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红河红茄中总黄酮的提取及抑菌作用



全 文 :张 虹,黄文莉,张淑梅,等. 红河红茄中总黄酮的提取及抑菌作用[J]. 江苏农业科学,2016,44(9) :287 - 290.
doi:10. 15889 / j. issn. 1002 - 1302. 2016. 09. 082
红河红茄中总黄酮的提取及抑菌作用
张 虹1,黄文莉1,张淑梅1,3,李春燕1,袁 寒1,白红丽2,郭俊明2
(1.红河学院生命科学与技术学院 /云南省高校农作物优质高效栽培与安全控制重点实验室,云南蒙自 661100;
2.云南民族大学民族药资源化学国家民委 -教育部重点实验室,云南昆明 650500;3.云南大学生命科学院,云南昆明 650091)
摘要:以红茄为材料,乙醇为提取剂浸提,采用正交试验对红茄总黄酮提取条件乙醇浓度、提取温度、提取时间进
行优化,用紫外分光光度法进行红茄中总黄酮的测定,并研究其抑菌作用。结果表明红茄中总黄酮最佳提取条件为乙
醇浓度(体积分数)60%、提取温度 80 ℃、提取时间 1 h。在此条件下红茄中总黄酮的提取率最高,为 1. 50%,RSD 为
1. 02%。红茄总黄酮提取液对肠球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌都有一定抑制作用,对肠球菌和大肠杆菌的抑制效果
较好,而对枯草芽孢杆菌的抑制效果较差。
关键词:红茄;总黄酮;提取;抑菌作用
中图分类号:R284. 2 文献标志码:A 文章编号:1002 - 1302(2016)09 - 0287 - 03
收稿日期:2015 - 07 - 26
基金项目:国家民族事务委员会教育部共建民族药资源化学重点实
验室开放基金项目(编号:MZY1405)。
作者简介:张 虹(1962—) ,女,云南昆明人,教授,从事生物技术研
究。E - mail:zh_biology2@ 126. com。
通信作者:郭俊明,硕士,教授,从事无机非金属及生物化学的研究。
红茄(Solanum integrifolium Poir.) ,别称扁果苦子、大苦
子[1],云南蒙自地区也称苦茄,茄科,一年生草本植物,果实
扁圆,上有 4 ~ 6 个浅棱,每棱上常有 1 浅沟,成熟果实橙黄
色、红色。红茄果实为野生苦味蔬菜,具有清热解毒功
能[1 - 2]。目前已从野生到少量栽培,红茄颇受蒙自地区人民
的青睐,形成了具有当地特色的食用方法,可用来切片炒食或
烧后作为“蘸水”调料。
黄酮类化合物是广泛存在于植物中的一类化合物,在蔬
菜、作物、水果等植物中均有分布,黄酮类化合物具有保护心脑
血管、清除自由基、抗氧化、抗肿瘤、抗病毒的作用[3 -6]。黄酮
类化合物呈酸性,能使蛋白质凝固或变性,以影响细胞膜的透
性,导致微生物细胞吸收营养、核苷酸合成及 ATP活性等功能
障碍,从而抑制微生物的生长,产生杀菌和抑菌作用[7 -8]。
本试验以红茄的果实为研究对象,采用不同的乙醇浓度、
提取温度和提取时间对红茄中总黄酮进行水浴加热浸提,用
紫外分光光度法进行测定,并对其抑菌作用进行研究,为苦味
野生蔬菜资源的开发和利用提供参考。
1 材料与方法
1. 1 材料与试剂
1. 1. 1 材料 新鲜的红茄果实购于云南省红河州蒙自集市。
1. 1. 2 试剂 芸香苷标准品、乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧
化钠、浓盐酸、氯化铝、锌粉、三氯化铁,均为分析纯。琼脂粉、
蛋白胨(生化试剂)、牛肉膏(生化试剂)。
1. 1. 3 供试菌株 大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆
菌(Bacillus subtilis)、肠球菌(Enterococcus faecalis) ,供试菌种
均由红河学院生命科学与技术学院实验室提供。
1. 1. 3 仪器 紫外分光光度仪(UV - 4802S 型,上海尤尼柯
仪器有限公司)、真空干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)、
电热恒温水浴锅(HWS - 24,上海一恒科学仪器有限公司)、
电子分析天平(BSA224S型,赛多利斯科学仪器有限公司)。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 原材料处理 将新鲜的红茄果实洗净、切片,在 80 ℃
条件下烘干,高速粉碎机粉碎,备用。
1. 2. 2 标准曲线的制备 准确称取干燥的芸香苷标准品
10 mg,置 50 mL容量瓶中,加入适量 60%(体积分数,下同)
的乙醇溶解(60 ℃) ,再用 60%的乙醇定容至刻度,摇匀,得
到浓度为0. 20 mg /mL 的标准品溶液,备用。
准确移取标准品溶液 0、1. 0、2. 0、3. 0、4. 0、5. 0 mL 置于
25 mL 容量瓶中,加入 5%的 NaNO2 溶液 1. 0 mL,摇匀,放置
6 min后加入 10%的 Al(NO3)3溶液 1. 0 mL,摇匀,放置 6 min
后加入 4%的 NaOH溶液 10 mL,摇匀,用 60%的乙醇定容,静
置 15 min,同时以试剂空白作参比。在波长 510 nm处测定溶
液的吸光度[9]。
以吸光度(D)为纵坐标,浓度(C)为横坐标,绘制标准曲
线,得线性回归方程:D = 10. 796C - 0. 001 1,r = 0. 999 9。
1. 2. 3 红茄总黄酮的提取
1. 2. 3. 1 单因素试验 采用恒温水浴加热的提取方法,分别
以提取温度、乙醇浓度、提取时间为影响因素,设置 3 个因素
水平,确定相关因素对红茄提取液总黄酮的影响。
1. 2. 3. 2 正交设计提取因素水平 根据单因素试验结果,采
用正交设计方案进一步考察乙醇浓度、提取时间和提取温度
3 个因素对总黄酮提取的影响,以确定红茄中总黄酮提取的
最佳条件。每个因素选择 3 个水平进行正交试验(表 1)。
称取制备好的红茄粉末 2 g,分别置于带塞三角瓶中,各
加入 20 mL乙醇,按表 1 因素水平进行提取。提取后过滤,用
相应浓度乙醇溶液将滤液定容至 25 mL 容量瓶中,为样品提
取液。
1. 2. 4 总黄酮含量的测定 准确吸取样品提取液2 mL,置
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表 1 红茄总黄酮提取试验因素水平
水平
试验因素
A:乙醇浓度(%) B:提取温度(℃) C:提取时间(h)
1 60 60 1. 0
2 70 70 1. 5
3 95 80 2. 0
于 25 mL容量瓶中,按“1. 2. 2”节方法操作,在 510 nm波长处
平行测定 3 次,同时以样品空白作参比。根据回归方程计算
总黄酮含量,总黄酮提取率 =[提取液浓度 ×稀释倍数 ×体
积 /样品干重 × 1 000]× 100%[10]。
1. 3 红茄总黄酮提取液抑菌方法
1. 3. 1 菌种的活化 在无菌条件下将大肠杆菌、枯草芽孢杆
菌、肠球菌的菌种分别接种在新鲜的培养基中,置于 37 ℃恒
温箱中培养 24 h,进行菌种活化,取第 2 代备用。
1. 3. 2 菌悬液的制备 在大肠杆菌、肠球菌、枯草芽孢杆菌
的试管斜面培养基上取活化好的少许菌株,用无菌水洗脱,配
制成含菌数约为 108 个 /mL的菌悬液备用。
1. 3. 3 抑菌圈直径的测定[11 - 12] 在无菌条件下,用已灭菌
的滤纸片(直径 6 mm)浸入总黄酮提取率最高的 60%乙醇浓
度红茄总黄酮提取液中,充分浸泡后放在 37 ℃干燥箱中烘干
制成饱和的药敏纸片,备用。将灭菌后的培养基倒入无菌培
养皿中,每皿 15 mL,冷却凝固后,用无菌微量注射器取配制
好的大肠杆菌、肠球菌、枯草芽孢杆菌的菌悬液各 0. 1 mL 涂
布到培养基平板中,将饱和的药敏纸片贴在平板上,以 75%
乙醇和无菌水的滤纸片作为对照。于 37 ℃恒温培养箱中培
养 24 h,测量抑菌圈直径(d)的大小(mm) ,测 3 次求平均值。
1. 3. 4 红茄总黄酮粗提液用量对抑菌效果的测定 在无菌
条件下,向已灭菌的培养皿中分别加入 2、3、4、5、6 mL 60%乙
醇浓度红茄总黄酮提取液,然后倒入 15 mL已灭菌的培养基,
混匀、冷却凝固,用无菌移液管将 3 种菌悬液各加入 0. 1 mL,
用刮铲将菌悬液涂匀后,置于 37 ℃恒温培养箱中培养 24 h,
观察记录细菌生长情况,以得出适宜的总黄酮提取液的用量。
每个用量和菌种分别重复 3 次。
1. 3. 5 最低抑菌浓度(MIC)的测定 在无菌条件下,将
60%乙醇浓度红茄总黄酮提取液稀释成:100%、50%、25%、
12. 5%、6. 25%、3. 125%、1. 563%的不同浓度系列溶液,分别
加入 3 mL稀释好的不同浓度的红茄总黄酮提取液于无菌培
养皿中,然后倒入 15 mL培养基,混匀、冷却凝固后,用无菌微
量注射器加入 0. 1 mL菌悬液,用刮铲将菌液涂匀,置于 37 ℃
恒温培养箱中培养 24 h,观察记录细菌生长情况,每个浓度和
菌种分别重复 3 次。观察记录细菌生长情况,以无菌体生长
的浓度为最低抑菌浓度(MIC)。
2 结果与分析
2. 1 单因素试验结果
2. 2. 1 乙醇提取浓度对总黄酮提取率的影响 在温度
80 ℃、乙醇浓度 50%、60%、70%、80%、95% 时,水浴提取
1. 0 h,结果(图 1)表明乙醇浓度在 60%、70%、95%时,有较
高提取率,60%时总黄酮的提取率最高,70%、80%和 95%时
的提取率虽有下降,但差别不大。
2. 2. 2 温度对总黄酮提取率的影响 在乙醇浓度60%、温
度 50、60、70、80、90 ℃时,水浴提取 1. 0 h,结果(图 2)表明随
温度升高,总黄酮的提取率增高,在 80 ℃提取率最高,80 ℃
以后,提取率略有降低,这可能是因为温度太高,对黄酮类物
质会有一定的破坏[13]。
2. 2. 3 提取时间对总黄酮提取率的影响 在乙醇浓度
60%、温度 80 ℃,水浴提取 0. 5、1. 0、1. 5、2. 0、3. 0 h 的条件
下,对红茄总黄酮的提取结果(图 3)表明,在提取时间为
1. 0、1. 5、2. 0 h时,有较高总黄酮的提取率,在 1. 0 h 时最高;
超过 1. 0 h时,提取率略有下降,但变化幅度不大。
2. 2 红茄中总黄酮提取工艺正交结果
由表 2 得出红茄中总黄酮提取率最高的为 A1B3C3,即乙
醇浓度为 60%,提取温度为 80 ℃,提取时间为 2. 0 h,最高提
取率为 1. 43%。通过极差(R)分析,各因素对总黄酮提取率
的影响程度由大到小为 A > B > C;乙醇浓度对总黄酮的提取
率影响最大,提取温度影响次之,提取时间影响最小。极差分
析的最佳提取条件为 A1B3C1,综合考虑其他因素,确定红茄
的最优提取工艺为 A1B3C1,即乙醇浓度为 60%,提取温度为
80 ℃,提取时间为 1. 0 h。
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用正交优化的最佳试验条件,按“1. 2. 2”节方法操作进
行红茄中总黄酮的提取试验,做 3 次平行试验,红茄中总黄酮
提取率为 1. 50%、1. 51%、1. 50%,平均提取率为 1. 50%,
RSD为 1. 02%,该提取条件比较稳定、重现性好。
表 2 红茄中总黄酮提取工艺的正交试验结果
试管号
A:乙醇
浓度
B:提取
温度
C:提取
时间
总黄酮浓度
(mg /mL)
总黄酮提
取率(%)
1 1 1 1 0. 088 3 1. 38
2 1 2 2 0. 076 1 1. 19
3 1 3 3 0. 091 4 1. 43
4 2 1 1 0. 065 3 1. 02
5 2 2 2 0. 063 5 0. 99
6 2 3 3 0. 079 9 1. 25
7 3 1 1 0. 042 5 0. 66
8 3 2 2 0. 046 3 0. 72
9 3 3 3 0. 065 4 1. 02
K1 0. 255 8 0. 196 1 0. 214 5
K2 0. 208 7 0. 185 9 0. 206 5
K3 0. 154 2 0. 236 7 0. 197 4
k1 0. 085 3 0. 065 4 0. 071 5
k2 0. 069 6 0. 062 0 0. 068 8
k3 0. 051 4 0. 078 9 0. 065 8
R 0. 101 6 0. 050 8 0. 017 1
2. 3 重复性试验
在乙醇浓度为 60%,提取温度为 80 ℃,提取时间为
1. 0 h 的条件下,对红茄中总黄酮重复提取 3 次,按“1. 2. 2”
节方法操作,总黄酮的提取率平均为 1. 48%,RSD 值为
1. 10%,试验重复性良好。
2. 4 稳定性试验
准确吸取 2. 0 mL 60% 乙醇红茄中总黄酮提取液,按
“1. 2. 2”节方法操作,放置 1. 0 h,每隔 10 min 测定 1 次吸光
度,结果表明 1. 0 h内稳定性良好,RSD为 1. 03%。
2. 5 加标回收率试验
准确吸取 60%乙醇红茄总黄酮提取液 2. 0 mL置于 3 个
25. 0 mL容量瓶中,分别加入芸香苷标准品 0. 2 mg,余下部分
按“1. 2. 2”节方法操作,平行测定 5 次,计算加标回收率,其
平均回收率为 99. 2%,相对标准偏差 RSD 为 1. 17%,表明测
定结果准确可靠,符合测定要求。
2. 6 红茄总黄酮提取液抑菌效果
由表 3 可以看出,红茄总黄酮提取液对 3 种供试菌均有
抑制作用,对肠球菌的抑菌效果最好,其次为大肠杆菌,对枯
草芽孢杆菌的抑制效果较弱,红茄总黄酮提取液对 3 种菌的
抑制效果均好于对照 75%乙醇,无菌水无抑菌作用。
表 3 红茄总黄酮提取液的抑菌效果
试验菌
抑菌圈直径(mm)
红茄总黄酮提取液 75%乙醇 无菌水
肠球菌 7. 5 6. 4 ―
大肠杆菌 7. 4 6. 4 ―
枯草芽孢杆菌 7. 2 6. 4 ―
注:“―”表无抑菌圈。
2. 7 红茄黄酮粗提取液的用量对抑菌效果的影响
从表 4 可以看出,红茄总黄酮提取液的用量不同,抑菌效
果也不相同。用量为 2 mL时肠球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆
菌均有少量的菌体生长;当红茄总黄酮提取液用量为 3 mL以
上时,对 3 种菌均有明显的抑制作用,因此红茄总黄酮提取液
的用量选择 3 mL时为最佳的抑菌用量。
表 4 红茄黄酮粗提取液的用量的抑菌效果
试验菌
红茄总黄酮提取液的用量(mL)
2 3 4 5 6
肠球菌 + ― ― ― ―
大肠杆菌 ++ ― ― ― ―
枯草芽孢杆菌 ++ ― ― ― ―
注:“―”表示无菌生长;“ +”表示有少量菌体生长;“ ++”表示
有不超过 1 /2 平皿面积的菌落生长;“ +++”表示有超过 1 /2 平皿面
积的菌落生长。表 5 同。
2. 8 最低抑菌浓度(MIC)的测定
红茄总黄酮提取液对 3 种供试菌均有抑制作用,抑制作
用的强弱与浓度有关,随浓度的增加,抑菌效果增强,其中以
红茄总黄酮提取液 100% 原液的抑菌效果最好。3 种菌的
MIC值均为 100%原液,低于原液浓度的抑菌效果都较弱,尤
以红茄总黄酮提取液浓度为 3. 125%和 1. 526%时的抑菌效果
最差,红茄总黄酮提取液对肠球菌和大肠杆菌的抑制效果较
好,但二者差别不大,对枯草芽孢杆菌的抑制效果最差(表 5)。
表 5 红茄总黄酮提取液对试验菌的最低抑制浓度
试验菌
红茄总黄酮提取液浓度(%)
100 50 25 12. 5 6. 25 3. 125 1. 526
肠球菌 ― ― + ++ ++ +++ +++
大肠杆菌 ― + + ++ ++ +++ +++
枯草芽孢杆菌 ― ++ ++ +++ +++ +++ +++
3 结论与讨论
本试验结果表明:各因素对总黄酮提取率的影响程度由
大到小为乙醇浓度 >提取温度 >提取时间。正交试验极差分
析得出红茄中总黄酮提取的最佳工艺条件为:乙醇浓度
60%、提取温度 80 ℃、提取时间为 1 h,在此条件下提取红茄
总黄酮,总黄酮平均提取率为 1. 50%,RSD为 1. 02%。
红茄总黄酮提取液对肠球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌都
有一定的抑制效果,其抑菌作用的大小与浓度成正相关,以红
茄总黄酮提取液 100%原液的抑菌效果最好,对 3 种菌的抑
制效果为:对肠球菌和大肠杆菌的抑制效果较好,对枯草芽孢
杆菌抑制效果较弱。
有研究表明,黄酮类物质对枯草芽孢杆菌的抑制效果一
般好于大肠杆菌[14 - 17],主要是因为黄酮类物质的抑菌作用与
革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌细胞壁的组分和结构有
关,黄酮类物质对革兰氏阳性菌的抑制效果好于革兰氏阴性
菌,但本试验中对枯草芽孢杆菌的抑制效果略低于对革兰氏
阴性菌大肠杆菌的抑制效果,与前人研究有一定的差异。
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文 豪,周绪正,李 冰,等. 液相色谱 -串联质谱法测定羊肉中伊维菌素残留[J]. 江苏农业科学,2016,44(9) :290 - 292.
doi:10. 15889 / j. issn. 1002 - 1302. 2016. 09. 083
液相色谱 -串联质谱法测定羊肉中伊维菌素残留
文 豪,周绪正,李 冰,魏小娟,张继瑜
(中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所 /农业部兽用药物创制重点实验室,甘肃兰州 730050)
摘要:为建立以液相色谱 -串联质谱检测羊肉中伊维菌素的残留方法,所采用的主要仪器参数为:安捷伦 1200 -
6410 液质联用仪,ESI电离源,干燥气温度 250 ℃;安捷伦 ZORBAX Eclipse Plus C8 柱;流动相为乙腈 -含 0. 1%甲酸的
10 mmol /L 乙酸铵水溶液(体积比为 90 ∶ 10) ,流速 0. 2 mL /min。样品使用乙腈提取,使用碱性氧化铝固相萃取小柱
净化,在 10、20、40 μg /kg 的添加水平下,羊肌肉组织中伊维菌素的添加回收率为 87%、87%、89%,变异系数为
4. 01%、3. 48%、1. 14%,方法的定量限为 0. 5 μg /kg,该方法可用于检测羊肌肉组织中的伊维菌素的药物残留。
关键词:羊肉;伊维菌素;液相色谱 -串联质谱;残留
中图分类号:S852. 6 文献标志码:A 文章编号:1002 - 1302(2016)09 - 0290 - 03
收稿日期:2015 - 07 - 14
基金项目:国家现代农业肉牛牦牛产业技术体系建设专项(编号:
CARS - 38) ;传统中兽医药资源抢救和整理项目 (编号:
2013FY110600 - 8)。
作者简介:文 豪(1990—) ,男,硕士研究生,主要从事兽医药理学与
毒理学研究。E - mail:wh901226@ sina. com。
通信作者:张继瑜,博士,研究员,博士生导师,主要从事兽医药理与
毒理学研究。E - mail:infzjy@ sina. com。
阿维菌素类(AVMs)药物是由阿维链霉菌产生的一组高
效、广谱、安全的大环内酯类抗寄生虫药,国内外广泛应用于
包括猪、牛、羊等家畜在内的食品动物中,其中使用最广泛的
是伊维菌素[1]。伊维菌素是一种具有神经毒性的化合物,其
脂溶性较强,在动物组织中残留时间较长。当伊维菌素残留
过量时,可能会给食品安全带来隐患。欧盟、美国和中国等都
设定了最高残留限量(MRLs) ,欧盟伊维菌素的最高限量标
准是 15 μg /kg,美国和中国是 20 μg /kg[2 - 5]。羊肉营养价值
高,纤维细嫩,其所含的主要氨基酸的种类和数量能完全满足
人体的需要[6]。因此,随着社会经济的发展,人们出于饮食
营养和健康的考虑,肉食类食品结构也逐渐从快速生产的鸡
肉、猪肉转向味美、质优、安全、保健的羊肉,根据国家肉羊产
业技术研发中心调查,我国已是羊肉生产和消费大国,羊肉生
产已成为我国畜牧业发展的支柱产业[7]。目前,国内针对伊
维菌素的检测方法主要是参照国标 GB /T 21320—2007《动物
源食品中阿维菌素类药物残留量的测定》和 SN /T 1973—
2007《进出口食品中阿维菌素残留量的检测方法》,并没有专
门针对羊组织中伊维菌素残留检测的国家标准,所以对羊组
织中伊维菌素残留的检测方法进行研究很有必要。本研究应
用液相色谱 -串联质谱法(HPLC - MS /MS) ,成功建立了羊
肉与羊肝组织中伊维菌素残留的检测方法。
1 材料与方法
1. 1 仪器与试剂
安捷伦 1200 - 6410 液质联用仪,美国 Agilent 公司生产;
高速匀浆机,江苏省金坛市荣华仪器公司生产;KL512 型氮吹
仪,北京康林科技有限责任公司生产;湘仪离心机,湘仪公司
生产;涡旋振荡器(Heros BIO,RS - 2 Shaker) ;针筒式微孔滤
膜过滤器(0. 22 μm、有机系) ,天津津腾试验设备有限公司生
—092— 江苏农业科学 2016 年第 44 卷第 9 期