类受植物本身生理特点及周
围环境的影响很大[20], 植物内生菌的生理及生境
特殊性决定了其既有理论研究的必要性, 又有广
泛的应用潜力, 在微生物新资源的开发方面潜力
巨大[21]。从植物以及一些特殊环境植物的内生菌
次生代谢产物中寻找新型活性物质, 仍是内生菌
研究的焦点之一[22]。目前有关植物内生细菌的来
源有 2 种假说: 一种是认为内生细菌来源于植物
的表面; 另一种认为内生细菌来源于根际, 并由
此进入植物组织内部[23]直接或间接促进植物生
长, 协助植物抵抗不利环境。
内生菌在植物体中的生物量是很微少的, 但
植物内生菌作为植物微生态系统中的天然组成
部分, 可以通过自身的代谢产物或借助信号传导
作用对宿主产生影响, 现已发现内生菌对宿主植
物的有益作用有: 促进宿主植物生长、抗逆境、
抗病原真菌和细菌以及他感作用等。本研究分离
到的培养物中有 2 株已被报道具有促生作用, 分
别为 Swx15号和 Swx31号菌株。例如尹昭勇等[24]
研究表明, 解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amylolique-
faciens)对竹子根系的生长有一定的促进作用;
Kavin 等[25]通过对香蕉树幼苗期叶面喷洒荧光假
朱丽丽等: 对叶榕榕果内生细菌分离鉴定及抑菌活性的研究 1671

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表 3 14株对叶榕榕果内生细菌抑菌谱测定结果
Table 3 Inhibition spectra of the 14 endophytic bacteria against 10 pathogenies
抑菌圈直径 Bacteriostatic circle diameter (mm)
菌株号
Number
白菜黑斑病
Alternaria
brassicae
稻瘟病
Magnaporthe
grisea
柑橘青霉菌
Penicillium
digitatum
黄瓜枯萎病
Fusarium
oxgsporum
番茄早疫病
Alternaria
solani
梨黑星病
Venturia
nashicola
番茄灰霉病
Botrytis
cinerea
Swx1 11 – 10 9 – 8 –
Swx4 – 15 11 11 – 14 –
Swx5 23 17 – 20 – 14 11
Swx6 – 15 – 17 – 13 –
Swx8 – 14 13 – 11 17 11
Swx10 – 12 – 8 – 15 9
Swx13 – 14 – 12 – – –
Swx15 15 18 21 – 14 17 22
Swx18 – 13 – – – – –
Swx24 – 11 – 10 14 – –
Swx25 – 18 25 26 24 26 24
Swx26 – – – – – – –
Swx31 – 11 – 15 14 – –
Swx34 – – – 10 9 – –
注: –: 没有抑菌活性.
Note: −: Positive no antibacterial activity.

单胞菌株(Pseudomonas fluorescens)和枯草芽孢
杆菌株(Bacillus subtilis)混合剂, 提高了植株生长
速率以及降低了发病率; He等[26]也有报道假单胞
RJ10 (Pseudomonas sp.)和杆菌 RJ16 (Bacillus sp.)
可提高环境中溶解态镉与铅含量, 促进植物生
长。因此具有一定的潜在应用价值, 有可能会为
抗菌新药的研究开发利用以及植物益生方面提
供一条新的途径。今后我们将进一步确定这些内
生菌的组分及相应的化学结构, 探明并评价这些
内生细菌的应用前景。
参 考 文 献
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