全 文 ：4 种滑叶铁线莲基因组 DNA提取方法比较
胡祎晨1，孙正海1* ，王 锦1，李世峰2，辛培尧1，范 萱1
(1．西南林业大学园林学院，云南昆明 650224;2．云南省农业科学院花卉研究所，云南昆明 650205)
摘要 ［目的］对 4种滑叶铁线莲基因组 DNA提取方法进行比较研究，建立滑叶铁线莲最适 DNA提取方法。［方法］以滑叶铁线莲叶片
为材料，比较改良 CTAB法Ⅰ、改良 CTAB法Ⅱ、改良 CTAB法Ⅲ、改良 SDS法这 4种基因组 DNA提取法在提取 DNA纯度、浓度和提取时间
等方面的不同。［结果］4种方法都可提取滑叶铁线莲基因组 DNA。改良 CTAB法Ⅰ提取 DNA纯度最高，但浓度最低且提取时间最长;改
良 SDS法提取 DNA浓度最高，所需时间较短，但纯度较低;改良 CTAB法Ⅲ提取所需时间最短。［结论］建立了铁线莲最适 DNA提取方
法，为运用分子生物学手段对其研究提供支持。
关键词 滑叶铁线莲;基因组 DNA提取;改良 CTAB法;改良 SDS法
中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611(2011)36 －22215 －02
Comparison on Four Extraction Methods of Genomic DNA from Clematis fasciculiflora Franch
HU Yi-chen et al (School of Gardening，Southwest Forestry University，Kunming，Yunnan 650224)
Abstract ［Objective］This study aimed at comparing the four extraction methods of genomic DNA from Clematis fasciculiflora Franch and de-
termining the optimal extraction method for extracting the genomic DNA from Clematis fasciculiflora Franch． ［Method］Leavies of Clematis fas-
ciculiflora Franch were used as materials for comparing the purity and concentration of extracted DNA and extracting time among the four ex-
traction methods of genomic DNA including improved CTAB methodⅠ，improved CTAB methodⅡ，improved CTAB methodⅢ and improved
SDS method． ［Result］ The four extraction methods could all successfully used for extracting the genomic DNA from Clematis fasciculiflora
Franch． The purity of genomic DNA was the highest using improved CTAB method Ⅰ，with the longest extracting time;while the concentra-
tion of genomic DNA was the maximum using the improved SDS method，with the shortest extracting time and relatively low purity;the extrac-
ting time of improved CTAB method Ⅲ was the shortest． ［Conclusion］This study had established the optimal extraction method for extracting
the genomic DNA from Clematis fasciculiflora Franch and supported for the further research using molecular biological methods．
Key words Clematis fasciculiflora Franch;Extraction of genomic DNA;Improved CTAB method;Improved SDS method
基金项目 云南省应用基础研究项目(2010ZC089);国家林业局 948项目
(2008-4-11);云南省省部级重点学科、省高校重点实验室及
校实验室共享平台资助项目;西南林业大学科技创新基金。
作者简介 胡祎晨(1989 － ) ，男，北京大兴人，从事园林植物相关研究，
E-mail:342131849@ qq． com。* 通讯作者，副教授，博士，从
事园林植物种质资源评价、采后保鲜及生物技术辅助育种
研究，E-mail:sunzhenghai1978@ 163． com。
收稿日期 2011-08-31
铁线莲隶属于毛茛科(Ranunculaceae)铁线莲属(Clema-
tis L．) ，全世界约有 355种［1］，中国约有 147种［2 －4］。铁线莲
属植物为多年生木质或草质藤本，花大色艳，花色丰富，花型
多变，花期长，观赏价值高，有“攀援植物皇后”的美称，是一
种重要的国际观赏植物［5］。该属植物还具有较高的药用价
值，如其含有的三萜皂甙及原白头翁素等生理活性成分，是
我国中医临床和民间常用的利尿通淋或祛风止痛类药物［6］。
铁线莲因其观赏和药用特点，具有广阔的市场开发利用前景。
滑叶铁线莲(Clematis fasciculifloora Franch) ，又名滑叶
藤，俗名“三爪金龙”，分布于我国广西西部、四川西部、云南
等海拔 1 000 ～2 700 m的山坡草丛、松树中或林边等地。其
隶属于铁线莲属中的绣球藤组［7］，按照观赏特点属于冬花
型［8］，具有观赏期长、耐低温和药用价值高等优点，是一种重要
的铁线莲属种质资源。该研究以滑叶铁线莲为材料，综合分析
了 4种 DNA提取方法效果的优劣，旨在建立铁线莲最适 DNA
提取方法，为运用分子生物学手段对其研究提供支持。
1 材料与方法
1． 1 材料及其处理 滑叶铁线莲取自于云南省农业科学院
花卉所种质资源圃。作如下预处理:用 70%酒精擦洗叶片表
面，－70 ℃冰箱保存备用。
1． 2 方法
1． 2． 1 滑叶铁线莲基因组 DNA提取。采用改良 CTAB法Ⅰ、
改良 CTAB法Ⅱ、改良 CTAB法Ⅲ和改良 SDS法 4种方法提取
滑叶铁线莲基因组 DNA。
1． 2． 1． 1 改良 CTAB法Ⅰ。①取叶片 0． 5 g放入研钵中，加液
氮研磨成粉末后装入1． 5 ml离心管;②加入0． 5 ml 2 × CTAB
(含 β-巯基乙醇)缓冲液，充分混匀后于 65 ℃水浴保温 1 h，
冷却至室温;③加入等体积氯仿 －异戊醇(24∶ 1) ，充分混匀，
12 000 r /min离心 10 min;④重复步骤③1次;⑤取上清液，加
入 4倍体积的 1 × CTAB沉淀缓冲液，混匀，室温静置 30 min;
⑥12 000 r /min 离心 5 min，取沉淀，悬浮于 400 μl 1 mol /L
NaCl溶液;⑦加入 2. 5 倍体积 － 20 ℃保存的无水乙醇，
12 000 r /min离心 5 min;⑧用 70%乙醇漂洗沉淀 2次，吹干，
溶于 100 μl TE 缓冲液中;⑨加入 5 μl 10 mg /ml RNaseA，
37 ℃保温 1 h，乙醇沉淀，沉淀溶于 100 μl TE缓冲液，备用。
1． 2． 1． 2 改良 CTAB法Ⅱ。① ～④步与改良 CTAB法Ⅰ相同;
⑤加入 2． 5倍上清液体积的 － 20 ℃无水乙醇，－ 20 ℃静置
1 h;⑥12 000 r /min离心 5 min，取沉淀;⑦用 70%乙醇漂洗
沉淀 2次，吹干，溶于 100 μl TE缓冲液中。
1． 2． 1． 3 改良 CTAB法Ⅲ。①取 0． 5 g叶片置于研钵中，加
液氮研磨成粉末后装入 1． 5 ml 离心管;②加入 900 μl 2 ×
CTAB提取缓冲液，混匀后置于 65 ℃水浴保温 1 h;③冷却至
室温，加入 600 μl 24 ∶ 1的氯仿-异戊醇颠倒混匀;④12 000
r /min离心10 min，取上清液，加入等体积预冷的异丙醇，轻微
摇匀，－20 ℃放置 30 min以上;⑤12 000 r /min离心10 min，
除去上清液;⑥用 70%乙醇洗沉淀 2 次，用无水乙醇清洗沉
淀 1次;⑦室温下晾干 DNA(20 min 左右) ，加灭菌 TE 溶液
溶解，4 ℃低温保存备用。
1． 2． 1． 4 改良 SDS法。①取叶片 0． 5 g于研钵中，加液氮研
磨成粉末后装入 1． 5 ml离心管，加入 1 ml提取液(0． 4 mol /L
安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2011，39(36):22215 － 22216，22363 责任编辑 朱琼琼 责任校对 卢瑶
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2011.36.252
葡萄糖，3%PVP，2%β-硫基乙醇)摇匀，室温下静置 10 min;
②10 000 r /min离心 10 min，倒出上清液，再加入 1 ml 提取
液，10 000 r /min离心 10 min;③去上清液，加入 586 μl SDS-
free、14 μl 20%SDS，混匀后 65 ℃恒温水浴 1 h，冷却至室温，
10 000 r /min离心 10 min;④取上清液加入等体积 24∶ 1氯仿-
异戊醇，轻轻混匀数分钟，10 000 r /min离心 10 min;⑤重复
步骤④;⑥取上清液加入 2 /3 体积预冷异丙醇轻轻混匀，于
－ 20 ℃冰箱放置 30 min，10 000 r /min离心 10 min;⑦弃上清
液，加入 1 ml 76%酒精(10 mmol /L NH4AC)洗涤沉淀 2 次;
⑧轻轻倒出酒精，待 DNA 自然吹干后溶于 100 μl RNase 酶
水中，于 －20 ℃冰箱备用。
1． 2． 2 滑叶铁线莲基因组 DNA检测。
1． 2． 2． 1 Nanovue 超微量分光光度计检测。用 Nanovue 超
微量分光光度计测定滑叶铁线莲基因组 DNA OD260 /OD280比
值和浓度，每种提取方式测定 3管，每管测 3次取平均值。
1． 2． 2． 2 琼脂糖电泳检测。用 1%琼脂糖凝胶电泳，稳压
200 V，EB染色检测 4种滑叶铁线莲基因组 DNA提取效果，
每种方法检测 3管。
2 结果与分析
2． 1 滑叶铁线莲基因组 DNA Nanovue 超微量分光光度计
检测结果 植物基因组纯 DNA OD260 /OD280通常在 1． 80 ～
1. 90之间，大于 1． 90表明存在 RNA污染，小于 1. 80 表明存
在蛋白质或酚类污染。据此由表 1 可知，改良 CTAB法Ⅰ效
果最好，OD260 /OD280比值在 1． 80 ～1． 90之间;改良 CTAB法Ⅱ
OD260 /OD280比值大于 1． 90，说明该方法提出的 DNA中 RNA
浓度偏高;改良 CTAB法Ⅲ和改良 SDS法 OD260 /OD280比值均
小于 1． 80，表明此 2种方法蛋白质或酚类浓度较高。4 种提
取方法中 DNA 浓度以改良 SDS 法最高，平均为 216． 73
μg /ml，表明该法在提取过程中 DNA 损失较少;改良 CTAB
法Ⅱ和改良 CTAB 法Ⅲ浓度相近，在 161． 51 ～ 177． 27 μg /ml
之间;改良 CTAB法Ⅰ浓度最低(13． 58 μg /ml) ，说明该方法在
提取过程中 DNA损失较多。
表 1 4种方法提取滑叶铁线莲基因组 DNA DNA Nanovue检测结果
Table 1 Determination results of genomic DNA of Clematis fasciculi-
flora Franch using Nanovue spectrophotometer
方法
Method
编号
No． OD260 OD280
OD260 /
OD280
DNA浓度
Concentration
μg /ml
平均 DNA
浓度
Average
concentration
μg /ml
改良 CTAB法Ⅰ 1 0． 26 0． 14 1． 89 5． 47
Improved CTAB 2 0． 55 0． 31 1． 80 19． 83
methodⅠ 3 1． 11 0． 60 1． 85 15． 45 13． 58
改良 CTAB法Ⅱ 1 51． 09 23． 65 2． 16 164． 40
Improved CTAB 2 51． 64 26． 90 1． 92 122． 30
methodⅡ 3 56． 15 25． 88 2． 17 197． 80 161． 51
改良 CTAB法Ⅲ 1 18． 73 11． 63 1． 61 256． 80
Improved CTAB 2 8． 68 5． 64 1． 54 137． 80
methodⅢ 3 7． 81 4． 97 1． 57 137． 20 177． 27
改良 SDS法 1 4． 71 2． 80 1． 68 121． 70
Improved SDS 2 10． 68 6． 36 1． 68 256． 00
method 3 10． 27 5． 90 1． 74 272． 50 216． 73
2． 2 滑叶铁线莲基因组 DNA琼脂糖检测结果 由图 1 可
知，改良 SDS法提取 DNA电泳条带最亮，改良 CTAB法Ⅲ次
之，说明 2种方法提取 DNA浓度较高，但由图可发现这 2 种
方法检测得到的条带分成 2 个区，说明 DNA 纯度不高。改
良 CTAB法Ⅰ在 4种方法中，条带较暗，但无明显的分区现象，
说明该方法 DNA纯度较高。
注:M． DL 3 000 DNA Marker;1 ～ 3 号泳道为改良 CTAB法Ⅰ;4 ～ 6
号泳道为改良 CTAB法Ⅱ;7 ～9号泳道为改良 CTAB法Ⅲ;10 ～
12泳道为改良 SDS法。
Note:Lane 1 － 3:Improved CTAB methodⅠ;Lane 4 － 6:Improved
CTAB methodⅡ;Lane 7 －9:Improved CTAB methodⅢ;Lane
10 －12:Improved SDS method．
图 1 滑叶铁线莲 4种 DNA提取方法电泳检测结果
Fig． 1 Agarose gel electrophoresis results of genomic DNA of
Clematis fasciculiflora Franch extracted with four extrac-
tion methods
2． 3 4种方法时间和试验步骤复杂程度比较 比较 4 种提
取方法提取花费时间和试验步骤复杂程度，发现改良 CTAB
法Ⅲ所用时间最短，为 2． 8 h 左右，试验步骤最简单;改良
CTAB法Ⅰ所用时间最长，为 3. 8 h左右，试验步骤最多;改良
CTAB法Ⅱ(3. 2 h左右)和改良 SDS法(3. 6 h左右)所用时间
和试验步骤复杂程度相当。
3 结论与讨论
综合比较 4种提取方法，发现 4种方法都可以成功提取
滑叶铁线莲基因组 DNA。其中改良 CTAB 法Ⅰ所提 DNA 纯
度最高，改良 CTAB 法Ⅱ所提 DNA 中 RNA 浓度偏高，改良
CTAB法Ⅲ和改良 SDS法所提 DNA 中蛋白质或酚类浓度较
高。从 DNA浓度和提取复杂程度方面进行比较，改良 CTAB
法Ⅰ所提 DNA 浓度最低，所需时间最长;改良 SDS 法所提
DNA浓度最高，所需时间较短。
目前，植物基因组常用提取方法均由 CTAB法和 SDS法
演化而来，不同植物有相应的 DNA提取方法，甚至同一植物
不同器官所用提取方法也存在差异，如有些植物叶片采用
CTAB法效果较佳，而有些植物则是种子采用 CTAB法效果
较佳［9 －13］。衡量一种提取方法是否理想，关键满足 2 个条
件:①模板的纯度高、完整性好、所提取的量充足;②操作简
单迅速、费用低、效率高［14］。但这 2个条件往往存在矛盾，如
提取步骤越多，提取 DNA纯度越高，但浓度较低;反之，DNA
纯度较低，而浓度较高，如该研究中采用的改良 CTAB法Ⅰ和
改良 SDS法。不同分子生物学研究方法对 DNA 的要求不
同，故应根据具体的研究方法和研究材料数量来确定相应的
DNA提取方式。
(下转第 22363页)
61222 安徽农业科学 2011 年
注:M．标准蛋白;1．处理①;2．处理②;3．处理③;4．处理④．
Note:M． Marker;1． Treatment ①;2． Treatment ②;3． Treatment ③;4．
Treatment ④．
图 6 BABA处理后烟叶可溶性蛋白的 SDS-PAGE结果
Fig． 6 SDS-PAGE results of soluble proteins in tobacco leaves
treated by BABA
导植物耐热性、耐盐性、耐低钾、耐重金属等特性［13 －16］。
BABA的诱抗效果与 BABA的诱抗浓度、作物种类、处理部位、
处理方式有关，该试验中 BABA的最适浓度为 5. 0 mmol /L。
(2)过敏反应是植物与病原菌非亲和互作导致的植物被
侵染部位细胞迅速坏死，限制病原菌在其体内的扩展，同时
诱发植物的主动防卫机制，从而使植物对病原物产生抗
性［9］。该试验结果显示，BABA处理能诱导烟草产生过敏反
应，BABA 处理后 2 d 接种 TMV，过敏反应减轻，可能是
BABA处理激活了烟草自身的防御体系，进入了对病原菌的
防卫状态，有效地抵抗了 TMV的侵染。H2O2 在植物抗病反
应中可能作为信号分子参与抗病反应信息传递，进而激发植
物细胞内的各种防卫反应和产生抗性。BABA 处理诱导
H2O2积累，影响活性氧和活性氧清除酶之间的平衡。PAL的
活性可作为植物抗病能力的一个生理指标，也是诱导防卫反
应标志性酶，在植物的抗病过程中起着重要作用。BABA处
理能提高 PAL 的活性，保护烟草抵抗 TMV 的侵染。BABA
诱导抗病的反应会随着时间的变化而变化，BABA的持效期
还有待进一步研究。
(3)病程相关蛋白(PR蛋白)是植物受病原物侵染过程
中被诱导产生的一类分子量为10 ～40 kDa的蛋白质，大多数
PR蛋白都与植物获得抗性有关，但研究者们对将 PR蛋白的
积累作为 BABA诱导植物抗病的作用机制存在很大异议［3］。
该试验中诱导出的是哪种 PR蛋白还有待进一步证实。
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