全 文 ：响应面设计法优化止泻木子总生物碱的提取工艺
陈效威，杨中铎*，孙建慧，赵俊文，朱保应
（兰州理工大学生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730050）1

摘 要：本文对止泻木子中总生物碱的提取工艺进行优化。在单因素试验的基础上，通过四因素三水平进行响应
面设计试验，以总生物碱得率为响应值进行响应面分析，优化总生物碱的提取工艺参数。结果表明各因素对止泻
木子中总生物碱提取得率的影响顺序依次为：提取温度＞乙醇浓度＞提取时间＞料液比。止泻木子中生物碱的最
佳提取工艺为乙醇浓度85 %、提取时间3 h、料液比1:10、提取温度80 ℃。此条件下，止泻木子中总生物碱的含
量为2.38±0.12 mg/g。此方法可靠，提取率高，适于止泻木中的总生物碱提取。
关键词: 止泻木；响应面；总生物碱；提取
中图分类号: R914.1 文献标志码: A

Optimization of Extraction Process for Total Alkaloids from
Holarrhena antidysenteriaca by Response Surface Methodology
CHEN Xiao-wei, YANG Zhong-duo*, SUN Jian-hui, ZHAO Jun-wen,ZHU Bao-ying
(School of Life Science and Engineering, Lanzhou University of Technology,Lanzhou 730050,China)

Abstract:The extraction of total alkaloids from Holarrhena antidysenteriaca was optimized.One-factor-at-a-time design
was employed to identify four main process parameters．The selected variables were optimized by response surface
analysis based on the extraction yield of total alkaloids．The results showed that the effect of the investigated factors on
the total alkaloids extraction yield was in the order as: extraction temperature>ethanol concentration>extraction time>
matedal-to-solven ratio.The optimal extraction parameters were 85 % ethanol and subsequent extraction at 80 for ℃ 3
h with a matedal-to-solven ratio 1:10 g/mL．The extraction yield of total alkaloids obtained was 2.38±0.12 mg/g under
these conditions．This described method is reliable．highly extraction and suitable for the extraction of total alkaloids from
Holarrhena antidysenteriaca. The total alkaloid is an important active substance Holarrhena antidysenteriaca, and its
extraction technology has laid a foundation for the further study of the active substances of Dioscorea opposita.
Key words: Holarrhena antidysenteriaca；Response surface；Alkaloids；Extraction
止泻木（Holarrhena antidysenterica Wall. ex A. DC.）藏名：毒毛妞。属于夹竹桃科夹竹桃亚科。
主要分布在云南西双版纳、广东、台湾以及印度等亚洲南部的一些国家，喜好海拔 1000 m 以下
的山地疏林或密林水沟地带[1]。在我国，止泻木生长在青藏高原、内蒙古和新疆等地区。性味苦，
性凉，其药理活性广泛，包括清热解毒，清血热，利胆，止泻，镇痛等；可治疗肝胆病，胃肠热
病，腹泻，痢疾等[2-4]。止泻木子中含有锥丝碱(conessine)、降锥丝碱（norconessine）、锥丝明
（conessimine）、异锥丝明（isoconessimine）、止泻木明（holarrhimine）、止泻木碱（holarrhine）、
                                                              
基金项目：国家自然科学基金项目（No. 21262022），兰州市科技局医药专项（No.2014-1-151），甘肃省科技厅
科技支撑计划项目（No. 1604FKCA084）。
作者简介：陈效威（1989-），男（汉族），硕士研究生，从事天然药物化学，  E-mail: chenxw8912@.126.com。   
通讯作者：杨中铎（1976-），男（汉族），博士，教授，从事天然药物化学， E-mail: yangzhongduo@126.com。 
网络出版时间：2017-01-17 13:24:42
网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1759.TS.20170117.1324.016.html
锥丝亚胺（coni-mine）等生物碱[5]。这些生物碱具有杀原虫的作用，对于治疗阿米巴性痢疾、杀
阿米巴原虫效果非常明显；其次对心血管系统的作用，能抑制心脏。其他作用包括具局麻作用以
及抑制消化酶的分泌等药用价值[6‐8]。
但现有文献对止泻木子中总生物碱的提取工艺优化研究鲜有报道。鉴此，本研究以止泻木子为
原料，运用Design-Expert8.0软件响应面设计试验优化其总生物碱的提取工艺[9-10]，确定其止泻木子
生物碱提取的最佳工艺，并利用最佳提取方法大量提取止泻木子生物碱。以期为止泻木植物的综合
利用及从止泻木子中获得高活性的乙酰胆碱酯酶抑制剂生物碱衍生物进一步研究奠定基础[11]。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
药材止泻木干燥种子10 kg 购买于青海省西宁市八一中路90号药材市场，由兰州理工大学生命
科学与工程学院植物分类专业的杨林副教授鉴定。甲醇、氯仿、丙酮等常用试剂 均为分析纯；乙
醇 工业试剂，甲基红 购自于阿拉丁试剂上海晶纯生化科技股份有限公司；硫酸、盐酸、氢氧化
钠 购自于上海化学试剂厂；邻苯二甲酸氢钾 购于成都化学试剂厂。                                                                         
AB-105电子天平 Mettler Toledo Group；HH-2数显恒温水浴锅 江苏省金坛市荣华仪器制造有
限公司；DFT系列手提式高速粉碎机 上海隆拓仪器设备有限公司；SHB-IIIA循环水式多用真空泵
长城科工贸有限公司；RE-52CS型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；DL-3005低温循环水浴 江
苏金坛市医疗器械厂；KQ-250 DE型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司； 
1.2 实验方法
1.2.1 止泻木子总生物碱的提取 取一定量止泻木子粉碎并过 60 目筛，准确称取止泻木子粉末 5
g 装入 250 mL 圆底烧瓶中，然后用 50 mL 90 %乙醇 80 ℃回流提取 3 h，过滤并浓缩。将所得固
形物用水溶解，然后转入 1 L 烧杯中，用 4 mol/L HCl 调 pH 至 2，静止过夜后过滤，将滤液再用
4 mol/L NaOH 调 pH 至 11 并转入分液漏斗中，然后再用等体积的氯仿萃取 3 次，减压浓缩，得
止泻木子总生物碱。
1.2.2 总生物碱的测定方法 总生物碱加中性乙醇 5 mL 溶解，再精密加入 15 mL 标准硫酸滴定
液(0.01 mol/mL)，水 15 mL 及甲基红指示液 2 滴，摇匀，以 0.02 mol/L 标准氢氧化钠滴定液回滴，
滴定终点溶液由红色变黄色，求出每份样品消耗的硫酸滴定液的量，通过硫酸消耗量评价提取效
果，此方法所消耗硫酸量越多表示生物碱含量越多[12]。
1.2.3 提取工艺单因素实验 采用 1.2.1 下提取止泻木子总生物碱的方法。固定 1.2.1 其他条件，
分别考察乙醇浓度（55、65、75、85、95 ％）、提取温度（50、60、70、80、90 ℃）、提取时
间（1、2、3、4、5 h）、料液比（1:5、1:10、1:15、1:20、1:25 g/mL），对硫酸消耗量的影响。
1.2.4 响应面设计实验 根据单因素的试验结果和 Box-Behnken 试验设计原理，选取影响止泻木
子中总生物碱提取效果的主要因素乙醇浓度、提取时间、料液比、提取温度，对这四因素三水平
进行响应面设计试验，以硫酸的消耗量为响应值，各因素的三水平采用-1、0、1 进行编码，如表
1。
表 1 响应面设计水平和编码
Table 1 Independent variables and their levels used in the Response surface design
因素 水平
-1 0 1
A-乙醇浓度（%） 75 85 95
B-料液比（g/mL） 1:20 1:15 1:10
C-提取温度（℃） 70 80 90
D-提取时间（h） 2 3 4
1.3 数据处理
          实验数据以x±s 表示，采用 Origin7.5 软件作图，Design-Exper8.0 软件进行方差分析。 
2 结果与分析
2.1 单因素试验
2.1.1 乙醇浓度对生物碱提取的影响 由图1可知，随着乙醇浓度的增高总生物碱的提取量也在逐
步增大，但是在乙醇浓度在85 %时生物碱提取量开始下降，当乙醇浓度超过90 %以上水溶性杂质如
多糖、蛋白质提出，会干扰生物碱的提取，这就会使提取效果下降[13]。故将提取的乙醇浓度定为85 %
左右。
55% 65% 75% 85% 95%
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
2.2
2.4
2.6
硫
酸
消
耗
量
/ m
L
乙醇浓度/%  
图 1. 乙醇浓度对总生物碱提取效果的影响
Fig.1 Effect of Ethanol concentration on the extraction
efficiency of total alkaloids
2.1.2 料液比对生物碱提取的影响 由图2可知，随着料液比的增大生物碱的含量逐步升高，但是
当料液比为1:10 g/mL时止泻木子中的生物碱基本溶出，再增加溶剂的量，无明显变化，还会给后续
的工艺增加困难，通过对实际生产效益和节省原料考虑，将料液比1:10 g/mL确定为提取条件。
1:5 1:10 1:15 1:20
1.7
1.8
1.9
2.0
2.1
2.2
2.3
硫
酸
消
耗
量
/ m
L
料液比/g/mL  
图 2 料液比对总生物碱提取效果的影响
Fig.2 Effect of ratio of matedal-to-solven on the extraction
efficiency of total alkaloids
2.1.3 提取时间对生物碱提取的影响 由图可3知，在0-2 h范围内，随着时间的增长生物碱的提取
率加大，这可能是因为延长提取时间有利于药材粉末和提取溶剂的充分接触，但是到2 h后提取率增
加缓慢，这可能是因为时间过短，生物碱还未充分溶出，若时间继续延长时，提取液内的有效成分
溶解已达到平衡，提取率不会再加大，故提取时间为2 h左右。
1h 1.5h 2.0h 2.5h 3h
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
硫
酸
消
耗
量
/m
L
提取时间/h  
图 3 提取时间对总生物碱提取效果的影响
Fig.3 Effect of extraction time on the extraction
efficiency of total alkaloids
2.1.4 提取温度对生物碱提取的影响 由图4可知，随着提取温度的增高，生物碱的提取率也随之
增大，这是因为温度的升高，液体黏度下降，分子运动加快，加快溶质的扩散和溶剂的渗透，有利
于生物碱的溶出，当温度为超过80 ℃时提取率又开始逐渐下降，因此，将提取温度定为80 ℃左右。
50 60 70 80 90
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
2.2
2.4
2.6
硫
酸
消
耗
量
/m
L
提取温度/℃  
图 4. 提取温度对总生物碱提取效果的影响 
Fig.4 Effect of extraction temperature on the extraction
efficiency of total alkaloids
2.2 响应面实验结果分析
2.2.1 模型的建立及显著性实验
表 2 止泻木子生物碱响应面分析方案及实验结果
Table 2 Response surface design matrix with experimental and predicted
values of total alkaloid content of Holarrhena antidysenteriaca
试验号
因素
H2SO4
消耗量/mL A乙醇浓度
（%）
B料液比
（g/mL）
C提取温度
（℃）
D提取时间
（h）
1 -1 0 0 -1 1.06
2 1 0 0 1 2.72
3 -1 0 0 -1 1.03
4 1 0 0 1 2.53
5 0 -1 -1 0 0.6
6 0 1 -1 0 1.97
7 0 -1 1 0 2.52
8 0 1 1 0 1.58
9 -1 0 0 0 0.5
10 1 0 0 0 1.86
11 -1 0 1 0 2.24
12 0 0 1 0 2.04
13 0 1 1 0 1.54
14 0 -1 0 1 1.78
15 0 1 0 -1 1.26
16 0 1 0 1 2.63
17 -1 -1 0 0 1.03
18 1 0 1 0 2.34
19 -1 1 0 0 1.44
20 1 1 0 0 2.42
21 0 0 -1 -1 1.42
22 0 0 -1 1 1.8
23 0 0 1 -1 1.25
24 0 0 1 1 2.52
25 0 0 0 0 2.68
26 0 0 0 0 2.61
27 0 0 0 0 2.82
28 0 0 0 0 2.69
29 0 0 0 0 2.39

表 3 回归统计分析表
Table 3 ANOVA for the response surface regression model
系数来源 平方和
自由
度
均方 F值 P值 显著性
Model 12.81 14 0.91 23.37 < 0.0001 显著
A-乙醇浓度 1.34 1 1.34 34.23 < 0.0001 **
B-料液比 0.19 1 0.19 4.77 0.0465 *
C-提取温度 1.62 1 1.62 41.29 < 0.0001 **
D-提取时间 1.27 1 1.27 32.40 < 0.0001 **
AB 2.203×104 1 2.203×104 5.629×103 0.9413
AC 0.52 1 0.52 13.35 0.0026 **
AD 1.865×104 1 1.865×104 4.765×103 0.9459
BC 1.61 1 1.61 41.17 < 0.0001 **
BD 0.22 1 0.22 5.50 0.0342 *
CD 0.20 1 0.20 5.06 0.0411 *
A2 0.75 1 0.75 19.04 0.0006 **
B2 1.06 1 1.06 26.97 0.0001 **
C2 1.34 1 1.34 34.24 < 0.0001 **
D2 0.47 1 0.47 12.13 0.0037 **
残差 0.55 14 0.039
失拟项 0.38 6 0.064 3.12 0.0702 不显著
净误差 0.16 8 0.021
总离差 13.35 28
调整相关系数
RAdj

0.9179


注:      ** P<0.01差异极显著；*P<0.05差异显著。 
根据表2的结果，Design-Exper8.0软件对表3中的实验数据进行多元化拟合回归，得回归方程：
Y =+2.62+0.40 A+0.16 B+0.35C+0.41 D+0.016AB-0.33AC+0.011AD-0.59BC+0.27BD+0.22CD-0.43A2
-0.47B2-0.49C2-0.37D2。模型系数显著性结果和方差分析结果见表3。
表2的数据可知，该模型极显著(P<0.0001),模型的相关系数R2=0.9590，调整相关系RAdj=0.9179，
模型失拟项P=0.0702>0.05不显著，说明该模型显著，本实验所得的二次回归方程能很好地对响应值
进行预测，拟合度好。从表3可以看出，一次项A，C，D交互项AC，BC二次项A2，B2，C2，D2表
现为极为显著；一次项B，交互项CD，BD表现为显著；AB,AD表现为不显著。比较各因素的F值，
可得出各因素多试验结果的影响的大小顺序C>A>D>B，提取温度＞乙醇浓度＞提取时间＞料液比。
2.2.2 响应面图分析 利用 Design-Exper8.0 软件对表 3 数据进行二次回归多元拟合，所得到的
二次回归方程的响应面图如下：

 
 
图 5 两因素交互作用对止泻木总生物碱得率影响的响应面图
Fig.5 Response surface plots for the effects of process paranleters on the extraction
efficiency oftotal alkaloids from Holarrhena antidysenteriaca
该图形直观地给出了各因素交互作用响应面的3维图，从响应面的最高点可以看出，在所选范
围内存在极值。从响应面曲面坡度的陡峭程度和等高线图可以看出因素间交互作用的强弱和因素对
响应值的影响程度。图5表明BD提取时间和液料比的交互作用、DC提取时间和提取温度的交互作用、
AC乙醇浓度和提取温度的交互作用、BC液料比和提取温度的交互作用较显著。以图5提取时间和液
料比的交互作用为例说明，在乙醇浓度3.41 h、液料比1:10.16 g/mL的条件下，止泻木子中总生物碱
含量随提取温度的增加先增加后减小，亦随乙醇浓度的增大先增加后减小。其他各图依此分析，其
分析结果与单因素试验结果基本一致。
2.2.3 提取最佳工艺优化 由 Design. Exper 8.0 软件分析得到止泻木子中总生物碱最佳提取工艺
条件。最佳工艺条件为乙醇浓度 85.04%、提取时间 3.41 h、液料比 1:10.16 g/mL、提取温度 80.35 ℃，
在此条件下提取总生物碱，硫酸消耗量为 2.71 mL，总生物的含量可达 2.35 mg/g。进行验证实验，
乙醇浓度 85 %、提取时间 3 h、液料比 1:10 g/mL、提取温度 80 ℃，此条件下，止泻木子中总生
物碱的含量为 2.38±0.12 mg/g。

结论
综合单因素和响应面设计试验的结果，得出止泻木子中总生物碱的最佳提取工艺为药材粉碎粒
度60目，乙醇浓度85 %、提取时间3 h、液料比1:10 g/mL、提取温度80 ℃，此条件下，得止泻木子
中总生物碱含量为2.38±0.12 mg/g 。用响应面对止泻木子中总生物碱提取工艺进行优化，科学合理，
准确可靠，而且总生物碱是止泻木子中重要的功效物质，其提取工艺为止泻木子各功效物质的进一
步研究奠定了基础。

参考文献
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