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意大利牛舌草中芦丁的分离及定量分析研究



全 文 :基金项目:新疆维吾尔自治区科技计划项目(201130105)
作者简介:常 文(1988-),女,在读硕士,研究方向:中药民族药研究。
通信作者:马桂芝,女(回族),博士,副教授,硕士生导师,研究方向:中药民族药研究,E-mail:maguizhi000@126.com。
意大利牛舌草中芦丁的分离及定量分析研究
常 文1,路文杰1,代己果1,马桂芝1,滕 亮2,3
(新疆医科大学1药学院,乌鲁木齐 830011;2第一附属医院药学部,乌鲁木齐 830054;3第一附属医院昌吉分院,新疆,昌吉 831100)
摘要:目的 确定意大利牛舌草中芦丁的分离方法并建立用于测定意大利牛舌草中芦丁含量的 HPLC方
法。方法 采用硅胶柱色谱对意大利牛舌草乙酸乙酯萃取物进行分离纯化。建立测定意大利牛舌草中芦丁含量
的反相高效液相色谱法,色谱条件:色谱柱Kromasil C18(5μm,250mm×4.6mm);以乙腈-0.2%磷酸水溶液进行
线性梯度洗脱:0~9min 83%~80%B,9~20min 80%~68%B,20~40min 68%~40% B,40~45min 40%~
83%;流速1.0mL/min;检测波长354nm,柱温30℃。结果 通过分离鉴定在意大利牛舌草乙酸乙酯萃取物中
得到单体化合物1,1 H-NMR与13 C-NMR结果提示其化合物1为芦丁。在1.64×10-3~5.255×10-2 mL/min范
围内芦丁浓度与其峰面积呈良好的线性关系 (r=0.999 7),且不同批次的意大利牛舌草中的芦丁含量最低,为
(1.299 7±0.014 1)mg/g。结论 首次从意大利牛舌草中分离得到芦丁,所建立的用于测定芦丁含量的 HPLC
法简便、准确,重现性好,结果准确可靠,为提高意大利牛舌草的质量标准奠定了试验基础。
关键词:意大利牛舌草;芦丁;高效液相色谱法;含量测定
中图分类号:R914  文献标识码:A  文章编号:1009-5551(2016)05-0591-04
doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2016.05.016
Separation and identification of rutin in Anchusa italica Retz.
CHANG Wen1,LU Wenjie1,DAI Jiguo1,MA Guizhi 1,TENG Liang2,3
(1 College of Pharmacy,Xinjiang Medical University,Urumqi 830011,China;2 Department of
Pharmacy,the First Affiliated Hospital,Xinjiang Medical University,Urumqi 830054,China;
3 Branch of the First Affiliated Hospital,Xinjiang Medical University,Xinjiang Changji 831100,China)
Abstract:Objective To separate and identify the contents of rutin extracted fromAnchusa italica Retz.
Methods The ethyl acetate extracts were isolated and separated by silica gel,the structure was identified
by 1 H-NMR and 13 C-NMR.The contents identification of rutin was performed by RP-HPLC.The condi-
tions of HPLC was as folows:Kromasil C18(5μm,250mm×4.6mm)columns was used and gradient elu-
tion solvents was the mixture of acetonitrile and 0.2%phosphoric acid,the flow rate was 1.0mL/min,the
detective wave length was at 354nm,column temperature was 30℃。Results Rutin was obtained and i-
dentified from Ethyl acetate extracts.There was a linear relationship between concentration of rutin and
peak area in the range of 0.00164mL/min~0.05255mL/min,and the content of rutin in different batches
Anchusa italica Retz.is 1.2997±0.0141mg/g.Conclusion Rutin were firstly isolated from Anchusa
italica Retz.The identification method using HPLC was simple,accurate and reliable,which lays the ex-
perimental fundatioin for the establishment of quality standard of Anchusa italica Retz.
Keywords:Anchusa italica Retz.;rutin;HPLC;determination
  意大利牛舌草 (Anchusa italica Retz.)为紫草
科(Boraginaceae)多年生草木植物,主要分布于伊
朗、俄罗斯等地区,全草入药,本品具有杀原虫作用,
并可作缓泻剂和解热剂。意大利牛舌草维文名为高
 第39卷 第5期 新 疆 医 科 大 学 学 报 Vol.39 No.5
 2016年5月 Journal of Xinjiang Medical University May.2016
孜万,主治干寒性或黑肥质性疾病,如平性脑虚、寒
性心虚、心悸、抑郁症、干性脑膜炎、肺炎及结核疾
病、寒性咳嗽、感冒、气喘等。《药物之园》记载该药
材具有“生湿消炎、除狂安神、消除黄疸、溶石排石及
治脑膜炎、癫狂、肾结石、膀胱结石等”功效[1]。目前
对意大利牛舌草的研究主要集中在总黄酮的提取与
临床研究等方面,临床研究表明意大利牛舌草中的
总黄酮对心脏系统疾病有一定的治疗效果[2-7]。本
课题前期对意大利牛舌草的化学成分进行了初步的
研究,结果表明该药材含有较为丰富的黄酮类成
分[8]。本研究旨在确定意大利牛舌草乙酸乙酯萃取
物中芦丁的提取分离方法(首次从意大利牛舌草中
分离获得)以及建立用于测定意大利牛舌草中芦丁
含量的 HPLC方法,为提高意大利牛舌草的质量标
准奠定试验基础,现报道如下。
1 仪器与试药
1.1 仪器 LC-20A 日本岛津高效液相色谱仪,
ZF-2型三用紫外仪(上海安亭电子仪器厂),旋转蒸
发仪(上海亚荣生化仪器厂),YP1002N电子天平
(上海青海仪器有限公司),Bruker-600型核磁共
振仪。
1.2 试药 意大利牛舌草的产地分别为巴基斯坦、
印度尼西亚,经新疆医科大学药学院帕丽达教授鉴
定为紫草科(Boraginaceae)多年生草木植物意大利
牛舌草 (Anchusa italica Retz.)的地上部分。芦丁
对照品(中国食品药品检定研究院,批号100080-
200707),乙腈为色谱纯(Sigma公司产品),柱色谱
用硅胶200-300目(青岛海洋化工厂),其他试剂均
为分析纯,水为纯化水。
2 方法与结果
2.1 意大利牛舌草中芦丁的提取、分离 取意大利
牛舌草10kg,用60%乙醇提取3次,每次2h,合并
提取液后浓酸至无醇,用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇
依次萃取,得乙酸乙酯萃取物约74g,经常压硅胶
(200~300目)柱层析,石油醚-乙酸乙酯(50∶1、20
∶1、10∶1、7∶1、5∶1、2∶1、1∶1)梯度冲洗,每个
梯度约20个柱体积,得到18个部分(Fr.1~Fr.
18)。Fr.17(3.2g)经常压硅胶柱色谱,石油醚-乙酸
乙酯(50∶1、20∶1、10∶1、7∶1、5∶1、2∶1、1∶1)
梯度洗脱,分为8个部分(Fr.17.1~Fr.17.8)。Fr.
17.7(1.2g)经常压硅胶柱色谱,石油醚-乙酸乙酯
(50∶1,20∶1,10∶1,7∶1,5∶1,2∶1,1∶1)梯度
洗脱,分为12个部分,Fr.17.10有黄色粉末,用不同
的试剂纯化,得化合物1(4.1mg)。
2.2 结构鉴定 化合物1黄色粉末 (甲醇)。1 H-
NMR(600MHz,MeOD)δ:7.68(1H,d,J =2.4
Hz,H-2′),7.64(1H,dd,J =2.4,1.8Hz,H-
6′),6.88(1H,d,J=7.8Hz,H-5′),6.40(1H,
d,J=1.8Hz,H-8),6.21(1H,d,J =1.2Hz,
H-6),13 C-NMR(150MHz,MeOD)δ:158.48(C-
2),135.65(C-3),179.39(C-4),162.95(C-5),
99.95(C-6),166.01(C-7),94.88(C-8),159.33
(C-9),104.76(C-10),123.11(C-1′),116.06(C-
2′),145.82(C-3′),149.8(C-4′),117.71(C-5′),
123.58(C-6′),102.42(C-1'),105.62(C-1')。以上
数据与文献[9]一致,故确定化合物为芦丁(Rutin)。
2.3 HPLC法测定意大利牛舌草中芦丁的含量
2.3.1 色谱条件[10-15] Kromasil C18色谱柱(5μm,
250mm×4.6mm);流动相:乙腈(A)-0.2%磷酸水
溶液(B)梯度洗脱:0~9min 83%~80% B,9~20
min 80%~68%B,20~40min 68%~40%B,40~
45min 40%~83% B;流速:1.0mL/min;检测波
长:354nm;柱温:30℃;进样体积:20μL。在该色
谱条件下样品中芦丁与相邻色谱峰分离度良好,理
论塔板数按芦丁计算大于5 000,对照品和供试品色
谱图见图1。
   
图1 芦丁对照品(a)和样品(b)液相色谱图
2.3.2 对照品溶液的制备 精密称取芦丁对照品10
mg于10mL量瓶中,用甲醇溶解并定容至刻度,摇
匀,精密移取1mL于10mL容量瓶中,加甲醇定容
至刻度,制成每毫升约含0.1mg的溶液,即得。
2.3.3 供试品溶液配制 称取2.5g意大利牛舌草
粉末,精密称定,加入60%乙醇15mL 80℃ 回流提
295 新 疆 医 科 大 学 学 报 第39卷 
取3次,每次2h,合并提取液,定容至50mL,放冷
至室温,取5mL减压回收溶剂,残渣用甲醇溶解,
转移至25mL量瓶中,用甲醇稀释至刻度,微孔滤
膜(0.22μm)过滤,续滤液即为供试品溶液。
2.3.4 线性关系考察 精密移取芦丁对照品溶液
用倍量稀释法得等梯度浓度的对照品溶液,分别精
密吸取不同浓度的对照品溶液20μL (5.255×
10-2、2.628×10-2、1.314×10-2、6.57×10-3、3.28
×10-3、1.64×10-3 mg/mL)注入高效液相色谱仪,
按“2.3.1”项下色谱条件测定峰面积,以峰面积(Y)
对芦丁浓度(X,mg/mL)进行线性回归,方程为Y
=27 168 911 X+13 786.8(r=0.999 7),结果表明
在1.64×10-3~5.255×10-2 mg/mL范围内峰面
积与芦丁浓度线性关系良好。
2.3.5 精密度试验
2.3.5.1 日内精密度 分别取不同浓度(1.64×
10-3、1.314×10-2、5.255×10-2 mg/mL)对照品溶
液20μL,连续进样5次,按“2.3.1”项下色谱条件测
定峰面积,RSD值分别为0.78%、1.05%、1.24%。
2.3.5.2 日间精密度 分别取不同浓度(1.64×
10-3、1.314×10-2、5.255×10-2 mg/mL)对照品溶
液20μL,连续进样3d,按“2.3.1”项下色谱条件测
定峰面积,RSD值分别为1.12%、1.48%、1.16%。
精密度试验结果提示仪器精密度符合方法学要求。
2.3.6 稳定性试验 取意大利牛舌草粉末,照样品
处理方法进行处理后,于常温下放置0、2、4、6、12、
24h,按“2.3.1”项下色谱条件测定峰面积,RSD为
1.91%,结果表明供试品在24h内稳定性良好。
2.3.7 重复性试验 取同一批意大利牛舌草粉末6
份,按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液,按“2.3.1”
项下色谱条件测定峰面积并计算含量,RSD 为
1.90%,表明该方法重现性良好。
2.3.8 加样回收试验 取9份已知芦丁含量的意
大利牛舌草粉末约2.5g,精密称定,分别精密加入
芦丁对照品(0.030 3mg/mL)8、10、12mL,按前法
制备供试品溶液,按 “2.3.1”项下色谱条件测定峰面
积并计算含量,结果平均加样回收率分别为98.5%、
99.0%、99.4%,RSD 值分别为 0.38%、0.62%、
1.86%,见表1。
表1 芦丁加样回收试验(n=9)
No. 样品中芦丁含量/mg 加入量/mg 测得量/mg 回收率/% 平均值/% RSD/%
1  3.273 7  2.402 4  5.615 0  98.1  98.5  0.38
2  3.274 4  2.402 4  5.631 1  98.6
3  3.274 2  2.402 4  5.640 0  98.9
4  3.274 2  3.003 0  6.240 0  98.9  99.0  0.62
5  3.274 5  3.003 0  6.225 0  98.4
6  3.274 4  3.003 0  6.265 0  99.6
7  3.274 2  3.603 6  6.853 9  99.3  99.4  1.86
8  3.274 1  3.603 6  6.798 9  97.6
9  3.2744  3.603 6  6.920 9  101.3
2.3.9 样品含量测定 分别精密称定不同产地的
牛舌草2.5g,按前法制备供试品溶液,照“2.3.1”项
下色谱条件测定峰面积并计算含量,结果在1.64×
10-3~5.255×10-2 mL/min范围内芦丁浓度与其
峰面积呈良好的线性关系 (r=0.999 7),且不同批
次的意大利牛舌草中的芦丁含量最低,为(1.299 7
±0.014 1)mg/g,见表2。
表2 不同产地意大利牛舌草中芦丁的含量测定(n=3)
No. 产地 批号 芦丁含量(mg/g)
1 印度尼西亚 20150104  1.344 9±0.020 7
2 巴基斯坦 20150104  1.309 5±0.013 7
3 巴基斯坦 20151025  1.351 1±0.016 4
4 巴基斯坦 20151217  1.327 1±0.018 5
5 巴基斯坦 20160103  1.299 7±0.014 1
6 巴基斯坦 20140604  1.324 4±0.015 1
7 巴基斯坦 20141028  1.311 7±0.014 8
8 巴基斯坦 20150413  1.328 8±0.017 0
3 讨论
牛舌草具有抗炎、抗癌、抗心肌缺血再灌注损伤
等作用[16],这些药理作用的物质基础则是药材所含
的多种成分。本课题组前期研究表明意大利牛舌草
所含黄酮类成分较多[17]。本研究则采用传统的天
然药物化学研究手段在意大利牛舌草的乙酸乙酯提
取物中首次分离鉴定了芦丁,为后期该药材药效物
质基础研究奠定了基础;在分离鉴定的基础上,建立
了符合方法学要求的测定药材中芦丁含量的HPLC
法,方法简便、可行,对意大利牛舌草质量控制有一
定意义。本课题组将对意大利牛舌草的黄酮类成分
进行深入的研究,同时也会结合药理学研究手段探
索其可能的作用机制。
参考文献:
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(下转598页)
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[收稿日期:2016-03-16]
(本文编辑 杨晨晨)
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[收稿日期:2016-01-08]
(本文编辑 施洋)
895 新 疆 医 科 大 学 学 报 第39卷