全 文 ：正交设计研究山牡荆总黄酮提取工艺
代现平，班翠红，韩景田 (滨州医学院药学院，山东烟台 264003)
摘要 ［目的］建立山牡荆总黄酮的合理提取工艺，为山牡荆的开发及利用提供理论依据。［方法］以乙醇用量、乙醇浓度、提取时间和
提取次数等为考察因素，以山牡荆总黄酮含量作为指标，应用正交试验对提取工艺进行优化。［结果］山牡荆中总黄酮的最佳提取工艺
为乙醇用量 12倍量、乙醇浓度 70%乙醇、提取次数 3次、每次 1 h。［结论］该提取工艺简单、高效，适用于山牡荆的总黄酮提取。
关键词 山牡荆;总黄酮;正交试验;提取工艺
中图分类号 S567 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611( 2014) 23 －07748 －02
Extraction Technique for Total Flavonoids from Vitex quinata by Orthogonal Test
DAI Xian-ping et al ( School of Pharmacy，Binzhou Medical University，Yantai，Shandong 264003)
Abstract ［Objective］To establish a method of extraction technology of total flavonoids to offer a basis for development and utilization of Vitex
quinata． ［Method］The extraction technology of total flavonoids was optimized by orthogonal experiment with the content of total flavonoids as
index and with ethanol concentration，ethanol dosage，extracting frequency and extracting time as factors． ［Ｒesult］ The optimal extraction
technology was that 12-fold and 70% ethanol，1 hour of reflux，and 3 times of extraction． ［Conclusion］The extraction technology is simple
and rapid for the extraction of total flavonoids from Vitex quinata．
Key words Vitex quinata; Total flavonoids; Orthogonal experiment; Extraction technology
基金项目 国家自然科学基金资助项目( 31170320) 。
作者简介 代现平( 1970 － ) ，男，河南鹤壁人，副教授，博士，从事天然
活性成分研究。
收稿日期 2014-07-02
牡荆属植物 Vitex 是马鞭草科乔木或灌木，全世界大约
有 250余种，主要分布在热带及温带地区。在我国有 14 种，
主要分布于长江以南，在东北、西北、华北等地也有少量分
布［1］。山牡荆(Vitex quinata)一般以其树干心材和干燥根入
药，具有止咳定喘、清热解毒及镇静退热等功效，常用于痈肿
疮疡、温病发热、风湿热痹、关节红肿热痛及热毒血痢等病
症［2］。研究显示，山牡荆及牡荆属植物主要含有黄酮类、苯
丙素类、甾类、环烯醚萜类、三萜类、二萜类、倍半萜类等化学
成分［3 －8］。其中黄酮类化合物，因其广泛的生物活性已成为
研究的热点。现代药理研究证实，山牡荆的黄酮类成分具有
如抗肿瘤、抗病毒、抗菌、抗炎、增强机体免疫力、止咳祛痰等
多种药理作用［3 －8］。因此，研究山牡荆中总黄酮的提取工艺
具有重要意义。笔者以山牡荆总黄酮作为考察指标，采用正
交设计试验进行提取工艺的优化，对影响提取的各种条件及
因素进行了深入探讨，为山牡荆总黄酮提取工艺的研究及山
牡荆总黄酮开发利用提供依据。
1 材料与方法
1． 1 材料与试剂 山牡荆(烟台绿叶制药，经滨州医学院
药学院天然药物实验室鉴定为真品) ;对照品芦丁(中国药品
生物制品检定所) ;其他试剂为分析纯试剂。
1． 2 仪器 JA5003B电子天平(上海精密仪器仪表有限公
司) ;SHZ-Ⅲ循环水式多用真空泵(巩义市瑞德仪器设备有限
公司) ;TU-190紫外可见分光光度计(北京普析通用) ;HH-6
型恒温水浴锅(上海乔跃电子有限公司) ;DHG-9053 型真空
干燥箱(上海精密仪器仪表有限公司) ;ＲE-301 旋转蒸发仪
(巩义市瑞德仪器设备有限公司)。
1． 3 方法
1． 3． 1 供试品溶液制备方法。准确称取山牡荆粗粉 30 g，
于 1 000 ml烧瓶中，按要求加入提取溶剂，加热回流提取一
定时间，过滤，减压回收溶剂，干燥，称重，得山牡荆干膏。精
密称取在不同提取条件下所得山牡荆干膏10 mg，于10 ml容
量瓶中，用 60%乙醇溶解，定容后备用。
1． 3． 2 标准品溶液制备方法。精密称取于 120 ℃干燥至恒
重芦丁对照品10 mg，于100 ml容量瓶中，加60%乙醇30 ml，
水浴微热使溶，放冷，60%乙醇定容至 100 ml，制成 0． 100
mg /ml芦丁对照品溶液。
1． 3． 3 标准曲线制备。分别精密吸取芦丁对照品溶液 0、
1． 00、2． 00、3． 00、4． 00、5． 00 ml，分别于 25 ml容量瓶中，各加
0． 75 ml 亚硝酸钠溶液(50 mg /ml) ，摇匀，静置 7 min;再加
0． 75 ml硝酸铝溶液(100 mg /ml) ，摇匀，静置 7 min;再加 10
ml氢氧化钠溶液(40 mg /ml) ，60%乙醇定容，摇匀，静置 8
min。于 510 nm波长处测吸光度，以吸光度 A 为纵坐标、芦
丁浓度 C为横坐标，进行线性回归，计算回归方程。
1． 3． 4 精密度试验。精密吸取 2． 0 ml 芦丁对照液于 25 ml
容量瓶中，按“1． 3． 3”方法，重复操作 5次。
1． 3． 5 稳定性试验。取适量供试品溶液，按“1． 3． 3”方法，
于 0、2、4、6、8 h分别测定吸光度。
1． 3． 6 重复性试验。取同一批药材，按照“1． 3． 1”方法制备
供试品溶液，并按“1． 3． 3”所述方法测定吸光度，重复 5次。
1． 3． 7 回收率试验。精密移取 6份已知含量供试品溶液各
0． 5 ml，均精密加入芦丁标准品溶液，按“1． 3． 3”方法测定其
吸光度，计算山牡荆总黄酮含量。
1． 3． 8 供试品总黄酮含量测定。精密移取 5 ml 供试品溶
液，于 25 ml容量瓶中，按“1． 3． 3”方法测吸光度，并代入回归
方程，计算总黄酮的含量。
1． 3． 9 正交试验。应用正交试验设计，选择了乙醇浓度
(A)、乙醇用量(B)、提取次数(C)和提取时间(D)作为考察
因素，每个因素选择了 3 个水平(表 1) ，以总黄酮含量作为
考核指标，按照 L9(3
4)正交设计方案进行试验。
责任编辑 黄小燕 责任校对 李岩安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2014，42(23) :7748 － 7749
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2014.23.020
表 1 正交试验因素水平
水平
因素
A
乙醇浓度∥%
B
乙醇用量∥倍
C
提取次数∥次
D
提取时间∥h
1 70 8 1 1
2 80 12 2 2
3 90 16 3 3
2 结果与分析
2． 1 山牡荆中总黄酮的含量测定 经计算，以吸光度 A为
纵坐标、芦丁浓度 C为横坐标的标准曲线的回归方程为 A =
12． 473C +0． 001 9(r = 0． 999 6) ，表明芦丁在 0． 005 ～ 0． 049
mg /ml浓度范围与其吸光度呈良好线性关系。精密度试验
结果显示，5 次吸光度值的相对标准偏差(ＲSD)为 0． 53%，
表明该方法有良好精密度。稳定性试验发现，5 次吸光度值
的 ＲSD为 1． 36%，表明在 8 h内测定供试品基本稳定。重复
性试验中5次吸光度值的 ＲSD为1． 73%;回收率试验得出平
均回收率97． 59%，ＲSD =1． 55%，表明该方法有良好重现性。
2． 2 山牡荆总黄酮提取工艺优化
2． 2． 1 正交试验。极差分析表明(表 2) ，影响山牡荆总黄
酮的提取主次因素依次为 B ＞ A ＞ C ＞ D，即乙醇用量 ＞乙醇
浓度 ＞提取次数 ＞提取时间;方差分析(表 3)显示，乙醇浓
度、乙醇用量对结果影响具有极显著性的意义，提取次数对
试验结果影响有显著意义。正交设计结果(表 2)显示，提取
工艺 A1B2C3D2 为最佳，但 D因素影响小，且 3个水平相差不
大，为了节省能源，选用 D1。因此，最佳工艺确定为 70%乙
醇 12倍量加热回流提取 3次，每次 1 h。
表 2 正交试验结果
试验号 A B C D
总黄酮含量
mg /g
1 1 1 1 1 24． 12
2 1 2 2 2 37． 26
3 1 3 3 3 41． 06
4 2 1 2 3 19． 09
5 2 2 3 1 36． 04
6 2 3 1 2 31． 67
7 3 1 3 2 19． 10
8 3 2 1 3 25． 96
9 3 3 2 1 25． 03
K1 103． 05 62． 31 81． 75 85． 20
K2 86． 79 99． 27 81． 39 88． 05
K3 70． 11 102． 75 96． 81 86． 70
Ｒ 32． 94 40． 44 15． 42 2． 85
表 3 方差分析结果
方差来源 离差平方和 自由度 方差 F P
A 180． 270 2 90． 140 232． 020 ＜0． 01
B 589． 412 2 294． 712 758． 581 ＜0． 01
C 51． 061 2 25． 531 65． 710 ＜0． 05
D 0． 777 2 0． 388 1． 000
注:F0． 05(2，2)=19． 00;F0． 01(2，2)=99． 00。
2． 2． 2 工艺验证试验。采用筛选后得到的最佳工艺，即
A1B2C3D1 提取 3次，进行了验证试验，按“1． 3． 3”方法测吸
光度，计算总黄酮的含量。结果发现，3批山牡荆总黄酮的含
量分别为 40． 32、39． 02、39． 56 mg /g，相对标准偏差 ＲSD =
1． 65%(n =3) ，表明该工艺路线是稳定可靠的。
3 结论
笔者曾进行了山牡荆药材粒度、提取时间、乙醇用量、乙
醇浓度、提取次数单因素的筛选试验，结果显示山牡荆粒度
对提取效率的影响不大，因此选择对提取效率有较大影响的
乙醇浓度、提取时间、提取次数、乙醇用量为考察因素，进行
正交试验，优选其最佳提取工艺条件。经正交设计结果分析
及方差分析，发现影响山牡荆总黄酮提取主次因素依次为乙
醇用量 ＞乙醇浓度 ＞提取次数 ＞提取时间，经综合各种因素
后，选定 A1B2C3D1 为山牡荆总黄酮的最佳提取方案，即 70%
浓度 12 倍量乙醇经加热回流提取 3 次，每次 1 h，按此条件
提取，总黄酮含量较高。并按照最佳提取条件进行了验证试
验，结果表明该提取工艺方法简单、高效、稳定。
参考文献
［1］李春正，苏艳芳，靳先军．牡荆属植物化学成分及生物活性研究进展
［J］．中草药，2005，36(6):930 －938．
［2］江级武，靳朝东．药用植物辞典［K］．天津:天津科学技术出版社，2005:
855．
［3］LING T J，LING W W，CHEN Y J． Antiseptic activity and phenolic constit-
uents of the aerial parts of Vitex negundo var． cannabifolia［J］． Molecules，
2010，15(11):8469 －8477．
［4］ZHENG C J，HUANG B K，WANG Y． Anti-inflammatory diterpenes from
the seeds of Vitex negundo［J］． Bioorg Med Chem，2010，18(1):175 －181．
［5］CABＲAL C，GONALVES M J，CAVALEIＲO C． Composition and anti-
fungal activity of the essential oil from Cameroonian Vitex rivularis Gürke
［J］． Nat Prod Ｒes，2009，23(16):1478 －1484．
［6］LUECHA P，UMEHAＲA K，MIYASE T，et al． Antiestrogenic constituents of
the Thai medicinal plants Capparis flavicans and Vitex glabrata［J］． J Nat
Prod，2009，72(11):1954 －1959．
［7］GUHA G，ＲAJKUMAＲ V，ASHOK Ｒ，et al． Polyphenolic constituents of
methanolic and aqueous extracts of Vitex negundo render protection to
Hep3B cells against oxidative cytotoxicity［J］． Food Chem Toxicol，2010，48
(8 /9):2133 －2138．
［8］ATA A，MBONG N，IVEＲSON C D，et al． Minor chemical constituents of
Vitex pinnata［J］． Nat Prod Commun，2009，4(1):1 －4．
947742 卷 23 期 代现平等 正交设计研究山牡荆总黄酮提取工艺