全 文 ：催眠睡茄 Withania somnifera
毛状根的诱导及睡茄素 A的合成
王凤英1，孙一铭1，吕翠萍1，程孟琪2，张来2，孙敏1*
( 1. 西南大学 生命科学学院 三峡库区生态环境教育部重点实验室，重庆 400715;
2. 安顺学院 贵州省教育厅功能材料与资源化学特色重点实验室，贵州 安顺 561000)
［摘要］ 睡茄素 A是存在于催眠睡茄的根和叶中的主要次生代谢产物之一。该实验以催眠睡茄的无菌苗叶片为外植
体，利用发根农杆菌 C58C1 诱导催眠睡茄毛状根，诱导率达 30%。同时，利用 HPLC测定野生催眠睡茄植株的根、茎、叶和 30
d液体悬浮培养的毛状根中睡茄素 A的含量结果表明，毛状根中睡茄素 A 平均质量分数为 1. 588 mg·g －1，是野生植株平均
含量的 1. 96 倍;其中，毛状根系 M3 的睡茄素 A 含量最高，质量分数达到 1. 783 mg·g －1，是野生型催眠睡茄植株根含量的
1. 51 倍。因此，可以培养催眠睡茄毛状根来获得睡茄素 A。
［关键词］ 催眠睡茄;毛状根;睡茄素 A;HPLC
［收稿日期］ 2013-07-16
［基金项目］ 中央高校基本科研业务费专项资金项目
(XDJK20120088) ;贵州省功能材料与资源化学特色重点实验室开放
基金项目
［通信作者］ * 孙敏，Tel: (023)68254061，E-mail: jwcsm @
swu. edu. cn
［作者简介］ 王凤英，硕士研究生，E-mail:misswangfengying @
163. com
催眠睡茄 Withania somnifera L为茄科 Solanace-
ae睡茄属 Withania植物，又名印度人参，主要生长
在印度、巴基斯坦、埃及、刚果、南非等地。催眠
睡茄植株中含有睡茄素类、醉茄素类等各种生物
碱［1］，具有抗炎、抗压、抗氧化、抗肿瘤等功效，常
被用于治疗哮喘、老年痴呆、焦虑、帕金森综合症
及认知神经紊乱等［2］。在印度，催眠睡茄还常被
用于壮阳、镇静、延长寿命等。睡茄素 A 是睡茄
属植物的主要有效成分，研究表明，其有较强的
抗癌活性［3-4］，能够促进神经突起的分支和突触
的重建，被广泛应用于治疗老年痴呆、帕金森症
等各种神经性疾病［5］。
随着对催眠睡茄活性成分的药理学研究和分
析，其药理作用清晰明确，加快了催眠睡茄在保健及
医药中的开发和应用，其需求也日益增长。通过现
代生物技术手段来提高次生代谢产物的生物合成量
势在必行，国内外通过组织培养技术［6-10］来扩大催
眠睡茄的种质资源，以提高其次生代谢产物含量。
毛状根的形成是发根农杆菌的 Ｒi质粒的 T-DNA 片
段在植物核基因组中整合及表达的结果，其培养系
统在生物量的增加，药用有效成分的积累以及生产
稳定性方面都具有其独特的优越性，使得利用毛状
根培养生产植物次生代谢产物具有极大的生产潜
力［11］。原植物中睡茄素 A的含量较低［12］无法满足
不断增加的市场需求。国外有将催眠毛状根进行培
养条件优化［13］及将拟南芥中的鲨烯合酶基因转入
到催眠睡茄毛状根中以提高睡茄素 A 的含量［14］来
解决睡茄素 A的资源短缺问题的相关报道，但效果
不显著。因此，本实验利用发根农杆菌 C58C1 诱导
催眠睡茄叶片产生毛状根，同时优化睡茄素 A 的提
取方法，为建立和筛选高效合成睡茄素 A 的优良毛
状根体系奠定基础。
1 材料
催眠睡茄种子由西南大学梁国鲁教授惠赠。以
培养 20 d的无菌催眠睡茄幼苗的叶片为外植体。
发根农杆菌 C58C1(C58C1 是根癌农杆菌经
“Disarmed”改造后，保留 Helper 质粒，导入 pＲiA4
质粒而成的发根农杆菌)由西南大学廖志华教授
提供。
岛津 LC-20AD自动进样高效液相色谱仪;睡茄
素 A 对照品购于 Nature Ｒemedies Private Limited，
(HPLC≥95%)。
2 方法
2. 1 C58C1 菌株的活化
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取发根农杆菌 C58C1 菌种，于 YEB 附加 40 mg
·L －1利福平(Ｒif)的固体培养基划线培养，挑取单
菌落，接种于 10 mL 附加 40 mg·L －1利福平(Ｒif)
的 YEB液体培养基中，200 r·min －1，27 ℃振荡培
养 24 h为第 1 次活化菌液，取 100 μL第 1 次活化菌
液接种于 50 mL 的 YEB 附加 40 mg·L －1 Ｒif 的液
体培养基中，200 r·min －1，27 ℃振荡培养至 A600
0. 3 左右(约 12 h) ，加入乙酰丁香酮(AS)至终浓度
为 100 μmol·L －1，继续活化 3 h。将 50 mL活化好
的菌液移入无菌离心管中，4 000 r·min －1，离心 10
min，用 50 mL 附加有 100 μmol·L －1乙酰丁香酮
(AS)的 MS 液体培养基重悬菌体，继续于 200 r·
min －1，27 ℃振荡培养 30 min，获得的菌体用于转化
催眠睡茄外植体［15］。
2. 2 催眠睡茄毛状根的获得
将处理好的催眠睡茄叶片浸入 C58C1 的悬浮
液中，200 r·min －1，27 ℃振荡 20 min 后，用无菌滤
纸吸干叶片表面的菌液，接种于附加 100 μmol·
L －1乙酰丁香酮(AS)的 MS固体培养基中，27 ℃黑
暗共培养 4 ～ 5 d 至叶片周围有菌圈出现时，取出
叶片，无菌水 200 r·min － 1振荡洗涤 3 次，每次
10 min，无菌吸水纸吸干水分后接种于附加 300
mg·L － 1的头孢噻肟钠(Cef)的 MS 固体培养基
中光照培养，每 4 d 更换 1 次培养基，直至毛状根
长出。
2. 3 毛状根的液体培养
当毛状根生长至 3 cm左右时，剪下分别接种于
含 300 mg·L －1的头孢噻肟钠(Cef)的 1 /2 MS 培养
基中，每 7 d剪取毛状根的根尖继代培养，继代 5 ～ 6
次后，将毛状根转移至 YEB琼脂培养基上培养 7 d，
检测毛状根无农杆菌污染后，接种于 1 /2 MS液体培
养基中，110 r·min －1，27 ℃振荡培养。每 20 d 左
右更换一次培养基，培养 30 d 左右收获毛状根用于
分子检测后，选择性状保持稳定且生长迅速的阳性
毛状根克隆进行扩大培养，30 d 左右测定睡茄素 A
的含量。
2. 4 催眠睡茄毛状根的 rolB基因的分子检测
分别取不同无性系的毛状根用 CTAB［16］法提取
毛状根的 DNA，采用 PCＲ扩增的方法检测毛状根中
virD基因和 rolB 基因，扩增体系使用 Promega 公司
的 GoTaqGreen Master Mix. 参照张显强等［15］的检
测方法。
2. 5 催眠睡茄植株及毛状根中睡茄素 A 的 HPLC
检测
2. 5. 1 色谱条件 Symmetry-C18色谱柱;流动相 A
为三重蒸馏水，流动相 B为试剂乙醇(乙醇-甲醇-异
丙醇 90. 6∶ 4. 5∶ 5. 9)与甲醇 1 ∶ 1 混合;流动相进样
体积比为 1∶ 1;检测波长 230 nm;柱温 38 ℃;流速 1
mL·min －1;进样体积为 20 μL。
2. 5. 2 睡茄素 A 标准曲线的绘制 精密称取睡茄
素 A对照品，分别配置成质量浓度为 200，150，100，
50，25 mg·L －1的对照品贮备液，分别进样记录相应
的峰面积，绘制标准曲线方程。
2. 5. 3 睡茄素 A 的提取和测定 将野生型催眠
睡茄植株的根、茎、叶和毛状根 60 ℃烘干至恒
重，充分研磨后过 60 目筛。睡茄素 A 提取方法
参照［17］，精确称取各样品干粉 1 g，加入甲醇 10
mL，超声提取 20 min，室温静置 5 h，12 000 r·
min － 1离心 10 min，吸取上清，过滤膜。取样品滤
液 20 μL 注入高效液相色谱仪中，记录峰面积，
计算睡茄素 A 的含量。
3 结果与分析
3. 1 毛状根的诱导
外植体经 C58C1 浸染共培养 5 d 后，光照培养
10 d左右开始有毛状根长出，外植体毛状根平均诱
导条数为 4 条，15 d 毛状根诱导率达 30%左右，表
现出无向地性，绒毛较多的特点。催眠睡茄毛状根
生长迅速，分枝较多，生长 7 d 左右长 3 ～ 4 cm，
取不同的毛状根分别接种于 1 /2 MS + Cef的固体
培养基后，毛状根生长迅速。经除菌后毛状根转
入 1 /2MS + Cef 的液体培养基中振荡培养，毛状
根迅速生长(图 1)。随着液体悬浮培养时间的
增加，毛状根由白色逐渐转变为淡黄色，培养 30
d 左右时，毛状根出现轻微的褐化现象，生物量明
显增加，说明次生代谢产物已经在毛状根内大量
合成和积累，可以收获毛状根进行分子检测和睡
茄素 A 的测定。
3. 2 毛状根的 rolB基因的检测
Ｒi质粒上的 T-DNA 中的 rol 家族基因与毛状
根的形成具有密切的关系，对毛状根基因组中的 rol
家族基因的检测可以鉴定 T-DNA 是否已整合到植
物基因组中［18］。用催眠睡茄毛状根的 DNA 作为模
版，以 f-VirD1 / r-VirD1 为引物进行 PCＲ 扩增检测
VirD基因，排除农杆菌基因组对毛状根基因组污染
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A. 10 d左右的毛状根;B. 除菌培养基中毛状根生长情况;C. 液体
培养。
图 1 催眠睡茄毛状根的获得
Fig. 1 Hair roots of Withania somnifera
导致的假阳性的结果;以 f-rolb / r-rolb 为引物进行
PCＲ扩增检测 rolB基因，以野生型催眠睡茄基因组
模板为阴性对照，发根农杆菌菌体为阳性对照检测
催眠睡茄毛状根系中的 rolB 基因。检测结果表明
(图 2) ，32 个毛状根系中，有 2 个毛状根系中检测
出存在农杆菌的污染，其余的 30 个毛状根均未检测
出 VirD基因;在检测的 30 个毛状根单克隆系中，仅
有 1 个单克隆未检测到 rolB 基因，阳性率为
96. 67%。因此，选择性状保持稳定且生长迅速的阳
性毛状根克隆进行扩大培养，以测定睡茄素 A 的
含量。
M. DL 2 000 DNA Marker;+ . 阳性对照为 C58C1 菌株;－ . 阴性对
照为野生型催眠睡茄;1 ～ 10. 部分不同的催眠睡茄毛状根单克隆。
图 2 催眠睡茄部分毛状根 rolB基因的 PCＲ检测
Fig. 2 PCＲ detection of rolB gene in hair roots of Withania
somnifera
3. 3 毛状根中睡茄素 A的测定
3. 3. 1 标准曲线的绘制 以睡茄素 A 为对照品，
测得睡茄素 A 在 230 nm 处有最大吸光值，以不同
浓度的睡茄素 A标准液进样后于 230 nm 波长下测
定出峰时间和记录相应峰面积，得出睡茄素 A 的标
准峰谱图(图 3)。以进样浓度为横坐标 X，峰面积
为纵坐标 Y，绘制睡茄素 A 的标准曲线为 Y =
10 653. 26X + 475. 967 7，相关系数 Ｒ2 = 0. 999 93。
A. 对照品;B. 样品;a. 睡茄素 A。
图 3 睡茄素 A的 HPLC图
Fig. 3 HPLC chromatigram of withanolide A and sample
3. 3. 2 催眠睡茄植株及毛状根中睡茄素 A 的测定
选择 10 个液体培养 30 d 且生长迅速的的毛状根
无性单克隆系，及生长旺盛的野生型催眠睡茄植株
的根、茎和叶，冷冻干燥后粉碎过 60 目筛，提取睡茄
素 A进行 HPLC测定。睡茄素 A含量测定结果(表
1)表明，野生型催眠睡茄植株中睡茄素 A 的平均质
量分数为 0. 808 mg·g －1，根中睡茄素 A 的含量最
高，为 1. 180 mg·g －1;而测定的 10 个毛状根系中睡
茄素 A的含量都显著高于野生催眠睡茄根的含量，
平均质量分数为 1. 588 mg·g －1，是野生植株平均
含量的 1. 96 倍;其中毛状根系 M3 的睡茄素 A最高
达到 1. 783 mg·g －1，是野生催眠睡茄植株平均含
量的 2. 21 倍，根的 1. 51 倍。因此，实验通过对催眠
睡茄毛状根的诱导并获得高效积累睡茄素 A 的毛
状根系 M3，为通过毛状根培养高效率获得睡茄素 A
奠定了基础。
表 1 催眠睡茄植株及毛状根中睡茄素 A 的测定(珋x ± s，
n = 3)
Table 1 Withanolide A content in organ and hairy root of With-
ania somnifera(珋x ± s，n = 3)
编号 睡茄素 A质量分数 /mg·g － 1
根 1. 180 ± 0. 001 2
茎 0. 691 ± 0. 003 9
叶 0. 555 ± 0. 032 4
M1 1. 629 ± 0. 016 6
M2 1. 543 ± 0. 007 1
M3 1. 783 ± 0. 002 4
M4 1. 581 ± 0. 014 1
M5 1. 409 ± 0. 072 8
M6 1. 728 ± 0. 002 1
M7 1. 398 ± 0. 001 8
M8 1. 609 ± 0. 051 5
M9 1. 547 ± 0. 003 7
M10 1. 649 ± 0. 081 1
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4 讨论
本实验以无菌体系的催眠睡茄叶片为外植体，
进行毛状根的诱导，降低了外植体的污染率。同时，
避免了部分催眠睡茄外植体由于消毒剂的毒害导致
死亡而降低了毛状根的诱导率。在利用发根农杆菌
C58C1 浸染时，用无菌针于叶片上刺 2 ～ 3 个孔［15］，
能够使发根农杆菌更充分地浸染外植体，将 Ｒi质粒
上的 T-DNA整合到催眠睡茄叶片的核基因组中，提
高毛状根的诱导率。当液体培养 30 d 左右时，毛状
根由白色变逐渐变为淡黄色，且有轻微的褐化现象，
说明次生代谢产物已经在毛状根内大量合成和积
累，可以收获毛状根进行分子检测和睡茄素 A 的提
取和测定。
在提取睡茄素 A 时，M Ganz 等［17］的提取方法
相对于 N Praveen等［19］的效果较好。而本实验在提
取过程中，样品加入甲醇超声提取后，室温静置 5 h，
可使睡茄素 A更充分地溶于甲醇中，达到更佳的提
纯效果。
利用 HPLC具有分离效率高，选择性好，检测灵
敏度高等的优点，对野生催眠睡茄植株的根、茎、叶
中睡茄素 A含量的测定结果表明，野生催眠睡茄根
中的含量明显高于茎和叶，与 M Ganzera 等［17］的结
果一致。Hosakatte N Murthy［12］探讨了 SH，LS，N6，
MS不同培养基对睡茄素 A 质量分数的影响，发现
附加 40 g·L －1蔗糖的 1 /2MS 液体培养基培养催眠
睡茄毛状根，睡茄素 A 达到 157. 4 μg·g －1，M H
Mirjalili等［14］将拟南芥中的鲨烯合酶基因转入到催
眠睡茄毛状根中，睡茄素 A 质量分数达到 4. 63 μg
·g －1，而本实验获得的高产睡茄素 A 的毛状根系
M3，其睡茄素 A的积累量(1. 783 mg·g －1)显著高
于 Hosakatte N Murthy和 M H Mirjalili的实验结果。
这为利用催眠睡茄毛状根生产睡茄素 A 及进一步
获得高产睡茄素 A 毛状根系的优良再生植株奠定
了前期的实验基础。
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Hair roots induction and culture of Withania somnifera and
its withanolide A synthesis
WANG Feng-ying1，SUN Yi-ming1，LV Cui-ping1，CHENG Meng-qi2，ZHANG Lai2，SUN Min1*
(1. SchooL of Life Sciense，Southwest University /Key Laboratory of Eco-environments in Three Gorges Ｒeservoir Ｒegion(MOE) ，
Chongqing 400715，China;
2. Special and Key Laboratory of Functional Materials and Ｒesource Chemistry of Guizhou Provincial
Education Department，Anshun University，Anshun 561000，China)
［Abstract］ Withanolide A is a biologically active secondary metabolite occuring in roots and leaves of Withania somnifera. In
the present study，adventitious roots from leaf explants of W. somnifera were induced for the production of withanolide-A by Agrobacteri-
um tumefaciens strain C58C1 to obtain hair roots. Hair roots induction rate reached 30%. The withanolide A was determined by HPLC
in different hair roots lines and different parts of W. somnifera. The average content of withanolide A in all hair roots lines were 1. 96
times as high as that in wild-plant，the concentration of withanolide A in hair roots (1. 783 mg·g －1 dry weight)were 1. 51 times as
high as the roots of wild W. somnifera (1. 180 mg·g －1 dry weight ) ，respectively. It is possible to obtain withanolide A from hair roots
culture of W. somnifera．
［Key words］ Withania somnifera;hair roots;withanolide A;HPLC
doi:10． 4268 /cjcmm20140507
［责任编辑 吕冬梅］
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