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5种不同寄主来源的红花寄生叶提取物清除羟自由基的能力



全 文 :第 26卷 第 4期
2010年 7月
福建师范大学学报 (自然科学版 )
Journal of Fujian Normal Univ e rsity ( Na tural Science Edition)
Vo l. 26  No. 4
Jul. 2010
文章编号: 1000-5277( 2010) 04-0084-06
5种不同寄主来源的红花寄生叶提取物清除羟自由基的能力
周冰洁 , 陈炳华 , 王晶晶 , 赖京菁 , 肖义军
(福建师范大学生命科学学院 , 福建 福州  350108)
  摘要: 采用荧光法测定了寄生于夹竹桃、 女贞、 石榴、 荷花玉兰和长梗柳等 5种植物上的红花寄生不同
溶剂 (水、 体积分数 80%甲醇、 体积分数 80%丙酮 ) 叶提取物对羟自由基的清除能力 , 结果表明: 红花寄生
叶提取物有清除羟自由基的活性 ,且清除能力的强弱受提取剂、不同寄主来源的影响显著 . 以体积分数 80%
甲醇和体积分数 80%丙酮为溶剂获得的叶提取物对· O H的清除作用较强 ;在 5种不同寄主来源的甲醇提取
物中 ,以长梗柳、 石榴和夹竹桃上寄生的清除能力较强 , 其dEC50分别为 0. 220, 0. 264, 0. 272 mg· m L- 1 . 此
外 , 统计分析显示红花寄生叶提取物对羟自由基的清除能力与其总酚和总黄酮含量呈显著正相关 ,相关系数
R2分别为 0. 705、 0. 640, 表明提取物中酚性物质参与了清除羟自由基的反应 .
关键词: 红花寄生 ; 荧光法 ; 羟自由基 ; 多酚 ; 黄酮
中图分类号: Q946. 91; S792. 95   文献标识码: A
 收稿日期: 2009-05-25
 基金项目: 福建省科技厅资助项目 ( 2008F5018) ; 福建师范大学国家级生物学实验教学示范中心创新性研究项目 ( 2009ls007) ; 福建
师范大学大学生课外科技计划项目 ( BKL2009081)
 通讯作者: 陈炳华 ( 1970—   ) , 副教授 , 硕士 , 主要从事天然产物化学的科研及植物学教学工作 . bhch en@ fjnu. edu. cn
Study on Hydroxyl Radical Scavenging Activities of Leaves Extracts
of Scurrula paras itica Sourced from Five Different Host Trees
ZHOU Bing- jie, CHEN Bing-hua, WANG Jing- jing , LAI Jing- jing, Xiao Yi- jun
(College of L if e Sciences, Fujian Normal University , Fuz hou 350108, China )
Abstract: The hydroxy radical scavenging capaci ty o f di fferent so lv ents ( w ater, 80%
methano l and 80% acetone) o f leaf ex t racts f rom Scurrula parasitica , parasi tic on Nerium in-
dicum , Salix dunnii , Ligustrum lucidum , Punica granatum , Magnol ia grandi f lora , w ere de-
tected by fluo rescence spect rophotometry. The resul t indicated tha t leaf ex t racts of
S. parasit ica exhibited scavenging activi ty on hydro xy radical , w hich was significantly affect-
ed by dif ferent ex traction agent and ho st t rees. Ex t racts o f 80% methano l and 80% acetone
had stonger hydro xy radical scavenging actv ities than w ater ex tracts. Among the five di ffer-
ent ho st t rees, 80% methanol ex tracts sourced from Salix dunnii , Punica granatum and Neri-
um indicum show ed higher radical-scanvenging w ith dEC50 values of 0. 220, 0. 264, 0. 272
mg· mL- 1 , respectiv ely. In addition, a posi tiv e correlation w as observ ed betw een scavenging
capaci ty of ex t racts and polypheno l and flav onoid content wi th the correlation coef ficient-
content o f 0. 705, 0. 640, respectiv ely. It indicated tha t phenolic substances of ex t racts con-
tributed to the hydro xy radical scavenging reaction.
Key words: Scurrula parasitica; f luo rescence spect ropho tometry; hydroxy radical;
polyphenol; f lav onoids
红花寄生 ( Scurrula parasit ica L. ) 是桑寄生科半寄生性灌木 , 产于福建、 云南、 四川、 广西、 广
东、 台湾等省区 [1 ] . 野外调查发现 , 红花寄生的寄生树种较为广泛 , 可寄生于夹竹桃 ( Nerium
indicum )、 长梗柳 ( Salix dunnii )、 女贞 (Ligustrum lucidum )、 石榴 (Punica granatum )、 荷花玉兰
(Magnolia grandi f lora )、 豆梨 ( Pyrus calleryana )、 柚 (Citrus max ima )、 朴树 (Celt is sinesis )、 无患
子 ( Sapindus mulorossi )、 桂花 (Osmamthus f ragrans )、 桑 ( Morus alba )、 樟树 ( Cinnamomum
camphora ) 等 30余种植物 . 全株可入药 , 传统上常作为桑寄生 ( Tax illus chinesis ( DC. ) Danser) 的
代用品入药 , 具补肝肾、 祛风湿、 降血压、 安血养胎等功效 , 主治风湿、 关节痛、 高血压、 坐骨神经
痛、 腰痛、 产后少乳等症 [1 ] .
前期研究表明 ,红花寄生枝叶中含有大量的黄酮等酚性物质 [2 ] ;寄主植物为夹竹桃的红花寄生总黄
酮提取物具有一定的抗白血病、 抗肿瘤效果 , 并与临床常用抗肿瘤药物多柔比星有显著的抗肿瘤协同
效应 , 是一种有开发应用前景的天然植物提取物 [3 ] ; 不同寄主 (夹竹桃、 桑树、 无患子、 桂花 ) 来源的
红花寄生总黄酮提取物抗肿瘤效果与其寄主植物相关 [ 4] ;另外 ,长梗柳上寄生的红花寄生叶提取物中酚
类物质丰富 ,抗氧化活性较强 ,且两者具有一定的相关性 [5 ] . 但有关红花寄生对羟自由基清除作用的研
究尚未见报道 . 本实验采用荧光法 , 测定了 5种寄主来源的红花寄生水提取物、 甲醇提取物和丙酮提
取物对羟自由基的清除作用 , 并分析了羟自由基清除能力与其可能抗氧化作用成分的相关性 .
1. 1 材料与仪器
红花寄生叶分别采自寄主为夹竹桃、 女贞、 石榴、 荷花玉兰及长梗柳等植物枝上 . 取其叶 , 除杂、
洗净后 , 经 80℃烘干、 粉碎后过 60目筛 , 存于 4℃冰箱备用 .
罗丹明 B ( Rhodamine B, RhB)和福林酚 ( Fo lin-Ciocal tent reagent )均购自美国 Sigma公司 ; 芦
丁、 丹宁酸、 硫酸亚铁、 碘化钾、 过氧化氢、 甲醇和丙酮等 , 均为国产分析纯 .
F-4600荧光分光光度计 (日本 HIT ACHI公司 )、 Ultro-spec2100 pro紫外可见光分光光度计 (美
国 Amersham Bio sciences公司 )、 pHS-3C的酸度计 (上海雷磁仪器厂 )、 V C750型超声波细胞破碎仪
(美国 Sonics& M aterials公司 )、 RE52CS-1旋转蒸发器 (上海亚荣生化仪器公司 )、 Heto LyoLab3000冷
冻干燥机 (丹麦 Heto-Hol ten公司 ) 等 .
1. 2 实验方法
1. 2. 1 溶剂提取物的制备
以红花寄生叶粉末为材料 , 分别以高纯水、 体积分数均为 80%的丙酮和甲醇为溶剂进行超声波辅
助浸提 , 获得 3种溶剂提取物 , 贮于 - 20℃冰箱中备用 . 具体操作参照文献 [5 ].
1. 2. 2 清除羟自由基能力的测定
采用荧光法 ,基本原理为罗丹明 B在略酸性介质中激发波长和发射波长分别为 358 nm和 575 nm.
利用 Fenton试剂 ( Fe2+ + H2O2 )产生的· OH能迅速氧化罗丹明 B导致荧光猝灭 , 使体系荧光强度降
低 . 当在体系中加· OH清除剂后 , 由于清除剂对· OH的清除作用而使体系的荧光强度降幅减小 , 从
而通过体系荧光强度的变化间接测定清除剂 (样品 )对· OH的清除能力 [6 ] . 具体操作参照 Liang等 [7 ]
的方法 , 略有改进 . 按表 1顺序进行加样 . 快速摇匀 , 室温静置 6 min, 固定激发波长 358 nm处同步
扫描荧光发射光谱 , 并记录发射波长 575 nm处的荧光强度 , 计算· OH的清除率 .
羟自由基 ( OH)的清除率 = ( Fs - Fb ) /( Fc - Fb ) × 100% .
其中 ,Fs代表体系中加入清除剂 (样液 )时的荧光强度 (样品管 ) ; Fb代表体系中不加入 H2O2时的荧光强
度 (空白管 ) ; Fc代表体系中未加 H2O2及清除剂时的荧光强度 (对照管 ) .
表 1 羟自由基 (· OH ) 实验加样表
测试管 样液 C ( HCl-Na Ac缓冲液 ) /
( mol· L- 1 )
V ( K I) /
mL
V ( FeSO4· 7H2O) /
m L
V ( H2O2 ) /
m L
V (罗丹明 B) /
m L
V (高纯水 ) /
mL
样品管 0. 1 1. 0 0. 2 0. 2 0. 05 0. 6 2. 85
空白管 0 1. 0 0. 2 0. 2 0. 05 0. 6 2. 95
对照管 0 1. 0 0. 2 0. 2 - 0. 6 3. 00
  注:测试管体积为 5 m L, HCl-NaAc缓冲液 pH 4. 95
1. 2. 3 总酚、 总黄酮含量的测定
总酚含量测定采用 Folin-Ciocalteu试剂比色法 [5 ] ,以丹宁酸为标准品 ,计算样品中总酚含量 .总黄
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酮含量测定采用 AlCl3显色法 [5 ] , 以芦丁为标准品 , 计算样品中总黄酮含量 .
2 结果与分析
2. 1 羟自由基体系的建立
· OH是氧化能力最强 ,同时也是对机体造成损伤最大的一类自由基 [8 ] ,目前羟自由基检测较可靠
的方法有电子自旋共振 ( ESR) 法 [9 ]、 化学发光法 [10 ]、 荧光法 [6- 8 ]和 HPLC[11 ] . ESR和 HPLC法均因
为仪器昂贵 , 操作复杂 , 一般实验室难以使用 , 而荧光法具有稳定性好、 操作简便、 测定快速、 经济
实用等特点 [6- 8 ] . 根据现有实验条件 , 文中采用荧光同步扫描法测定样品对· OH清除能力 . 体系中以
358 nm激发时 , Rh B在 575nm处有最大发射光谱 (见图 1 ( a) ) , Fenton反应产生的· OH可猝灭 RhB
荧光 (见图 1 ( e) ) . 当体系中加入提取物 (质量浓度为 0. 5 mg· mL- 1的红花寄生提取物 ) 后 , · OH
被清除 , RhB荧光的猝灭减少 , 体系中荧光强度随之升高 (见图 1 (b) ~ 图 1 ( d) ) , 可见 , 从荧光强
度的变化可反映提取物清除· OH能力强弱 . 文中采用该体系测定了来源于 5种不同寄主植物的红花
a: 对照 ; b: 质量分数 80%丙酮提取物 ; c: 质量分数
80%甲醇提取物 ; d: 水提取物 ; e: 空白
图 1 反应体系的荧光光谱
寄生叶提取物对· OH的清除能力 .
2. 2 不同寄主来源的红花寄生叶提取物清除羟自由基能
力比较
按 1. 2. 2所述的方法 , 分别测定了 5种寄主的红花寄生水
提取物、 甲醇提取物和丙酮提取物对· OH的清除作用 .
2. 2. 1 水提取物清除羟自由基的比较
不同质量浓度的红花寄生水提取物对· OH的清除率
结果见图 2. 图 2表明 , 在一定的质量浓度范围内 ( 0. 1~
0. 5 mg· m L- 1 ) , 不同寄主来源的红花寄生水提取物对
· OH的清除率均随质量浓度的增大而增大 ,但不同寄主间
有差异 , 在低质量浓度 (≤ 0. 2 mg· mL- 1 ) 条件下 , 5种
寄主植物间的清除能力相近 , 清除率 < 16. 5% ; 较高质量浓度 (≥ 0. 3 mg· m L- 1 )时 , 提取物对· OH
的清除能力随质量浓度的增加明显提高 ,当质量浓度为 0. 5 mg· mL- 1时 ,来源于长梗柳、女贞、石榴、
夹竹桃和荷花玉兰等 5种寄主上的红花寄生水提取物对· OH的清除率分别为 55. 41% , 50. 4% ,
44. 3% , 43. 5% , 38. 3% , 表明红花寄生水提取物清除羟自由基的能力较弱 .
2. 2. 2 甲醇提取物清除羟自由基的比较
不同质量浓度的红花寄生体积分数 80%甲醇提取物对· OH的清除率结果见图 3.图 3表明 , 5种
不同寄主植物来源的红花寄生甲醇提取物对· OH的清除能力亦表现出随质量浓度增大而增强的趋
势 .但不同寄主间的差异较大 ,如来源于夹竹桃、长梗柳和石榴等 3种植物的清除率在 0. 4 mg· mL- 1
时达最大 ,分别为 75. 8% , 71. 9% , 70. 5% ,而后有所下降 ,下降是由于高质量浓度时物质间协同促氧
化 ,亦或是其他原因仍有待分析 ;而来源于女贞、荷花玉兰的清除率则在实验质量浓度范围内 ( 0. 1~ 0. 5
mg· mL- 1 )未达最高水平.与水提物比较 ,体积分数 80%甲醇提取物清除· OH的作用明显高于水提取物.
图 2 不同寄主的红花寄生水
提取物对· OH的清除率
图 3 不同寄主的红花寄生甲醇
提取物对· OH的清除率
86 福 建 师 范 大 学 学 报 (自 然 科 学 版 )             2010年 
图 4 不同寄主的红花寄生丙酮
提取物对· OH的清除率
2. 2. 3 丙酮提取物清除羟自由基的比较
不同质量浓度的红花寄生 80%丙酮提取物对
· OH的清除率结果见图 4.图 4表明 , 5种不同寄主
植物来源的红花寄生丙酮提取物对· OH的清除效
果与甲醇提取物相近 , 如寄主为夹竹桃和长梗柳在
0. 4 mg· mL- 1时对· OH的清除率达到最大 , 分别
为 69. 0%和 68. 1% , 而后又有所下降 ; 来源于女贞
和荷花玉兰的红花寄生丙酮提取物对· OH的清除
率亦随质量浓度的增大而增大 ,且未达最高水平 .但
石榴上寄生的红花寄生丙酮提取物则表现出很强的
清除能力 , 在 0. 5mg· mL- 1时 ,清除率为 83. 1% ,显著高于其余 4种寄主植物来源的 ;与水提物相比 ,
80%丙酮提取物和 80%甲醇提取物两者对清除· OH的效果相当 , 均高于水提取物 .
2. 2. 4 不同寄主来源的红花寄生叶提取物对· OH清除能力的比较
为更好地说明不同寄主来源的红花寄生提取物对· OH清除能力 ,以半清除率质量浓度 (dEC50 ) ,即
· OH清除率为 50%时样品的质量浓度 , 比较其清除· OH能力的强弱 . dEC50越小 , 表明清除· OH的
能力越强 [7 ] . 将不同质量浓度提取物对· OH的清除率进行多项式曲线拟合 , 据此计算出所测样品的
dEC50 (见表 2) .表 2可知 ,不同寄主来源的红花寄生 3种溶剂提取物的dEC50在 0. 220~ 0. 666 mg· mL- 1
间 , 其中甲醇和丙酮提取物的dEC50较为接近 , 且比水提取物低 , 表明体积分数 80%甲醇和体积分数
80%丙酮提取物清除· OH能力较强 . 若以体积分数 80%甲醇提取物的dEC50作为判断标准 , 5种不同
寄主植物来源红花寄生清除· OH的能力大小顺序为: 长梗柳> 石榴> 夹竹桃> 荷花玉兰> 女贞 .
2. 3 羟自由基清除能力与酚性物质间的相关性分析
不少研究显示植物提取物中普遍存在酚性物质 , 它们是植物抗氧化活性和自由基清除能力的作用
成分 , 且酚性物质质量分数与活性两者之间有一定的相关性 [12- 14 ] . 为此 , 采用 Fo lin-Ciocal teu试剂比
色法和 AlCl3显色法分别测定了不同寄主来源的红花寄生提取物中总酚和总黄酮含量 , 结果见表 2.
表 2 不同寄主来源的红花寄生叶提取物中总酚、 总黄酮含量及 ρEC50
寄主树种 样品 k(总酚 ) /( mg g- 1 ) k(总黄酮 ) /( mg g- 1 ) dEC50 /( mg m L- 1 )
夹竹桃
(Nerium indicum )
水提取物 104. 7± 3. 8 50. 3± 3. 3 0. 569
甲醇提取物 206. 4± 13. 3 112. 1± 7. 5 0. 272
丙酮提取物 178. 6± 9. 3 116. 1± 1. 7 0. 292
女贞
(L igustrum lucidum )
水提取物 143. 3± 3. 6 62. 7± 1. 1 0. 464
甲醇提取物 201. 2± 11. 4 120. 7± 3. 2 0. 355
丙酮提取物 200. 5± 10. 6 119. 3± 5. 8 0. 427
石榴
(Punica granatum )
水提取物 85. 8± 11. 8 66. 4± 0. 7 0. 666
甲醇提取物 196. 1± 11. 7 136. 8± 4. 8 0. 264
丙酮提取物 247. 5± 17. 9 125. 7± 1. 3 0. 269
荷花玉兰
(Magnolia grandif lora )
水提取物 152. 2± 9. 7 70. 8± 1. 6 0. 529
甲醇提取物 164. 0± 15. 7 119. 4± 3. 8 0. 350
丙酮提取物 253. 7± 12. 2 106. 2± 4. 0 0. 371
长梗柳
( Salix dunnii )
水提取物 156. 1± 5. 6 70. 1± 1. 1 0. 464
甲醇提取物 224. 4± 5. 8 104. 3± 0. 8 0. 220
丙酮提取物 271. 4± 9. 2 107. 6± 2. 9 0. 233
    注: 表中测定数据均为平均值±标准偏差 (n = 3) , 半清除率质量浓度 ( dEC50 ) 由统计软件 Origin8. 0计算得出
表 2表明 ,不同寄主来源的叶提取物中总酚为 85. 8~ 271. 4 mg· g- 1 ,其中来源于长梗柳的红花寄
生丙酮提取物中总酚含量最高 ,达 271. 4 mg· g- 1 ,而石榴上寄生的水提取物则最低 ,仅 85. 8 mg· g- 1 ,
相差 3倍 ; 不同寄主来源的红花寄生提取物中总酚的均值为 185. 7 mg· g- 1 .不同寄主来源的红花寄生
提取物中总黄酮为 50. 3~ 136. 8 mg· g- 1 ,其中来源于石榴的红花寄生甲醇提取物中总黄酮含量最高 ,
达 136. 8 mg· g- 1 , 而夹竹桃上寄生的水提取物中最低 , 仅 50. 3 mg /g , 相差近 3倍 ; 不同寄主间总黄
87 第 4期        周冰洁等: 5种不同寄主来源的红花寄生叶提取物清除羟自由基的能力
酮均值为 99. 2 mg· g- 1 . 不同寄主来源及不同溶剂提取物的总酚和总黄酮含量均存在显著差异 , 其中
以体积分数 80%丙酮或体积分数 80%甲醇为溶剂获得的提取物中总酚和黄酮含量较水提取物高 ,就总
酚而言 , 体积分数 80%丙酮和体积分数 80%甲醇获得的提取物两者间差异较大 (女贞上寄生的除外 ) ,
但总黄酮两者间的差异则不显著 ( p > 0. 05) .
为探讨· OH清除能力与可能抗氧化作用成分之间的相关性 , 分别对总酚、 总黄酮含量与dEC50进
行线性回归 , 结果见图 5和图 6. 图 5, 图 6表明 , 红花寄生清除· OH的能力与总酚和总黄酮含量均
呈显著正相关 , 相关系数 R2分别为 0. 705, 0. 640; 酚类物质结构中的酚羟基可以作为 H或电子供体 ,
能有效清除活性氧自由基 , 酚类质量浓度的高低与其对氧自由基的清除能力强弱相关 .
图 5 总酚含量与· OH清除率的相关性 图 6 总黄酮含量与· OH清除率的相关性
3 讨论与结论
采用荧光法测定了 5种不同寄主来源的红花寄生溶剂提取物对· OH清除能力 , 结果表明红花寄
生提取物具有清除· OH的能力 ,但清除效果受提取溶剂和不同寄主植物来源的影响显著 . 3种溶剂提
取中 , 以体积分数 80%丙酮或体积分数 80%甲醇为溶剂获得的提取物 , 其清除· OH能力较水提取物
强 , 主要由于提取剂的极性不同 ,所溶解的抗氧化物质的种类或含量不同所致 ,具有· OH清除能力的
酚性物质易溶于丙酮 -水或甲醇 -水溶液 ,因此 ,提取酚性物质时应选择丙酮 -水或甲醇 -水溶液作为合适
的提取剂 .该结果也得到他人研究的证实 [14- 15 ] ,如陆健等发现体积分数 80%丙酮是大麦多酚提取的最
合适溶剂 , 且以丙酮为溶剂提取物的 DPPH清除能力较高 [ 14] . Kumar等对一种食用藻类 Kappaphycus
进行抗氧化研究 , 发现甲醇和乙醇提取物的清除 DPPH自由基效果等优于乙酸乙酯提取物和水提取
物 [15 ] .
红花寄生是一种半寄生性植物 , 不同寄主植物来源的红花寄生提取物对· OH的清除能力存在显
著不同 , 且与寄主植物密切相关 , 主要是由于寄生于不同寄主植物之上 , 红花寄生产生的次生代谢产
物 (酚性物质 ) 总量不同 , 也不排除寄生植物和寄主之间有抗氧化物质的交流所致 . 因此 , 红花寄生
的原料来源 (采集 ) 时应关注其寄主植物带来的影响 . 此外 , 红花寄生的抗肿瘤活性研究也可得到类
似的结果 ,肖义军等 [4 ]研究表明不同寄主红花寄生总黄酮的抗肿瘤活性显著不同 .半寄生性植物的有效
成分及其活性受寄主的影响可能是一种普遍现象 . Osadebe等 [ 16]研究了分布于非洲尼日利亚 , 来源于
5种不同寄主植物的同科桑寄生属 Loranthus micranthus叶甲醇提取物对小鼠的抗糖尿病活性 ,结果表
明其降血糖效果与寄主相关 , 不同寄主来源的提取物降血糖效果不同 , 其中寄主是 Kola acuminata、
Azadirchta indica的效果较好 . Oluw aseun等 [17 ]报道了同科槲寄生 (Viscum album ) 提取物中多酚含
量及其清除 DPPH· 、螯合铁能力与寄主植物相关 .红花寄生提取物清除羟自由基能力强弱与可能抗氧
化作用成分的含量相关 , 总酚和总黄酮含量与样品· OH的 50%清除率质量浓度 ( dEC50 ) 呈显著正相
关 , 相关系数 R2分别为 0. 705、 0. 640, 但相关性系数总酚高于总黄酮 . 表明酚性物质参与了红花寄生
清除羟自由基的抗氧化反应 ,本研究结果支持前人的研究 .曾佑炜等 [12 ]比较研究了 45种花卉粗提液清
除自由基的能力 ,发现不同花卉粗提液对 DPPH·的清除能力与多酚含量呈显著正相关 (r = 0. 880) ,
但与黄酮含量不呈明显相关关系 (r = 0. 367) . Cai等 [13 ]采用 TEAC法测定了 112种传统抗癌中草药
总抗氧化能力与其酚性物质含量 , 结果显示甲醇提取物的总抗氧化能力 ( TEAC值 ) 与总酚含量呈显
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著正相关 ( R2≥ 0. 95) . 不过 , 除黄酮、 多酚外 , 提取物中其他成分 (如多糖等 ) 也可能对羟自由基
清除能力有贡献 , 这些物质亦可能协同多酚物质参与了清除羟自由基反应 , 何书英等报道 [18 ]山药多糖
有清除· OH的作用 . 而本实验提取物中多糖是否对其清除羟自由基能力 (抗氧化性 )有贡献 , 尚待进
一步研究 .
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(责任编辑: 余 望 )
89 第 4期        周冰洁等: 5种不同寄主来源的红花寄生叶提取物清除羟自由基的能力