全 文 :·生物技术· 北方园艺2013(03):104~106
[12]付长亮,马小军,白隆华,等.罗汉果组织培养研究进展[J].中国中药
杂志,2005,30(5):325-328.
[13]孙琦,张春庆.植物脱毒与检测研究进展[J].山东农业大学学报(自
然科学版),2003,34(2):307-310.
Study on Stem Apex Detoxification of Siraitia grosvenori
WU Qun-ying1,LI Bo-lin2,LI Jing-yun3
(1.Guilin Medical University,Guilin,Guangxi 541004;2.Guangxi Normal University,Guilin,Guangxi 541004;3.Guangxi Traditional Chinese
Medical University,Nanning,Guangxi 530001)
Abstract:Siraitia grosvenori in vitro was used as material in this experiment to eliminate Luohanguo mosaic virus
(WMV-2-Luo)by combing tissue culture of shoot-tip with heat therapy,and detected by indirect ELISA method and
electron microscope.The results showed that the suitable time for heat treatment was 7~15days,the survival rate of
tissue culture seedling was up to 90%~100%;0.2~0.5mm shoot-tip with heat treatment by 38.5℃for 10days of
Siraitia grosvenori were 100%free from WMV-2-Luo.
Key words:Luohanguo mosaic virus(WMV-2-Luo);stem apex detoxification;ELISA
第一作者简介:刘思言(1979-),女,吉林四平人,硕士,讲师,研究
方向为生物技术。E-mail:siyan_2001@163.com.
责任作者:王丕武(1958-),男,吉林蛟河人,博士,教授,博士生导
师,现主要从事生物技术及作物遗传育种等研究工作。
基金项目:吉林省科技厅科技引导计划资助项目(201101111);吉
林省教育厅科学技术研究资助项目(2011-41);吉林农业大学校内
启动基金资助项目(201242)。
收稿日期:2012-10-23
不夜城芦荟基因组DNA提取方法的比较研究
刘 思 言1,姚 丹1,关 淑 艳1,王 丕 武2,宋 晨 雪1
(1.吉林农业大学 生命科学学院,吉林 长春130118;2.吉林农业大学 农学院,吉林 长春130118)
摘 要:以不夜城芦荟的幼嫩叶片为试材,分别采用SDS法和CTAB法以及简化的CTAB
法对基因组DNA进行提取,并利用紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳法检测其DNA的浓度、纯
度及质量,以期筛选不夜城芦荟基因组DNA提取的最合适方法。结果表明:对比不夜城芦荟基
因组DNA提取的3种方法,无论从提取浓度还是纯度上来看,SDS法均明显优于其它方法。
关键词:不夜城芦荟;基因组DNA提取;SDS法;CTAB法
中图分类号:S 682.33 文献标识码:A 文章编号:1001-0009(2013)03-0104-03
芦荟(Aloe)属单子叶植物纲百合科芦荟属多年生多
浆常绿草本植物,也称油葱、纳会、象胆、奴会[1],其名称
源于阿拉伯语(Aloeh),其义是“苦而有光”,广泛分布于
热带、亚热带地区。芦荟有许多种类,目前已知有300多
个种,其中比较常见的有美国库拉索芦荟、木立芦荟、中
华芦荟、不夜城芦荟等,其中不夜城芦荟因其外形美观,
近年来常常被作为观赏植物,深受人们喜爱。
芦荟中含有近200种化学成分,主要包括蒽醌类次
生代谢物和芦荟多糖等[2]。芦荟凝胶可以治疗各类皮
肤病,具有很好的抗菌消炎作用,对心脑血管病、胃肠道
溃疡疗效也较好。另外,芦荟也常常用于美容保健、护
发生发、防晒护肤等领域,完美芦荟胶的主要成分就是
芦荟凝胶。在食品工业中,各种含有芦荟成分的饮料和
酸奶等已经走入人们的生活[3]。
随着分子生物学的发展,很多人把目光转到芦荟的
遗传转化研究方面[4-6]。对于植物转基因研究而言,基
因组DNA的提取效率、尤其是DNA的纯度会影响试验
的最终结果。因此,确定出某种植物最适的DNA提取
方法,对该植物分子生物学研究具有重要的参考价
值[7-8]。该试验以不夜城芦荟为试材,采用SDS法、
CTAB法以及简化的CTAB法提取不夜城芦荟基因组
DNA,力求筛选省时省力又高效的不夜城芦荟基因组
DNA提取方法,为不夜城芦荟的分子生物学研究提供
401
北方园艺2013(03):104~106 ·生物技术·
理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试材料为不夜城芦荟的幼嫩叶片。SDS法提取
试剂:(1)DNA提取液:100mmol/L Tris·Cl(pH 8.0);
50mmol/L EDTA (pH 8.0);500mmol/L NaCl;10
mmol/Lβ?巯基乙醇,(2)5mol/L KAC,(3)10%SDS,(4)
TE缓冲液:10mmol/L Tris·Cl(pH 8.0);1.0mmol/L
EDTA(pH 8.0)。CTAB法提取试剂:(1)2×CTAB提
取缓冲液:2.0g 100mL CTAB;1.4mol/L NaCl;20
mmol/L EDTA;100mmol/L Tris·Cl(pH 8.0),(2)PVP
(聚乙烯吡咯烷酮),(3)TE缓冲液:10mmol/L Tris·Cl
(pH 8.0);1.0mmol/L EDTA(pH 8.0)。
1.2 试验方法
1.2.1 芦荟基因组DNA的提取方法 SDS法:(1)取新
鲜叶片若干置液态氮中研磨成粉,将冻粉转移至提前加入
PVP的离心管中,迅速加入65℃预热的800μL DNA提取
液,轻轻晃动,使冻粉充分散开。(2)加入200μL 10%
SDS,充分混匀,置65℃水浴中轻轻晃动,以保证提取的充
分,10~15min后,再加160μL 5mol/L KAC,充分混匀,
冰浴中放置30min。(3)12 000r/min离心15min,将
上清液转入另1个离心管中加入等体积的氯仿/异戊醇
(24∶1),轻轻颠倒离心管使之混合均匀,放置片刻。
(4)8 000r/min离心10min,按步骤3反复抽提2~
3次。(5)将上清液转移至另1个离心管中,加入2
倍体积的无水乙醇,轻轻混匀,置-20℃沉淀1h。
(6)8 000r/min离心10min,倒掉上清液用70%乙醇
洗涤沉淀2~3次,自然吹干后用20μL RTE回溶沉淀。
(7)37℃保温1h,置-20℃冰箱中保存备用[9]。CTAB
法:(1)取新鲜叶片若干置液态氮中研磨成粉,将冻粉转
移至提前加入PVP的离心管中,迅速加入600μL
CTAB提取液,65℃水浴30min,水浴过程中轻轻晃动,
以保证提取的充分。(2)取出离心管,冷却至室温,加入
等体积的氯仿/异戊醇(24∶1)轻缓颠倒混匀,静止
10min。(3)10 000r/min离心10min,取上清液于新离
心管中,加入2/3倍体积的异丙醇,轻缓颠倒混匀,静置
10min。(4)10 000r/min离心10min去上清液,用70%
的乙醇洗涤沉淀2~3次,室温下微干,溶于200μL TE
缓冲液中。(5)用等体积的氯仿/异戊醇(24∶1)抽提1~
3次。(6)取上清液,加入0.5倍体积的1.0mol/L NaCl,
轻轻颠倒混匀,使之溶解,再加入2倍体积的无水乙醇,轻
轻颠倒混匀,静置1h。(7)8 000r/min离心10min,除去
上清液,用70%的乙醇洗涤沉淀2次,自然干燥后溶于
20μL RTE缓冲液中。(8)37℃保温1h,置-20℃冰箱
中保存备用[10-11]。简化的CTAB 法:将上述方法中
(4)~(6)步省略,其余步骤不变。
1.2.2 DNA质量检测 电压5V/cm,核酸染料染色,
1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取的质量。
1.2.3 DNA纯度和浓度的检测 利用核酸蛋白质分析
仪[NanoDrop(ND-1000)SpectropHotometer]测定DNA
样品在OD260/OD230及OD260/OD280波长处的紫外吸收比
值,从而确定样品的纯度及浓度。
2 结果与分析
2.1 琼脂糖凝胶电泳检测
2.1.1 SDS法提取的基因组DNA琼脂糖凝胶电泳结
果 由图1可知,Marker条带较清晰,第1、4、5、8号条
带较明亮,DNA提取效果较好,第2、3、6、7号条带稍暗,
所有条带未出现拖尾现象。
图1 SDS法提取的基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图谱
Fig.1 ElectropHoresis pattern of DNA of Aloe nobilis
extracted by SDS method
注:M为DNA 2000Marker,1~8为提取的样品DNA。
2.1.2 CTAB法提取的基因组DNA琼脂糖凝胶电泳
结果 由图2可以看出,Marker条带较清晰,图中所有
条带均很明亮,第2、4、5、8号条带出现明显的拖尾现象。
图2 CTAB法提取的基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图谱
Fig.2 ElectropHoresis pattern of DNA of Aloe nobilis
extracted by CTAB method
注:M为DNA 2000Marker,1~8为提取的样品DNA。
2.1.3 简化CTAB法提取基因组DNA琼脂糖凝胶电
泳结果 由图3可见,Marker条带较清晰,第1~5号条
带较清晰,第6号条带不明显,所有条带均有拖尾现象。
2.2 DNA纯度和浓度检测
由表2所得的OD260/OD280比值及DNA样品的浓
度均为利用3种方法提取多次基因组DNA所得样品的
测量平均值,SDS法所得OD260/OD280比值为1.83,最接
501
·生物技术· 北方园艺2013(03):104~106
图3 简化CTAB法提取基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图谱
Fig.3 ElectropHoresis pattern of DNA of Aloe nobilis
extracted by Simplified-CTAB method
注:M为DNA 2000Marker,1~6为提取的样品DNA。
近1.8,说明样品纯度较高,其本上没有RNA和蛋白质
等杂质的污染;而CTAB法所提DNA样品OD260/OD280
的值都低于1.95,说明有RNA污染;而简化的CTAB
法,因为减少了抽提次数,DNA的浓度明显降低,而且
OD260/OD280的比值为1.31,明显低于1.8,所得的DNA
纯度和浓度都不好。
表1 不同方法提基因组DNA浓度和纯度
Table 1 The concentration and purity of
extracting DNA fromAloe nobilis by diferent methods
方法 OD260/OD280 DNA浓度/μg·μL-1
SDS法 1.83 376.7
CTAB法 1.95 380.0
简化CTAB法 1.31 361.3
3 讨论与结论
该试验中,当减少了氯仿/异戊醇的抽提次数,明显
降低了DNA的浓度,说明氯仿/异戊醇可有效地去除基
因组DNA中的蛋白质、多糖和酚类物质。此外,用异丙
醇沉淀,有利于特异性地沉淀核酸,提高核酸产量,而采
用氯仿/异戊醇抽提,是由于氯仿/异戊醇易于挥发,并
易溶于异丙醇,克服了由于酚等残留带来的困难。这与
王景雪等[12]中所提及到的结论基本相同,是植物基因组
DNA提取中普遍存在的问题。王珍等[13]研究表明,
CTAB法适用于水稻、大豆、玉米、小麦、马铃薯、芦笋、香
石竹等大多数植物DNA的提取,而在对不夜城芦荟基
因组DNA的提取中发现,SDS法明显优于CTAB法,可
能是由于不夜城芦荟含有较多的酚类物质,而SDS法能
更加有效地去除DNA中的酚类物质,SDS法提取的不
夜城芦荟基因组DNA具有较好的纯度和较高的浓度。
试验表明,用SDS法提到的不夜城芦荟基因组
DNA纯度最高,SDS法比较适用于不夜城芦荟基因组
DNA的提取。
参考文献
[1] 吕琳,何聪芬,刘家熙,等.芦荟的生物学特性研究进展[J].中国农学
通报,2004,20(6):89-92.
[2] 王红星,常云霞,李景原,等.遮荫对3种芦荟蒽醌类物质的影响[J].
热带作物学报,2010,31(12):2238-2242.
[3] 李云政,秦海元,王青华,等.国内外芦荟应用研究进展[J].化工进
展,2000,19(2):19-22.
[4] 张倩,马婧,何婧,等.中国芦荟AlDREB2基因的克隆及其胁迫表达
[J].园艺学报,2009,36(11):1659-1666.
[5] 刘思言,姚丹,关淑艳,等.农杆菌介导法将bFGF基因转入木立芦荟
的初步研究[J].河南农业科学,2011,40(7):109-112.
[6] 赵华,赵进,董银卯,等.转TaDREB 基因提高芦荟抗低温特性的研
究[J].中国生物工程杂志,2009,29(9):45-49.
[7] 李希臣,雷勃钧,卢翠华,等.高效的植物DNA提取方法[J].生物技
术,1994,4(3):39-41.
[8] 张继红,陶能国,张小云,等.三种豆科植物总DNA提取方法的比较
[J].湖南农业科学,2007(2):31-33.
[9] 赵姝华,王富德,张世草,等.提取、纯化植物DNA方法的比较[J].
国外农学—杂粮作物,1998,18(2):35-38.
[10]刘学春,潘春欣,宋云枝,等.一种单子叶植物总DNA提取方法的改
进与应用[J].山东农业大学学报,1995,4(26):491-495.
[11]张大明,陈新露,邓峥嵘.木根麦冬干叶提取DNA用于RAPD分析
[J].生物多样性,1996,4(2):119-122.
[12]王景雪,孙毅,高武军,等.一种简便实用的植物总DNA提取方法
[J].山西大学学报(自然科学版),2000,23(3):271-272.
[13]王珍,方宣钧.植物 DNA分离[J].分子植物育种,2003,1(2):
281-288.
Study on Isolation Methods of Genomic DNA in Aloe nobilis
LIU Si-yan1,YAO Dan1,GUAN Shu-yan1,WANG Pi-wu2,SONG Chen-xue1
(1.Colege of Life Sciences,Jilin Agricultural University,Changchun,Jilin 130118;2.Colege of Agronomy,Jilin Agricultural University,
Changchun,Jilin 130118)
Abstract:Taking the young leaves of Aloe nobilis as material,SDS and CTAB and simplified CTAB method were used to
extract genomic DNA from Aloe nobilis,and the content and the purity of DNA were detected by the methods UV
spectrophotometer and agarose gel electrophoresis,to compare various methods of extraction of the quality and eficiency,
and find out the most appropriate method.The results showed that compared three kinds of DNA extraction methods of
Aloe nobilis genome,either from the extract concentration or purity,SDS was significantly better than the other methods.
Key words:Aloe nobilis;method of DNA extraction;SDS method;CTAB method
601